Ploretin potlačuje neurozánět autofagií zprostředkovanou aktivací Nrf2 v makrofázích

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní

Pozadí: Makrofágy hrají dvojí roli u neurozánětlivých poruch, jako je roztroušená skleróza (RS). Podílejí se na vzniku a progresi lézí, ale mohou také podporovat jejich vyřešenízáněta oprava poškozené tkáně. V této studii zkoumáme, zda a jakphloretinflavonoid hojně přítomný v jablkách a jahodách, snižuje zánětlivý fenotyp makrofágů a potlačujeneurozánět.

Metody: Transkripční změny v makrofázích pocházejících z myší kostní dřeně po expozici florretinu byly hodnoceny hromadným sekvenováním RNA. Základní dráhy související se zánětem, reakcí na oxidační stres a autofagií byly ověřeny pomocí kvantitativní PCR, fluorescenčních a absorbančních testů, knockout myší s nukleárním faktorem erytroidního 2-faktoru 2 (Nrf2), western blotu a imunofluorescence. Experimentální model autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) byl použit ke studiu vlivu floretinu na neurozánět in vivo a potvrzení základních mechanismů.

Výsledek: Ukazujeme, že phloretin snižuje zánětlivý fenotyp makrofágů a výrazně potlačuje neurozánět u EAE. Ploretin zprostředkovává svůj účinek aktivací signální dráhy Nr2. Aktivace Nrf2 byla přičítána aktivaci autofagie závislé na 5'AMP-aktivované proteinkináze (AMPK) a následné degradaci proteinu 1 (Keap1) asociovaného s ECH podobným Kelchovi.

Závěry: Tato studie otevírá budoucí perspektivy pro phloretin jako terapeutickou strategii pro neurozánětlivé poruchy, jako je RS.

Zkušební registrace: Nelze použít.

Klíčová slova: Floretin, Makrofágy, Neurozánět, Roztroušená skleróza, Autoimunita

Kliknutím sem získáte další informace

Pozadí

Aktivní léze roztroušené sklerózy (MS) jsou charakterizovány přítomností četnýchmakrofágy[1-5]. Časné studie prokázaly, že makrofágy přijímají prozánětlivý fenotyp v lézích RS, a tím podporujíneurozánětdemyelinizace a neurodegenerace. Efektorové funkce podporující onemocnění zahrnují prezentaci antigenů pocházejících z centrálního nervového systému (CNS) autoreaktivním T buňkám a produkci zánětlivých mediátorů, jako jsou prozánětlivé cytokiny, reaktivní formy kyslíku (ROS) a oxid dusnatý (NO)[ 6,7]. Nedávno bylo zjištěno, že makrofágy mají také prospěšné funkce v lézích MS, protože mohou přetvořit svůj fenotyp na fenotyp, který je typicky spojen s imunosupresí a opravou CNS. Tento ochranný fenotyp je charakterizován sníženou produkcí prozánětlivých mediátorů, produkcí protizánětlivých mediátorů a růstových faktorů a aktivací antioxidačních drah, jako je dráha nukleárního faktoru erytroidního 2-faktoru 2 (Nrf2) souvisejícího [8-14]. Vzhledem k tomu, že zánětlivý stav makrofágů je spojen s progresí RS a rozvojem chronických aktivních lézí, je řízení makrofágů k příznivému fenotypu považováno za slibnou strategii k omezení progrese RS [15].

Složky stravy řídí funkci makrofágů a neurozánět [16]. Zejména rodina flavonoidů se stále více uznává, že obsahuje slibné sloučeniny, které ovlivňují patogenní dráhy a modulují fenotyp imunitních buněk, jako jsou makrofágy [17,18]. Flavonoidy tvoří jednu z největších rodin fytonutrientů, která obsahuje více než 8000 fenolických sloučenin s různou bioaktivitou. Několik členů rodiny flavonoidů vykazuje protizánětlivé a antioxidační účinky na makrofágy [19-21]. Flavonoid phloretin je členem dihydrochalkonů a je přítomen v běžně konzumovaném ovoci, jako jsou jablka a jahody. Je známo, že Ploretin má imunomodulační vlastnosti a je široce používán v péči o pleť díky svým antioxidačním vlastnostem [22-24]. Kromě toho je floretin inhibitorem glukózového transportéru (GLUT), což je vlastnost, která ovlivňuje fenotyp makrofágů, protože aktivace makrofágů je poháněna GLUT [25, 26]. Celkově vzato, tyto vlastnosti činí z phloretinu slibnou sloučeninu pro modulaci fenotypu makrofágů a neurozánětu. V této studii ukazujeme, že phloretin pohání makrofágy směrem k méně zánětlivému fenotypu a zmírňuje neurozánět v modelu experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE). Sekvenování RNA a funkční experimenty identifikovaly dráhu Nrf2 jako centrum a hnací sílu tohoto ochranného makrofágového fenotypu indukovaného floretinem. Bylo zjištěno, že aktivace autofagického aparátu závislá na AMPK a následná SQSTMl/p62- zprostředkovaná (dále označovaná jako p62) degradace Keapl, adaptéru, který usnadňuje proteasomální degradaci Nrf2, je základem aktivace Nrf2 v makrofázích. Tato zjištění ukazují, že phloretin má potenciál být použit v terapeutických strategiích pro neurozánětlivé poruchy.

Metody

Protilátky a chemická činidla

Phloretin(Sigma Aldrich) byl rozpuštěn v 50 mM KOH na 15 mM zásobní roztok a skladován při -20 stupni. Další ředění byla provedena v médiu RPMI1640 (Gibco). Pro ošetření in vivo se floretin rozpustil v 1N NaOH, poté se pH upravilo na 7,2 pomocí 1N HCI a roztok se dále zředil ve fyziologické vodě, aby se získala koncentrace 50 mg/kg. BML-275（1 μM, Santa Cruz Biotechnology） byl přidán 1 hodinu před ošetřením floretinem, aby se inhibovala aktivace AMPK. Bafilomycin A1 (BAF, 0,1 μM, InvivoGen) byl přidán 2 hodiny před odběrem, aby se zablokovala fúze autofagozomů a lysozomů. Lipopolysacharid (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) byl použit ke stimulaci buněk pro zánětlivou fenotypizaci. Phorbol 12-myristát 13-acetát (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) byl použit k indukci produkce ROS. Pro western blot byly použity následující protilátky: myší anti- -aktin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), myší anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), králičí anti-AMPK (1:1000;5831S, Cell Signaling Technology), králičí anti-fosforylovaný AMPK (1:1000; 2535S,Cell Signaling Technology),králičí anti-LC3 (1:1000;L7543,Sigma-Aldrich),králičí anti-p62(1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Pro imunofluorescenci byly použity následující protilátky: potkaní anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), potkaní anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), králičí anti-LC3 (1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), králičí anti-p62 (1:500;23214,Cell Signaling Technology), králičí anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), králičí anti-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Vhodné sekundární protilátky byly zakoupeny od Invitrogen.

Myši

Myši divokého typu (WT) C57BL/6JOlaHsd byly zakoupeny od Envigo. Zvířata byla krmena běžnou stravou a umístěna ve zvířecím zařízení Biomedicínského výzkumného ústavu Hasselt University. Všechny experimenty byly provedeny podle institucionálních směrnic a byly schváleny etickou komisí pro pokusy na zvířatech Hasselt University.

Buněčná kultura

Pochází z kostní dřeněmakrofágy(BMDM) byly izolovány z WT a Nrf2 knockout (KO) myší C57BL/6JOlaHsd, zakoupených od Envigo a poskytnutých RIEN BRC v souladu s MTA pro prof. S. Kerdine-Römer [27,28]. BMDM byly získány tak, jak bylo popsáno dříve [29]. V krátké tibiální a stehenní kostní dřeni byly buňky 12-týdenních myší WT a Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd kultivovány v 10-cm Petriho miskách v koncentraci 10×106 buněk/ plotna, v médiu RPMI1640 doplněném 10 procenty fetálního telecího séra (FCS, Gibco), 50 U/ml penicilinu (Invitro-gen), 50 U/ml streptomycinů (Invitrogen) a 15 procent L929-kondicionovaného média (LCM ). Po diferenciaci byly BMDM odděleny při 37 stupních pomocí 10 mM EDTA v PBS (Gibco) a kultivovány (0,5 x 10 stupňů buněk/ml) v RPM1640 doplněném 10 procenty FCS, 50 U/ml penicilinu, 50 U/ml streptomycinu a 5 procent LCM ( 37 stupňů C, 5 procent CO2). Kultury mikroglií byly izolovány z mozků postnatálních mláďat P1-3 C57BL/6/OlaHsd. Po odstranění mozkového kmene, choroidálního plexu a mozkových blan byly mozky mechanicky disociovány a enzymaticky štěpeny po dobu 15 minut 1x trypsinem (Gibco) při 37 stupních. Poté byla buněčná suspenze naočkována do DMEM média s vysokým obsahem glukózy (Sigma) doplněného 30 procenty LCM, 10 procent FCS, 50 U/ml penicilinu a 50 U/ml streptomycinu do kultivačních lahví T75. O dva až 3 dny později byla provedena kompletní výměna média. Smíšené gliové kultury byly třepány (230 ot./min, 3 h, 37 stupňů) po 6-7 dnech, aby se získaly čisté kultury mikroglií.

RNA sekvenování

Buňky byly předem ošetřeny floretinem (50 μM) po dobu 20 hodin a stimulovány LPS (100 ng/ml) po dobu 6 hodin. Buněčná lýza byla provedena za použití činidla Qiazol Lysis (Qiagen). RNA byla extrahována z buněk pomocí RNeasy mini kit (Qiagen). Vzorky byly poté zpracovány Genomics Core Leuven (Belgie). Příprava knihovny byla provedena pomocí Lexogen's QuantSeq kit pro vytvoření Illumina kompatibilních knihoven. Knihovny byly sekvenovány na sekvenačním systému Illumina HiSeq4000. Zarovnání s vědomím sestřihu bylo provedeno pomocí STAR v2.6.1b[30]. Kvantifikace čtení na gen byla provedena pomocí HT-seq Count v2.7.14. Analýza diferenciální exprese založená na počtu byla provedena pomocí R-based (The R Foundation for Statistical Computing, Vídeň, Rakousko) Bioconductor package DESeq2. Seznam odlišně exprimovaných genů byl vybrán na ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitativní reverzní transkripční PCR

Buňky byly předem ošetřeny phloretinem (50 μM) po dobu 20 hodin a stimulovány LPS (100 ng/ml) po dobu 6 hodin. Lýza byla provedena za použití činidla Qiazol Lysis (Qiagen). RNA byla extrahována pomocí mini sady RNeasy (Qiagen). Koncentrace a kvalita RNA byly stanoveny pomocí spektrofotometru Nano-drop (Isogen Life Science). Syntéza cDNA byla prováděna pomocí Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) podle pokynů výrobce. qPCR byla provedena na StepOne-Plus" Real-Time PCR systému (Applied Biosystems) s použitím zelené směsi SYBR obsahující 1× SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM primery (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA a vodu bez nukleázy Ke kvantifikaci genové exprese byla použita komparativní Ct metoda, data byla normalizována na nejstabilnější referenční geny cyklin A a hypoxanthin fosforibosyltransferázu 1. Sekvence primerů jsou k dispozici na vyžádání.

Stanovení reaktivních forem kyslíku

Buňky byly předem ošetřeny phloretinem (50 uM) po dobu 2 hodin. Poté byly buňky stimulovány PMA (15 min, 100 ng/ml) a produkce ROS byla měřena pomocí fluorescenční sondy 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetátu při 10 μM v PBS po dobu 30 min. Fluorescence byla měřena pomocí fluorescenční čtečky mikrodestiček FLUOstar optima (BMG Labtech, Ortenberg, Německo) (excitace: 495 nm, emise: 529 nm).

Měření oxidu dusnatého

Buňky byly předem ošetřeny phloretinem (50 μM) po dobu 2 hodin. Poté byly buňky stimulovány LPS (24 h, 100 ng/ml). NO byl nepřímo monitorován pomocí Griessova reagenčního dusitanového měřícího kitu (Abcam). Stručně řečeno, dusičnan reaguje se sulfanilamidem a N-(1-naftyl)ethylendiamindihydrochloridem za vzniku růžového azobarviva. Absorbance tohoto azoderivátu byla poté měřena při 540 nm pomocí čtečky mikrodestiček (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Buňky byly ošetřeny phloretinem (5{{10}} μM) a LPS (100 ng/ml) po dobu 1 hodiny nebo 24 hodin, aby se stanovila aktivace AMPK nebo hladiny proteinu p62, LC3 a Keapl, v daném pořadí. Buňky byly lyžovány pomocí RIPA-pufru (150 mM NaCl, 1 procento Triton X-100, 0,5 procenta deoxycholátu sodného, ​​1 procenta SDS, 50 mM Tris) a separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným. Gely byly přeneseny na PVDF-membránu (VWR) a bloty byly blokovány po dobu 1 hodiny v 5% hovězím sérovém albuminu v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím 0,1% Tween-20 (TBS-T). Membrány byly sondovány primárními protilátkami přes noc při 4 °C, promyty TBS-T a inkubovány s odpovídající sekundární křenovou peroxidázou značenou protilátkou po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě (RT). Imunoreaktivní signály byly detekovány zvýšenou chemiluminiscencí (ECL Plus, Thermo Fisher) za použití Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) Hustoty pásů byly stanoveny pomocí ImageJ.

Imunofluorescence

Kryosekce míchy byly vysušeny na vzduchu a fixovány v ledově vychlazeném acetonu po dobu 10 minut při - 20 stupni. Myší BMDM byly kultivovány na skleněných krycích sklíčkách a fixovány v ledově chladném methanolu po dobu 10 minut při -20 stupni. Řezy a BMDM byly blokovány po dobu 30 minut pomocí proteinového bloku Dako (Agi-lent). Poté byly inkubovány přes noc při 4 °C s primárními protilátkami, promyty a inkubovány s vhodnými sekundárními protilátkami po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Snímky míšní tkáně byly pořízeny pomocí mikroskopu Nikon Eclipse 80i (10× objektiv) a NIS Software Elements BR 3.10 (Nikon). Snímky BMDM obarvené na p62, LC3 a Keapl byly pořízeny pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 880 a byly korigovány Airyscan (63× objektiv). P62-a LC3- pozitivní punkta byla určena poloautomatickou analýzou punktového obrazu J. Stručně řečeno, po vytvoření binárního obrazu a ručním výběru buněk byla punkta analyzována na buňku. Kolokalizace P62 a Keapl byla provedena pomocí kolokalizačního potrubí v softwaru CellProfiler [31 ]. Obrázky zobrazené na obrázcích jsou digitálně vylepšeny.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeutické nastavení). Myši byly denně váženy a hodnoceny z hlediska neurologických příznaků onemocnění podle průvodce hodnocení EAE u myší výrobce:0:žádné klinické příznaky,0.5:špička ocasu kulhá, 1:kulhá ocas , 1.5: ochablý ocas a inhibice zadních končetin 2: ochablý ocas a slabost zadních končetin, 2,5: ochablý ocas a tažení zadních končetin, 3: ochablý ocas a úplná paralýza zadních končetin, 3,5: kulhání ocasu a úplná paralýza zadních končetin nohy a myš se nemohou narovnat, když jsou umístěny na boku, 4: paralýza bránice, 5: smrt EAE.

Statistická analýza

GraphPad Prism byl použit pro statistickou analýzu dat, která jsou reprezentována jako průměr ± sem D'Agostino a test omnibusové normality Pear-son byl použit pro testování normální distribuce. Pro normálně rozložená data byl použit dvoustranný nepárový Studentův t-test (v případě potřeby s Welchovou korekcí). Pro data, která neprošla testem normality.p-hodnotami, byla použita Mann-Whitneyova analýza<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Výsledek

Transkripční změny spojené s floretinovou léčbou makrofágů

Abychom stanovili potenciální protizánětlivé účinky a identifikovali základní mechanismy léčby floretinem na makrofázích, provedli jsme hromadné sekvenování RNA (doplňkový obr. 1). Analýza dráhy aktivovaných makrofágů ošetřených phloretinem ukázala, že odlišně exprimované geny byly nadměrně zastoupeny v kanonických drahách souvisejících szánět, například iNOS(z-skóre:-2.449), toll-like receptor (z-skóre:-2.236), interferonová signalizace (z-skóre:- 2), a dráha reakce akutní fáze (z-skóre:{10}}.633) (obr. 1A, B). Podobně jako u analýzy kanonických drah předpověděla upstream analýza dat RNA-seq, že phloretin snižuje aktivaci klíčových prozánětlivých regulátorů transkripce, jako je IRF7 (z-skóre: 2,229), IRF1 (z-skóre:-2. 025) a STAT1(z-skóre:-2.022)(obr. 1D). Kromě downregulace makrofágových prozánětlivých drah, analýza RNA-seq makrofágů ošetřených flortinem ukázala, že kromě jiných drah floretin silně aktivoval dráhu Nrf2 (z-skóre: 1,897), o čemž svědčí upregulace související s Nrf{35}} geny jako mafG a proxy (obr. 1A, C). Ještě více, Nrf2 (NFE2L2) byl identifikován jako nejvíce aktivovaný upstream transkripční regulátor (z-skóre: 2,801) a regulace hladin ROS byla identifikována jako jedna z nejvíce upregulovaných biologických funkcí u BMDM léčených floretinem (z-skóre: 2,008 ) (obr. ID, E). Souhrnně zjištění ukazují, že phloretin aktivuje Nrf2 a potlačuje zánětlivý fenotyp makrofágů.

Dráha Nrf2 řídí fenotyp makrofágů ošetřených flortinem

Dále jsme ověřili protizánětlivý účinek floretinu a určili, zda moduluje zánětlivý fenotyp makrofágů působením na Nrf2. Snížené hladiny ROS byly pozorovány u floretinem ošetřených WT BMDM stimulovaných PMA (obr. 2A). Navíc byla pozorována snížená produkce NO a hladiny mRNA prozánětlivých genů NOS2, I-6, COX2 a I-12 u WT BMDM léčených floretinem stimulovaných LPS (obr. 2B, C). ve vztahu ke klíčové úloze Nrf2 při indukci méně zánětlivého fenotypu naše data ukazují, že phloretin aktivuje geny odezvy Nrf2- HO1 a NQO1 ve WT, ale ne Nrf2 KO BMDM stimulované LPS (obr. 2D). Kromě toho léčba phloretinem snížila produkci ROS u WT, ale ne u Nrf2 KO BMDM (obr. 2E). Kromě kontroly antioxidačních reakcí se uvádí, že Nrf2 potlačuje zánětlivý fenotyp makrofágů [12]. Na podporu druhého jmenovaného nebyl floretin schopen snížit expresi prozánětlivých genů NOS2, IL-6, COX2 a IL-12 v aktivovaných Nrf2-deficientních BMDM (obr. 2F). Celkově tyto výsledky naznačují, že Nrf2 řídí posun zánětlivého fenotypu makrofágů zprostředkovaný floretinem.

Phloretin podporuje aktivaci AMPK

Ploretin je dobře definovaný inhibitor GLUT a nedávné studie zdůrazňují význam vychytávání glukózy zprostředkované GLUT pro aktivaci makrofágů [26,32]. Zjistili jsme tedy, zda by phloretin mohl aktivovat energetický senzor AMPK, který se aktivuje při nízkých hladinách energie/glukózy. Naše výsledky ukazují, že léčba floretinem vede k fosforylaci a aktivaci AMPK (obr. 3A, B). Navíc přidání inhibitoru AMPK BML-275 do značné míry zabraňuje aktivaci AMPK u BMDM léčených flortinem (obr. 3A, B). Naše zjištění ještě více prokazují, že aktivace AMPK je nezbytná pro floretin k potlačení produkce ROS, jak ukazují vyšší hladiny ROS u BMDM léčených jak phloretinem, tak inhibitorem AMPK ve srovnání s BMDM léčenými samotným floretinem (obr. 3C). Celkově naše data naznačují, že aktivace AMPK vyvolaná flortinem je zásadní pro řízení makrofágů směrem k méně zánětlivému fenotypu.

Ploretin stimuluje autofagii způsobem závislým na AMPK

Protože aktivace AMPK souvisí s aktivací katabolických procesů v reakci na nutriční deprivaci [33], dále jsme zkoumali, zda floretin může aktivovat autofagii. Autofagie je konzervovaný katabolický proces, který je indukován hladověním a jinými stresovými reakcemi, který podporuje lysozomální degradaci intracelulárního nákladu sekvestrovaného ve váčcích nazývaných autofagozomy. Analýza RNA-seq předpověděla autofagii jako jeden z následných biologických procesů vykazujících zvýšenou aktivitu u BMDM ošetřených floretinem (z-skóre: 0,779) (obr. 4A). Imunocytochemická analýza BMDM léčených floretinem a inhibitorem autofagie bafilomycin Al navíc ukázala zvýšenou akumulaci autofagických markerů MAP1LC3/LC3 (lehký řetězec 3 s proteinem asociovaným s mikrotubuly 1) a p62 ve srovnání s BMDM léčenými bafilomycinem A (obr. 4B-D), což ukazuje na zvýšený autofagický tok po léčbě floretinem [34]. Po indukci autofagie se LC3 převede z formy LC3I na lipidovanou formu LC3I, která koreluje s počtem autofagozomů. V souladu s tím byly stanoveny vyšší hladiny proteinu LC3II a p62 ve florinem stimulovaných BMDM pomocí western blotu (obr. 4E, F). Je zajímavé, že tomuto zvýšení p62 a LC3II floretinem bylo zabráněno léčbou BMDM inhibitorem AMPK BML-275 (obr. 4E-F). Souhrnně naše data ukazují, že phloretin stimuluje autofagii způsobem závislým na AMPK.

Ploretin aktivuje dráhu Nrf2 prostřednictvím autofagie zprostředkované degradace Keap1

Naše data ukazují, že phloretin aktivuje Nrf2 a stimuluje autofagii v makrofázích. Je zajímavé, že autofagický receptor p62 může soutěžit s Nrf2 o vazbu na Keapl, adaptér, který za normálních podmínek usnadňuje ubikvitinaci a degradaci Nrf2. Tato p62-zprostředkovaná disociace Keap1/Nrf2 proto zabrání degradaci Nrf2 a nakonec povede k aktivaci Nrf2 [35]. Z tohoto důvodu jsme určili, zda phloretin podporuje interakci p62/Keapl, čímž aktivuje dráhu Nrf2. Zde ukazujeme, že phloretin aktivuje dráhu Nrf2 prostřednictvím p62-zprostředkované degradace Keapl v makrofázích. Použitím konfokální mikroskopie Airyscan s vysokým rozlišením v kombinaci s kolokalizační analýzou prokazujeme, že florretin stimuluje interakci p62 a Keapl, jak dokazuje zvýšená hodnota kolokalizačního parametru (Pearsonův koeficient) u BMDM léčených floretinem (obr. 5A , B). Naše zjištění navíc ukazují, že nižší hladiny proteinu Keapl jsou přítomny v BMDM ošetřených floretinem, což potvrzuje degradaci Keapl (obr. 5C). Abychom potvrdili, že degradace je závislá na autofagii, přidali jsme inhibitor autofagie bafilomycin A1 k floretinu. BMDM. Je zajímavé, že toto snížení Keapl bylo zvráceno ošetřením bafilomycinem AI (obr. 5C). Tyto výsledky byly potvrzeny westernovým přenosem, ukazujícím snížení hladin proteinu Keapl v BMDM ošetřených flortinem, kterému zabránil bafilomycin AI (obr. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretin snížil závažnost onemocnění (obr. 6B). Snížená závažnost onemocnění u zvířat léčených floretinem byla souběžná se sníženou expresí zánětlivých genů MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 a CXCL2 v míše (obr.6C). Navíc bylo zjištěno snížené množství F4/80t buněk v míše zvířat léčených floretinem (obr. 6E, F). Vzhledem k tomu, že makrofágy F4/80*mikroglie i makrofágy F4/80* přispívají k neurozánětům, podrobnější analýza ukázala, že floretin výrazně snížil množství F480 plus TMEMl19-

makrofágů u EAE myší (doplňkový obr. 2 DF), zatímco byl pozorován nevýznamný trend směrem k redukci F480 plus TMEMl19 plus mikroglie. V souladu s tímto zjištěním phloretin potlačil produkci zánětlivých mediátorů v mikrogliích, ale toto potlačení bylo méně výrazné ve srovnání s makrofágy (doplňkový obr. 2 AC). Tato zjištění naznačují, že zlepšení EAE floretinem je řízeno hlavně makrofágy. Kromě snížení exprese zánětlivých genů zvýšil phloretin expresi protizánětlivých a neurotrofických faktorů, tj. IL-4, CNTF a IGF-1 v míše zvířat EAE (obr. 6D ). Tato zjištění silně naznačují, že phloretin snižuje závažnost onemocnění EAE tím, že pohání makrofágy směrem k fenotypu řešícímu onemocnění. V souladu s našimi předchozími zjištěními in vitro jsme také detekovali zvýšený signál Nrf2 v CNS zvířat s EAE léčených floretinem, jak je indikováno zvýšenou mRNA expresí Nrf2 a jeho downstream cílů NQO1 a GPX1 (obr. 6G). Celkově tato data ukazují, že phloretin potlačuje neurozánět v profylaktickém i terapeutickém nastavení. Naše zjištění dále naznačují, že phloretin může snížit neurozánět potlačením zánětlivých rysů makrofágů prostřednictvím aktivace Nrf2.

Diskuse

V této studii prokazujeme, že floretin pohání makrofágy směrem k méně zánětlivému fenotypu v závislosti na Nrf2-. Bylo zjištěno, že aktivace autofagie závislá na AMPK a následná degradace Keapl je základem aktivace Nrf2 floretinem. Dále potvrzujeme protizánětlivé účinky phloretinu na modelu EAE, kde snižuje závažnost onemocnění a zmírňuje závislost na makrofágáchneurozánět.

Ukazujeme, že phloretin potlačuje zánětlivý fenotyp makrofágů. To je v souladu se zjištěními Wei-Tien Chang et al. kteří prokázali, že phloretin má protizánětlivé vlastnosti v makrofágové buněčné linii [36]. Ukazujeme, že indukce tohoto posunu fenotypu je závislá na Nrf2. Nrf2 je hlavním regulátorem antioxidačních reakcí a je známo, že jeho aktivace pohání makrofágy směrem k protizánětlivému fenotypu [1l, 12, 37]. Několik studií navíc definovalo, že aktivace Nrf2 zmírňuje neurozánět a neurodegeneraci u poruch CNS [{{10] }}]. Nicméně, ačkoli naše zjištění ukazují, že Nrf2 je základem fenotypového posunu makrofágů ošetřených floretinem, data sekvenování RNA ilustrovala, že mezi aktivací Nrf2 byly upregulovány další dráhy. Zejména upregulace dráhy PPAR je zajímavá kvůli jejím protizánětlivým vlastnostem a křížové komunikaci s Nrf2 [41-45]. Kromě toho, protože phloretin je dobře definovaný inhibitor GLUT a přechod na glykolýzu je klíčovou metabolickou událostí pro aktivaci makrofágů, změny fenotypu mohou být částečně indukovány přímými metabolickými účinky florretinu na tyto glukózové transportéry [46,47]. Je zapotřebí více výzkumu, aby bylo možné definovat význam PPAR při aktivaci Nrf2 indukované flortinem a do jaké míry je imunomodulace indukovaná flortinem ovlivněna přímými metabolickými změnami. Celkově naše zjištění jasně ukazují, že aktivace Nrf2 hraje zásadní roli ve změně fenotypu zprostředkované flortinem.

Naše zjištění naznačují, že aktivace Nrf2 floretinem je zprostředkována aktivací AMPK. AMPK hraje klíčovou roli při obnově buněčné energetické homeostázy v případě stresů, které vyčerpávají ATP, což vede ke zvýšení poměru ADP: ATP, čímž se zapíná alternativní katabolické cesty, které generují ATP, zatímco se vypínají anabolické dráhy, které spotřebovávají ATP [48]. V souladu s tím je phloretin dobře zavedeným inhibitorem GLUT a snižuje hladiny glukózy v buňkách [49-51]. Několik studií prokázalo, že aktivace AMPK v makrofázích indukuje imunosupresivní fenotyp, což potvrzuje naše výsledky ukazující, že aktivace AMPK je nezbytná pro florretin ke snížení zánětu [52,53]. Naše data jsou také v souladu s předchozími studiemi, kde bylo prokázáno, že floretin aktivuje AMPK v jiných typech buněk včetně adipocytů a endoteliálních buněk [50, 54-56]. Ploretin může aktivovat AMPK nepřímo zvýšením AMP a snížením hladin ATP, protože AMP a ATP alostericky stimulují nebo inhibují aktivaci AMPK [48, 57]. Nicméně CaMKK, což je kináza upstream od AMPK, může podporovat aktivaci AMPK v reakci na zvýšené hladiny buněčného Ca2 plus bez jakékoli změny hladin AMP/ATP [58]. Kromě toho, vzhledem k široké síti souhry mezi AMPK a up- a downstream drahami, je zapotřebí další výzkum k objasnění základního mechanismu aktivace AMPK vyvolané flortinem.

Naše data naznačují, že aktivace AMPK zprostředkovaná flortinem stimuluje autofagii v makrofázích. Jak bylo uvedeno výše, aktivace AMPK je sebeochranný proces, jehož cílem je obnovit energetickou rovnováhu buňky [48]. Ačkoli žádná studie nikdy neprokázala, že by floretin byl schopen stimulovat fenotyp makrofágů podporou autofagie, některé studie přesto prokázaly účinek floretinu na autofagické dráhy v rakovinných buňkách a hepatocytech [59-61]. Různé studie navíc ukazují, že následné katabolické procesy aktivace AMPK mohou aktivovat autofagii [60, 62, 63]. Je zajímavé, že v reakci na hladovění glukózy je autofagie zprostředkovaná AMPK indukována fosforylací důležitého iniciátoru autofagie unc-51, jako je kináza aktivující autofagii [64,65]. S ohledem na to spekulujeme, že AMPK stimuluje autofagii k obnově ATP z buněčných složek v reakci na depleci glukózy vyvolanou floretinem. Hladovění glukózy však může také aktivovat autofagii způsobem nezávislým na AMPK [66-68]. Proto je nutný další výzkum, aby se zjistilo, zda k aktivaci autofagie floretinem dochází také částečně nezávisle na AMPK.

Nedávné studie ukázaly důležitost autofagie pro řízení funkčního makrofágového fenotypu. V tomto kontextu byla dysregulace autofagie v makrofázích zejména spojena s nástupem aterosklerózy a neurologických onemocnění [69-72]. Zde poskytujeme spojení mezi léčbou floretinem, indukcí autofagie a aktivací Nrf2 tím, že ukazujeme, že phloretin podporuje aktivaci Nrf2 prostřednictvím degradace Keap1 zprostředkované p62-. Až donedávna bylo zvýšení p62 puncta považováno za známku snížené autofagie, protože p62 je degradován v autofagosomech po aktivaci autofagie [34]. V souvislosti s tím je akumulace p62 spojena s autofagickou dysfunkcí v aterosklerotických lézích [73]. Tato představa však byla v posledních letech zpochybněna a nyní se má za to, že p62 je nezbytný pro tvorbu autofagozomů a že zvýšení hladin p62 paralelně se zvýšením LC3Il puncta může být známkou indukce autofagie [74]. Proto spolu se schopností floretinu aktivovat AMPK a jeho známou úlohou v aktivaci autofagie naše výsledky naznačují, že akumulace P62 a LC3 po léčbě bafilomycinem A1 v makrofázích stimulovaných flortinem je způsobena zvýšeným autofagickým tokem, a nikoli narušeným autofagie. Zajímavé je, že Lee Y a spol. nedávno ukázali, že kromě aktivace Nrf2 se na tvorbě autofagozomů podílí také vazba p62 na Keapl, což naznačuje, že aktivace autofagie zprostředkovaná floretinem je přímo spojena se zvýšenou aktivitou p62 na jedné straně, ale také s větší interakcí Keapl-p62 na straně druhé [ 75]. Keapl je adaptér ubikvitin ligázy na bázi Cullin{27}}, který tvoří homodimer s Nrf2 za homeostatických podmínek, čímž podporuje ubikvitinaci Nrf2 a degradaci proteasomů [76]. Narušení komplexu Keapl-Nrf2 vede ke stabilizaci Nrf2 a translokaci do jádra [77, 78]. Je dobře zdokumentováno, že k narušení tohoto komplexu dochází buď modifikací cysteinových zbytků Keapl elektrofilními molekulami, přímou interakcí malých molekul s Keapl, nebo p62-zprostředkovanou degradací Keapl [35]. Ying Y et al. navrhují přímou interakci phloretinu a Keapl na základě experimentů in silico, která pak vede k aktivaci dráhy Nrf2 v kardiomyocytové buněčné linii [79]. Zde jsme vytvořili další mechanismus související s autofagií, kterým phloretin aktivuje Nrf2.

Pomocí modelu EAE jsme prokázali, že phloretin zmírňuje neurozánět in vivo. Naše data silně naznačují, že phloretin zlepšuje EAE potlačením zánětlivé reakce zprostředkované makrofágy a aktivací dráhy Nrf2. V jiných modelech onemocnění bylo také hlášeno, že floretin vykazuje neuroprotektivní a imunomodulační vlastnosti. Zejména bylo zjištěno, že phloretin aktivuje dráhu Nrf2 v mozku po cerebrální ischemii a snižuje akumulaci amyloidu beta u potkaního modelu Alzheimerovy choroby [80-84]. Ploretin může také ovlivnit jiné imunitní buňky in vivo, protože bylo zjištěno, že tato sloučenina inhibuje aktivaci T buněk a dendritických buněk in vitro [85, 86]. Vzhledem k tomu, že neurozánět v modelu EAE není čistě závislý na makrofágu, bylo by zajímavé definovat, do jaké míry je snížení neurozánětu zprostředkováno jinými imunitními buňkami. S ohledem na to, ačkoli naše data naznačují, že zlepšení EAE je řízeno hlavně makrofágy a je méně závislé na modulaci mikroglií, jsou zapotřebí další experimenty, aby se objasnilo, do jaké míry phloretin ovlivňuje mikroglie u neurozánětlivých onemocnění. Celkově naše zjištění ukazují, že phloretin snižuje neurozánět ovlivněním fenotypu makrofágů, což ukazuje terapeutický potenciál phloretinu pro neurozánětlivé poruchy.

Závěry

Naše studie ukazuje, že phloretin je silné imunomodulační činidlo, které moduluje zánětlivé vlastnosti makrofágů u neurozánětlivých poruch. Aktivace dráhy Nrf2, zprostředkovaná aktivací autofagie závislou na AMPK a následnou degradací Keapl, byla stanovena pro řízení tohoto fenotypového posunu. Proto je phloretin slibným přirozeně se vyskytujícím činidlem, které lze použít ke snížení zánětlivé zátěže neurozánětlivých onemocnění, jako je RS.

Reference

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY a kol. Dihydromyricetin zlepšuje tvorbu pěnových buněk prostřednictvím LXRalpha-ABCA1/ABCG1-závislého odtoku cholesterolu v makrofázích. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q a kol. Anthokyany indukují odtok cholesterolu z myších peritoneálních makrofágů: úloha dráhy receptoru aktivovaného peroxisomovým proliferátorem {gama}-jaterního X receptoru {alfa}-ABCA1. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.{11}}/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Kvercetin zesiluje expresi ABCA1 a eflux cholesterolu prostřednictvím ap38-závislé dráhy v makrofázích. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fyziologie pěnových fagocytů u roztroušené sklerózy. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Podvozek JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Podskupiny makrofágů a mikroglie u roztroušené sklerózy. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Roztroušená skleróza: mechanismy a imunoterapie. Neuron. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Stearoyl-CoA desaturáza-1 narušuje reparační vlastnosti makrofágů a mikroglií v mozku. J Exp Med. 2020; 217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Makrofágy fagocytující myelin modulují autoreaktivní proliferaci T buněk. J Neurozánět. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Lipidy odvozené od myelinu modulují aktivitu makrofágů aktivací X receptoru v játrech. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Myelin mění zánětlivý fenotyp makrofágů aktivací PPAR. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.