Fenyletanolové glykosidy z Herba Cistanche zlepšují mikroprostředí hypoxického nádoru a zesilují účinky oxaliplatiny prostřednictvím signální dráhy HIF-1

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG a JIANHUA YANG

Abstraktní.

Rakovina jater je jedním z nejčastějších typů zhoubných nádorů a vyznačuje se vysokou malignitou, rychlou progresí, vysokou morbiditou a mortalitou. Bylo popsáno, že oxaliplatina (OXA) má výraznou účinnost proti pokročilé rakovině jater s tolerovatelnou toxicitou. U solidních nádorů podporuje hypoxické mikroprostředí epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT), který může také indukovat lékovou rezistenci rakoviny jater vůči platinovým lékům. HerbaCistanche (Cistanche tubulosa) se často používá v tradiční čínské medicíně a fenylethanoidové glykosidy z HerbaCistanche(CPhG) jsou hlavní aktivní složky. Cílem této studie bylo prozkoumat účinky CPhG na životaschopnost, apoptózu, migraci a invazi buněk rakoviny jater. Buňky rakoviny jater HepG2 byly rozděleny do kontrolních skupin, DMSO, CoCl2, OXA, OXA plus CoCl2 a CPhGs plus OXA plus CoCl2. Následně byla provedena reverzně transkripčně-kvantitativní PCR a analýza western blot, aby se určily hladiny exprese hypoxií indukovatelného faktoru 1 (HIF-1), lysyloxidáze-like 2 (LOXL2) a genů a proteinů souvisejících s EMT (tj. E ‑cadherin a Twist), s cílem prozkoumat účinky CPhG na rakovinu jater. Výsledky ukázaly, že CPhG by mohly zvýšit účinky OXA na rakovinu jater a inhibovat migraci, invazi a apoptotickou rychlost buněk rakoviny jater. Kromě toho léčba CPhG účinně indukovala downregulaci HIF-1, LOXL2 a Twist a upregulaci E-cadherinu. Současná zjištění naznačují, že CPhG vyvolaly významné zvýšení citlivosti na OXA a potlačení hypoxií indukované EMT v játrech

cistanche přínos: anti-Rakovina jater

Úvod

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 úmrtí souvisejících s rakovinou jater do roku 2030 a z nově potvrzených případů budou 46,6 procenta tvořit případy v pevninské Číně.

Bylo hlášeno, že oxaliplatina (OXA) má inhibiční účinky na růst rakoviny jater s tolerovatelnou toxicitou v klinických podmínkách. Celková účinnost lékové terapie na bázi platiny je však omezena rezistencí nádorových buněk (4). Je dobře známo, že rakovina jater vykazuje nižší citlivost na chemoterapii ve srovnání s jinými typy rakoviny. Mnohočetná léková rezistence rakoviny jater přispěla k její rezistenci vůči řadě terapeutických činidel (5). V předchozí studii Xie a Zhong (6) uvedli, že buňky HepG2 vykazovaly nízkou citlivost na adriamycin, 5-fluorouracil a cisplatinu za hypoxických podmínek. Navzdory skutečnosti, že chemoterapeutika na bázi platiny jsou hlavními možnostmi léčby rakoviny, existuje mezi pacienty rezistence na tyto léky. Navíc prognóza pacientů s karcinomem jater zůstává špatná [7,8]. Dosud bylo vynaloženo značné úsilí na zkoumání lékové rezistence a na zlepšení citlivosti na léky u pacientů s rakovinou jater.

Za hypoxických podmínek dochází v rakovinných buňkách k revaskularizaci, která může vést k epiteliálně-mezenchymálnímu přechodu (EMT) a vaskulární mimice (VM). EMT a VM mohou následně podporovat invazi a vzdálené metastázy. Kromě toho se spekulovalo, že EMT hraje roli jako hnací síla progrese rakoviny (9). Kromě toho se hypoxií indukovatelné faktory (HIF) podílejí na tvorbě nových cév, energetickém metabolismu, buněčné proliferaci, invazi a metastázování (10).

Protein podobný lysyloxidáze (LOX) 2 (LOXL2) je členem rodiny LOX a úzce souvisí s kovalentním zesítěním kolagenu a elastinu, které může vést k fibróze a je klíčové pro integritu extracelulární matrix ( 11). V předchozí studii byl LOXL2 považován za úzce související s metastázami rakovinných buněk (12). Kromě toho bylo prokázáno, že LOXL2 moduluje patogenezi a progresi mnoha typů maligního karcinomu prostřednictvím extra- a intracelulárních cest, což byly důležité ukazatele pro hodnocení špatné prognózy (13,14).Herba Cistancheje tonizující bylina běžně rozšířená v pouštních oblastech, která se často používá v tradiční čínské medicíně (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)je přírodní bylinný lék běžně pěstovaný v autonomní oblasti Xinjiang. Fenylethanoidní glykosidy z Herba Cistanche (CPhGs) slouží jako jedna z hlavních aktivních složek Herba Cistanche. Již dříve Hu et al (17) uvedli, že CPhG by mohly zmírnit poškození jater u myší s nádorem H22 a inhibovat růst rakovinných buněk. Bylo navrženo, že základní mechanismus může souviset se snížením sérového fetoproteinu a mohl by zvýšit imunitu u myší.

V této studii byl pomocí CoCl2 indukován hypoxický model buněk rakoviny jater HepG2. Na tomto základě se tato studie zaměřila na zkoumání účinků OXA na proliferaci, apoptózu, migraci a invazi rakovinných buněk v přítomnosti CPhG za hypoxických podmínek. Kromě toho byly detekovány hladiny exprese mRNA a proteinů HIF‑1, LOXL2, E‑cadherin a Twist. Kromě toho byly zkoumány přesné mechanismy, které jsou základem účinků CPhG na patogenezi rakoviny jater.

přínos extraktu z cistanche: léčba rakoviny jater

Materiály a metody

Buněčná linie. Buněčná linie rakoviny jater HepG2, jak byla identifikována pomocí metody STR, byla poskytnuta Institutem klinického výzkumu, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi, Čína). Buňky byly kultivovány v DMEM s vysokým obsahem glukózy (HyClone; Cytiva) obsahujícím 10 procent fetálního bovinního séra (FBS; Hyclone; Cytiva) při 37 °C v inkubátoru obsahujícím 5 procent CO2.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 procent, mezi nimiž obsah echinakosidu a verbaskózy byl 44,5 a 16,1 procenta. Stonky C. tubulosa (Schrenk) Wight byly odebrány v říjnu 2016 z čínského Xinjiangu. Rostlinu identifikoval Dr. Junping Hu. Všechny tyto vzorky poukazů (č. 201610) byly uloženy v rostlinném herbáři, Farmaceutická fakulta, Xinjiang Medical University, Xinjiang, Čína.

Experimentální design. Buňky HepG2 (5x104/ml) byly ošetřeny různými koncentracemi CPhG (5, 25, 50, 100, 200 a 500 µg/ml) po dobu 48 hodin při 37 °C (24 hodin po naočkování) na screeningovou dávku CPhGs‑L/M/H. Buňky HepG2 (5x104/ml) byly rozděleny do následujících skupin: i) Kontrolní skupina, kultivovaná v DMEM s vysokým obsahem glukózy; ii) DMSO skupina, kultivovaná v 0,1 procentech DMSO (obj./obj.); iii) skupina CoCl2 (modelová skupina hypoxie), kultivovaná v DMEM bez séra obsahujícím 100 uM CoCl2; iv) OXA

skupina (pozitivní kontrolní skupina), kultivovaná v 5 uM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) skupina OXA plus CoCl2, kultivovaná v 5 uM OXA kombinovaném se 100 uM CoCl2; a vi) skupiny CPhGs, ošetřené CPhGs-L/M/H (25, 50 a 100 ug/ml, v daném pořadí) v kombinaci s 5 uM OXA a 100 uM CoCl2.

Test životaschopnosti buněk. Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí testu Cell Counting Kit-8 (CCK-8) podle pokynů výrobce (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) a jak bylo popsáno dříve (18). Buňky (2{4}}x103 buněk/jamka) byly nasazeny na 96jamkové destičky. Následně, ~24 hodin po naočkování, byly buňky ošetřeny po dobu 48 hodin podle podmínek ošetření v každé skupině. Médium bylo poté nahrazeno 100 µl DMEM s vysokým obsahem glukózy, následovalo přidání 10 µl činidla CCK-8; buňky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C. Optická hustota byla měřena pomocí multidetekční čtečky mikrodestiček (Thermo Fisher Scientific, Inc.) při 450 nm. Pro každý stav bylo připraveno šest replikátů.

Stanovení apoptotické rychlosti. Apoptotická rychlost byla stanovena pomocí Annexin V/PI apoptotické detekční soupravy (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Buňky HepG2 (5x105) byly naočkovány do 6-jamkových destiček při 37 °C v 5% CO2. Následně, ~ 24 hodin po ošetření, byly buňky kultivovány v DMEM bez séra po dobu 4 hodin. Buňky byly poté štěpeny s použitím 0,25 procenta trypsinizovaného (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), následovalo alespoň tři promytí předem vychlazeným PBS. Po centrifugaci při 167,7 xg po dobu 5 minut při 4 °C byly buňky resuspendovány v 1X vazebném pufru a koncentrace byla upravena na 1~5x106/ml a poté barveny 5 ul Annexin V-FITC a 5 ul PI po dobu 15 minut. pokojová teplota. Buňky poté podstoupily průtokovou cytometrii pomocí průtokového cytometru BD LSRFortessa (BD Biosciences) a FlowJo

10.6.2 software (Tree Star, Inc.).

Test hojení ran. Inhibiční účinky CPhG na migraci buněk byly zkoumány testem hojení ran (19). Buňky byly naočkovány do 6-jamkových destiček, dokud nebylo získáno 100 procento konfluentní monovrstvy. Následně byly buňky zraněny pomocí 200 µl špičky pipety, promyty PBS a inkubovány s ošetřením v médiu bez séra. Po medikamentózní léčbě byla měřena rychlost hojení ran za 0, 12, 24 a 48 hodin. Snímky ran byly získány pomocí fluorescenčního mikroskopu (Nikon Ti‑S, Japonsko) při zvětšení 10x. Uzavření rány bylo měřeno vzdáleností rány v každém období a vyjádřeno jako procento počáteční vzdálenosti rány v 0 h.

Transwell testy. Buněčná invaze byla hodnocena testy Transwell. Buňky (1x105 buněk/ml) byly suspendovány ve 20}0 ul DMEM s vysokým obsahem glukózy bez FBS. Buňky byly poté naočkovány do horních jamek potažených Matrigelem pokrytých polyethylentereftalátovou filtrační membránou (velikost pórů, 8,0 um). Do spodní komory bylo umístěno celkem 500 ul DMEM s vysokým obsahem glukózy obsahující 10 procent FBS. K odstranění buněk z horního povrchu filtru byly použity vatové tampony po 48 hodinách při 37 °C. Buňky, které pronikly přes membránu, byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 30 minut. Následně byly buňky barveny 0,1 procenta krystalové violeti po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Invazní buňky byly pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem (Nikon Ti‑S) při zvětšení x 100.

Reverzní transkripčně-kvantitativní PCR (RT‑qPCR). Celková RNA byla extrahována z buněk HepG2 za použití činidla TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a syntéza cDNA byla provedena pomocí reagenční soupravy PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) podle protokolu výrobce. qPCR byla provedena na systému 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) s použitím TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) podle protokolu výrobce. Primery použité pro qPCR jsou uvedeny v tabulce I. Podmínky PCR sestávaly z denaturace při 95 °C po dobu 30 sekund, po které následovalo 40 cyklů denaturace při 95 °C po dobu 5 sekund a nasedání při 60 °C po dobu 30 sekund. Nakonec byly výsledky amplifikace analyzovány pomocí metody 2‑ΔACq (20).

Western blot analýza. Proteiny byly extrahovány z buněk ošetřených po dobu 48 hodin homogenizací v RIPA lyzačním pufru (Thermo Fisher Scientific, Inc.) obsahujícím inhibitory proteázy a fosfatázy. Obsah buněčného proteinu byl stanoven pomocí BCA metody. Proteiny (40 ug) byly poté separovány pomocí SDS-PAGE na 10% gelu a přeneseny na PVDF membránu. Membrána byla blokována v 5% odtučněném mléce po dobu 1 hodiny při 4˚C a inkubována s následujícími primárními protilátkami: ‑aktin (1:5,000; kat. č. bs‑0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; kat. č. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; kat. č. ab179810; Abcam), E‑cadherin (1:1,000 ; kat. č. bs‑10009R; BIOSS) a Twist1 (1:500; kat. č. bs‑2441R; BIOSS) přes noc při 4˚C. Membrána byla poté inkubována s kozími anti-králičími IgG H&L sekundárními protilátkami (1:2 000; kat. č. ab205718; Abcam) po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. Po promytí TBS-0,05 procenta Tween-20 byly bloty vizualizovány pomocí systému Enhanced Chemiluminescence (Amersham; Cytiva). Relativní intenzita pásů byla semikvantifikována denzitometrickou analýzou pomocí softwaru ImageJ2x (verze 2.1.4.7; Rawak Software Inc.) a denzitometrické grafy výsledků byly normalizovány na intenzitu -aktinu.

Statistická analýza. Pro analýzu dat byl použit software SPSS 19.{1}} (SPSS, Inc.). Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka a byla analyzována jednocestnou ANOVA následovanou Tukeyho post hoc testem. P<0.05 was="">považovány za statisticky významný rozdíl. Všechny experimenty byly provedeny alespoň trojmo.

Výsledek

Účinky CPhG na životaschopnost buněk. Buňky HepG2 byly ošetřeny různými koncentracemi CPhG (5, 25, 50, 100, 200 a 500 ug/ml) po dobu 48 hodin (24 hodin po naočkování). Jak je znázorněno na obr. 1, došlo k významnému poklesu životaschopnosti buněk ošetřených 200 a 500 ug/ml CPhG ve srovnání s kontrolní skupinou (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG zvyšují účinky OXA na rakovinu jater. Následně byly hodnoceny účinky CPhG na životaschopnost buněk HepG2 modulovanou OXA (obr. 2). Po ~48 hodinách kombinace CPhG a OXA významně snížila životaschopnost buněk HepG2 ve srovnání s OXA plusskupina CoCl2. Konkrétně CPhGs-M plus OXA plus CoCl2 a CPhGs-H plus OXA plus CoCl2 významně inhibovaly životaschopnost buněk HepG2 ve srovnání se skupinou OXA plus CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhG inhibují migraci a invazi buněk rakoviny jater. Pro další studium invazivního potenciálu a migrační schopnosti buněk rakoviny jater po léčbě CPhG a OXA byly provedeny testy hojení ran a Transwell. Test hojení ran ukázal, že ve srovnání s tím ve skupině DMSO byla migrace buněk HepG2 snížena po léčbě CoCl2, OXA a CPhGs (200 nebo 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Účinky CPhG a OXA na apoptózu. Po léčbě kombinací CPhGs a OXA pro

Po 48 hodinách byly buňky HepG2 obarveny Annexinem V-FITC a PI, následovala průtoková cytometrie ke stanovení buněčné apoptózy. Jak je znázorněno na obr. 4A, souběžně léčené skupiny (CPhGs-L/M/H plus OXA plus CoCl2) vykazovaly postupné zvýšení podílu apoptotických buněk se zvýšením koncentrace CPhGs. Většina buněk ošetřených CPhG a OXA byla lokalizována v oblasti Q4, což naznačuje, že kombinace CPhG a OXA indukovala apoptózu v raném stádiu. Ve srovnání se skupinou OXA plus CoCl2 bylo zjištěno významné zvýšení apoptotické rychlosti buněk ve skupinách léčených OXA, CoCl2 a středními nebo vysokými dávkami CPhG (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Obr. 5A-D). Naopak CoCl2 vyvolal významné zvýšení hladin exprese mRNA LOXL2, HIF-1 a Twist ve srovnání s hladinami v DMSOskupina (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Hladiny proteinové exprese HIF-1, LOXL2, E-cadherin a Twist po koinkubaci CPhG a OXA. Výsledky western blottingu odhalily, že hladiny proteinové exprese HIF‑1, LOXL2 a Twist byly za hypoxických podmínek upregulovány ve srovnání s hladinami ve skupině s DMSO. naopak

hladiny proteinové exprese E-cadherinu byly downregulovány za hypoxických podmínek (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Diskuse

Hypoxie je běžným rysem v mikroprostředí rakoviny; to je spojeno především s tím, že proliferacerakovinných buněk je rychlejší ve srovnání s vaskulární tvorbou aberantních novotvarů. Kromě toho jsou hypoxií ovlivněny další biologické procesy, včetně proliferace, metastáz a citlivosti na léky (21). Nádorové hypoxické mikroprostředí je klíčové pro patogenezi a progresi rakoviny a je také důležité v lékové rezistenci a vaskularizaci rakoviny jater (22).

V této studii byly buňky HepG2 ošetřeny různými koncentracemi CPhG, mezi nimiž CPhG (200 ug/ml) mohly významně indukovat snížení životaschopnosti buněk. Je pozoruhodné, že CPhG by mohly modulovat buněčnou životaschopnost způsobem závislým na dávce. Za hypoxických podmínek kombinace OXA a CPhG (50 nebo 100 ug/ml) významně inhibovala životaschopnost buněk HepG2 ve srovnání se samotnou léčbou OXA. Podobný trend závislý na dávce byl pozorován v testech migrace a invaze buněk rakoviny jater. V současné době byly provedeny rozsáhlé studie, které zkoumaly roli apoptózy rakovinných buněk v patogenezi onemocnění jater (23–26). Bylo vyvinuto několik strategií pro léčbu rakoviny jater podporou apoptózy (27–29); tedy rušení v

Apoptóza buněk HepG2 může sloužit jako slibný kandidát pro prevenci a léčbu rakoviny jater. Apoptóza buněk HepG2 byla významně zvýšena po léčbě kombinací CPhGs-M/-H a OXA ve srovnání s apoptózou buněk ošetřených samotným OXA. Proto bylo naznačeno, že CPhG by mohly významně zvýšit protinádorové účinky OXA.

HIF-1 může upregulovat hladiny exprese E-cadherinu, N-cadherinu a Vimentinu a také některých transkripčních faktorů, jako je Snail1/2, Zeb1 a Twist1. Následně by to mohlo vést ke ztrátě buněčné polarity, uvolnění spojení buňka-buňka, změnám v cytoskeletálním proteinu a migraci a invazi rakovinných buněk, což by mohlo vést k translokaci rakovinných buněk do oběhového systému přes bazilární membránu. a následné metastázy (30). V této studii byl CoCl2 použit k indukci modelu hypoxie, která spustila zvýšení životaschopnosti buněk HepG2, stejně jako migraci a invazi buněk. Kromě toho byly hladiny exprese mRNA a proteinu HIF-1 významně zvýšeny, což naznačuje, že CoCl2 indukoval tvorbu

hypoxické mikroprostředí. Léčba kombinací CPhG a OXA výrazně inhibovala hladiny exprese mRNA a proteinu HIF‑1 navozené hypoxií. Tato zjištění naznačují, že CPhG by mohly zeslabit mikroprostředí rakoviny jater způsobem závislým na dávce.

E-cadherin je adhezní molekula závislá na Ca2 plus, která má klíčovou roli v adhezi buňka-buňka, udržování integrity tkáňové struktury a přenosu signalizace. V případech downregulace nebo dokonce ztráty funkce adheze mohou rakovinné buňky vykazovat nekontrolovanou proliferaci a dediferenciaci, což může podporovat zvýšenou invazi rakovinných buněk a následné metastázy (31). E‑cadherin je navíc zásadní pro inhibici EMT rakovinných buněk, která je úzce spojena s diferenciací, invazí, metastázami a prognózou mnohočetných epiteliálních malignit. Pro EMT jsou klíčové transkripční faktory indukující EMT (EMT-TF), jako jsou Twist, Snail a Zeb. Bylo hlášeno, že hypoxie aktivuje signální dráhy, které indukují expresi EMT‑TF; zejména by to mohlo přímo podporovat EMT prostřednictvím transkripční aktivace těchto faktorů (32). Zákrut je vysoce konzervovaná helix-ring-helix

transkripční faktor, který byl v posledních letech nově identifikován. Vysoká Twist exprese byla detekována v mnoha typech rakovinných buněk (33). Proto je nezbytné prozkoumat souvislost mezi expresí Twist a migrací nebo metastázou rakovinných buněk, stejně jako klinickou prevenci a léčbu metastáz (34). V této studii bylo zjištěno, že hladiny exprese mRNA a proteinu E-cadherinu byly downregulovány v přítomnosti hypoxie, zatímco hladiny exprese mRNA a proteinu Twist byly zvýšené. Tato zjištění byla v souladu s výsledky invazních a migračních testů, které naznačovaly, že hypoxie může přispívat k výskytu EMT. Po léčbě OXA byly hladiny proteinové exprese E-cadherinu sníženy; to ukazuje, že OXA vykazovala nízkou účinnost při inhibici růstu buněk rakoviny jater, zatímco mohla podporovat EMT. V kombinaci s CPhG však citlivost buněk HepG2 na OXA vykazovala výrazné zlepšení v přítomnosti hypoxie. Kromě toho by společné ošetření s CPhG a OXA mohlo inhibovat buněčnou životaschopnost, migraci a invazi buněk HepG2. Tato studie pouze odhalila

Twist a E-cadherin výraz; budoucí studie se proto zaměřují na více markerů souvisejících s EMT, aby bylo možné vyhodnotit inhibiční účinek CPhG na hypoxií indukovanou EMT u rakoviny jater.

Bylo hlášeno, že HIF-1 podporuje expresi LOXL2 a zvyšuje migraci a invazi buněk rakoviny jater, což může úzce souviset se špatnou prognózou rakoviny jater (30). V předchozí studii byly hladiny exprese LOXL2 v sousedních tkáních rakoviny jater výrazně zvýšeny ve srovnání s hladinami v tkáních rakoviny (35). Navíc to úzce souviselo s invazí a metastázováním rakoviny jater. Umlčení genu LOXL2 pomocí malé interferující RNA inhibovalo proliferaci buněk HepG2 a SMCC‑7721, což vedlo k zastavení buněčného cyklu rakovinných buněk a zvýšení apoptózy (36). Shao et al (35) zkoumali korelaci mezi LOXL2 ve vzorcích rakoviny jater a klinicko-patologickými faktory, VM a prognózou mezi 201 případy, které podstoupily léčbu. Předpokládalo se, že LOXL2 hraje důležitou roli v patogenezi a progresi rakoviny jater, která může sloužit jako cíl pro vývoj léčiv. Dále Peng et al (37) prokázali, že LOXL2 může aktivovat signální dráhy Snail/E-cadherin a Src kináza/fokální adhezní kináza, což může přispívat k patogenezi a progresi EMT buněk rakoviny žaludku. V této studii byly za hypoxických podmínek hladiny exprese mRNA a proteinu LOXL2 zvýšeny, zatímco jeho exprese byla po léčbě OXA snížena. Kromě toho léčba kombinací CPhG a OXA vedla ke zjevné downregulaci exprese LOXL2, což může účinně napomáhat protinádorovým účinkům OXA na rakovinu jater.

Tato studie má určitá omezení. Tato studie měla použít další dvě buněčné linie rakoviny jater, včetně buněčné linie SMCC-7721, ale ty nemohly být použity, protože nebylo možné tyto buněčné linie zakoupit, protože byly chybně identifikovány a byly odvozeny z buněk HeLa. Kromě toho tato studie neanalyzovala antioxidační účinky různých koncentrací CPhG v buňkách.

Závěrem lze říci, že CPhG by mohly alternovat hypoxické nádorové mikroprostředí buněk rakoviny jater prostřednictvím modulace signální dráhy HIF-1. Kromě toho byla citlivost buněk rakoviny jater na OXA významně zvýšena v reakci na léčbu kombinací CPhG a OXA. Tato zjištění mohou poskytnout novou léčebnou strategii ke zlepšení citlivosti rakoviny jater na chemoterapii.

Poděkování

Nelze použít.

Financování

Tato studie byla podpořena Xinjiang Key Laboratory of Natural Drug Active Components and Drug Release Technology (grant č. XJDX1713), projektem rezervního kandidáta na vedoucího vědeckých a technologických inovací v autonomní oblasti Xinjiang Uygur (grant č. 2019XS14), National Natural Science Foundation of China (grant č. 81860735) a Bethune Charitable

Nadace „Bethune·Quest-budování farmaceutických vědeckých výzkumných kapacit“ (grant č. B-19-H-20200622).

Dostupnost dat a materiálů

Soubory dat použité a/nebo analyzované v průběhu aktuální studie jsou na přiměřenou žádost k dispozici od odpovídajícího autora.

Příspěvky autorů

LMW a JWZ provedly experimenty, vypracovaly rukopis a potvrdily pravost všech nezpracovaných dat. JPH a JHY navrhly tuto studii. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Etický souhlas a souhlas s účastí

Nelze použít.

Souhlas pacienta se zveřejněním

Nelze použít.

Konkurenční zájmy

Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

Reference

1. Hepatocelulární karcinom. Nat Rev Dis Primers 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A a Chen J: Genomické profilování a metabolická homeostáza u primárních rakovin jater. Trends Mol Med 24: 395-411, 2018.

3. McGuire S: World cancer report 2014. Ženeva, Švýcarsko: Světová zdravotnická organizace, mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny, tisk WHO, 2015. Adv Nutr 7: 418‑419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi‑Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K a Hojjat‑Farsangi M: Mechanismy rezistence nádorových buněk k současným látkám cílené terapie. Tumor Biol 37: 10021-10039, 2016.

5. Dong X a Mumper RJ: Nanomedicínské strategie pro léčbu multirezistentních nádorů: Současný pokrok. Nanomedicína (Londýn) 5: 597-615, 2010.

6. Xie Y a Zhong DW: AEG‑1 je spojen s chemorezistencí hepatocelulárního karcinomu vyvolanou hypoxií prostřednictvím regulace dráhy PI3K/AKT/HIF‑1alfa/MDR‑1. EXCL J 15: 745-757, 2016.

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B a kol: LncRNA HULC spouští autofagii prostřednictvím stabilizace Sirt1 a zeslabuje chemosenzitivitu buněk HCC. Oncogene 36: 3528-3540, 2017.

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, et al: Ischemie indukuje klidovou a autofagickou závislost u hepatocelulárního karcinomu. Radiologie 283: 702‑710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD a Jemal A: Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7‑30, 2017.

10. Dong LQ, Shen BQ a Ma Y: Pokrok ve výzkumu mikroprostředí hypoxie u hepatocelulárního karcinomu. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254-1258, 2018 (v čínštině).

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T a Mure M: Human lysyl oxidase-like 2. Bioorg Chem 57: 231‑241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P a Fernandes AS: Inhibitory LOXL2 a progrese rakoviny prsu. Antioxidanty (Basilej) 10: 312, 2021.

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G a Johnson SR: Zesíťování extracelulární matrix zvyšuje růst fibroblastů a chrání před proteolýzou matrix u plicní fibrózy. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A a Karamitopoulou E: Exprese E‑kadherinových represorů SNAIL, ZEB1 a ZEB2 nádorovými a stromálními buňkami ovlivňuje fenotyp pučení nádoru a naznačuje heterogenitu stromatu buňky u rakoviny slinivky břišní. Br J Cancer 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X a Huang L: Cistanches herba: A neuropharmacology review. Front Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X a Gao X: Cistanches Herba: Přehled jeho chemických, farmakologických a farmakokinetických vlastností. J Ethnopharmacol 219: 233‑247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X a Jiang Y: Výzkum účinku cistanche proti rakovině jater. Carcinog Teratog Mutagen 30: 194-199, 2018.

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z a kol.: CBX2 reguluje proliferaci a apoptózu prostřednictvím fosforylace YAP u hepatocelulárního karcinomu. J Cancer 10: 2706-2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, et al: Salidroside zlepšuje mikroprostředí hypoxického nádoru a obrací lékovou rezistenci platinových léků prostřednictvím Signální dráha HIF-1. EBioMedicine 38: 25-36, 2018.

20. Livak KJ a Schmittgen TD: Analýza dat relativní genové exprese pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a metody 2(‑Delta Delta C(T)). Methods 25: 402-408, 2001.

21. Vaupel P: Fyziologie mikroprostředí nádoru a jeho implikace pro radiační onkologii. Semin Radiat Oncol 14: 198-206, 2004.

22. Chen C a Lou T: Hypoxií indukovatelné faktory u hepatocelulárního karcinomu. Oncotarget 8: 46691-46703, 2017.

23. Schwabe RF a Luedde T: Apoptóza a nekroptóza v játrech: Otázka života a smrti. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738-752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H a kol.: Apoptóza a nealkoholické ztučnění jater. World J Gastroenterol 24: 2661-2672, 2018.

25. Pittala S, Kremlin Y a Shoshan-Barmatz V: Cílení na rakovinu jater a související patologie u myší pomocí mitochondriálního peptidu založeného na VDAC1. Neoplasia 20: 594-609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ a Lin X: Aktivátor AKT SC79 chrání hepatocyty před apoptózou zprostředkovanou TNF a zmírňuje poškození jater vyvolané d-Gal/LPS. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 316: G387-G396, 2019.