Fenolové sloučeniny z listů a květů ibišku růžového: potenciální kožní kosmetické aplikace u nedostatečně prozkoumaných druhů
Aug 22, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Používání rostlinných výtažků v kosmetice pro péči o pleť je moderním trendem díky jejich bohatství na polyfenoly, které působí jako molekuly proti stárnutí. ibišek růže je vytrvalý druh naturalizovaný v Itálii, s krásnými jemně růžovými květy; jeho fenolické složení a biologické aktivity nebyly dosud studovány. Cílem této studie bylo charakterizovat a kvantifikovat fenolické látky a vyhodnotit antioxidační, sluneční ochranný faktor (SIPF) a antikolagenázové aktivity etanolových extraktů z listů H. roseus (HL) a květů (HE).p- Hlavními detekovanými fenolickými sloučeninami byly deriváty kyseliny kumarové, chlorogenové a trans-ferulové a také flavonoidy kvercetin a kempferol. Byly detekovány katechin, epikatechin, kaempferol-3-O-rutinosid, kaempferol{7}}O-glukosid, kaempferol{9}}O-glukosid, salidrosid, oenin a peonidin{11}}-glukosid pouze v HF, zatímco floridzin byl výlučně u HL, který také vykazoval větší množství derivátů kyseliny hydroxyskořicové. HF byl bohatší na flavonoidy a celkové fenoly a také vykazoval větší antioxidační kapacitu.bioflavonoidySPF a anti-kolagenázová aktivita obou extraktů byly podobné a srovnatelné se syntetickými standardy. Celkové výsledky ukazují, že extrakty H. roseus jsou slibnými zdroji bioaktivních fenolických sloučenin, které by mohly být potenciálně aplikovány jako anti-aging činidla v kosmetice pro péči o pleť.
klíčová slova:anti-kolagenáza; antioxidant; flavonoidy; květiny; bylinná kosmetika; hydroxyskořicové kyseliny; LC-MS/MS-MRM; listy; péče o kůži; sluneční ochrana
1. Úvod
Používání kosmetiky je prastaré a její historie se formuje paralelně s historií lidstva [1,2]. Kosmetika pro péči o pleť je jedním z nejdůležitějších produktů, je hlavní kategorií v tomto odvětví [1,3]. Zájem o péči o pleť se proto rozšířil a vyvolal poptávku po účinných produktech pocházejících z přírodních zdrojů [2].
Nedávné povědomí o životním prostředí, zdravotní péči a menším používání syntetických chemikálií vedlo ke vzrůstajícímu zájmu o kosmetiku na rostlinné bázi, která nyní představuje jednu třetinu celého kosmetického sektoru [1A]. Využití rostlinných extraktů a jejich fytosložek jako účinných látek je tedy moderním „proekologickým“ přístupem [5,6]. Rostoucí poptávka po těchto produktech může být způsobena jejich sníženými vedlejšími účinky, jejich širokým spektrem účinku v kombinaci s vysokou účinností a jejich obecně nízkými cenami [7,8].
Rostliny jsou bohaté na několik tříd bioaktivních sloučenin, které jsou jedním z nejbohatších zdrojů nových složek odpovědných za léčbu mnoha nemocí [9,10]. Kromě toho jsou rostliny také zdrojem přírodních hydratačních látek, ochucovadel a pigmentů, díky čemuž jsou velmi zajímavé pro kožní kosmetické aplikace [5]. A konečně, rostlinné extrakty jsou obecně považovány za bezpečné a splňují požadavky regulačních orgánů [10,11].
Mezi sloučeninami přítomnými v rostlinných extraktech získaly zvláštní pozornost fenoly jako aktivní složky[12,13] především proto, že vynikají jako protizánětlivé, antimikrobiální a antioxidační látky[14,15]. Tyto vlastnosti z nich dělají ideální preventivní a hojivé molekuly pro kožní onemocnění, které se používají v kosmetologii a dermatologii [16]. Značná antioxidační aktivita fenolických látek je také částečně zodpovědná za jejich anti-aging účinky, které jsou pravděpodobně způsobeny jejich schopností snižovat degradaci kolagenu a poskytovat UV ochranu [16]. Proto bylo zkoumáno a podporováno použití přírodních extraktů bohatých na fenoly s vysokou antioxidační kapacitou jako náhrada syntetických antioxidantů v pleťových produktech [12].
Cistanche může proti stárnutí
Přírodní produkty extrahované z rostlin čeledi Malvaceae se používají po celém světě a rod Hibiscus si získal velkou pozornost pro mnohočetné farmakologické aktivity jejich extraktů a pro jejich vysoký obsah fenolů [17-19]. Hibiscus spp. obsahuje asi 240 druhů jednoletých nebo víceletých kvetoucích bylin, keřů nebo stromů, které jsou rozšířeny v různých oblastech světa [20]. Extrakty z ibišku se v tradiční medicíně používají jako změkčovadla pro léčbu mnoha kožních poruch a popálenin[19,21].koupit cistancheNa základě těchto literárních údajů byly extrakty z Hibiscus sp. rostliny mohou být zajímavými aktivními složkami pro přípravky pleťové kosmetiky, které chrání buňky před oxidačním stresem, degradací kolagenu a škodlivými účinky UV záření.
Přestože rod Hibiscus zahrnuje mnoho druhů, dosud bylo prozkoumáno méně než 10 procent z nich [17]. Hibiscus roseus Thore (syn. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) je bylinný víceletý druh naturalizovaný v Itálii [22,23]O identifikaci a popisu H. roseus se stále diskutuje[ 20,23]. Podle literatury je druh H. moscheutos subsp. palustris byl v Evropě vysazen velmi brzy, zatímco ve Francii byl popsán jako nový druh, H. roseus, Thorem v roce 1807 [23]. Tento druh nebyl charakterizován pro své fenolické složení a studován pro své biologické aktivity, což z něj činí potenciální neobjevený zdroj bioaktivních sloučenin pro produkty péče o pleť.
Lidové využití při ošetření pleti a široké spektrum bioaktivit druhů ibišek ospravedlňují význam nových studií zaměřených na tento rostlinný rod [17]. Cílem této studie proto bylo charakterizovat fenolické složení a vyhodnotit antioxidační kapacitu, ochranu před sluncem a inhibiční aktivitu kolagenázy etanolových extraktů listů a květů H. roseus. Naše výsledky poprvé prezentují fenolické složení a biologické aktivity H. roseus související s anti-aging, což ukazuje na potenciál tohoto nedostatečně prozkoumaného druhu v lékařství a kosmetice jako antioxidant a přísada proti stárnutí.
2. Výsledky a diskuse
2.1.Fenolová charakterizace a kvantifikace
Byla provedena cílová analýza založená na LC-MS/MS-MRM (kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií pracující v režimu monitorování více reakcí), aby se předběžně identifikovaly fenolické sloučeniny přítomné v ethanolových extraktech H. roseus, protože fenolické složení tento druh nebyl dosud v literatuře popsán. Devatenáct fenolických sloučenin dříve popsaných v rodu Hibiscus bylo použito jako standardy (doplňková tabulka S1) k vývoji metody MRM, přičemž výběr nejlepších přechodů byl navržen pomocí optimalizace instrumentálních parametrů a údajů z literatury [24].
The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9,3 min, tabulka 1).
Třináct z devatenácti cílových fenolických sloučenin bylo autenticky identifikováno v extraktech analyzovaných pomocí LC-MS/MS v režimu MRM (tabulka 1).cistanchMRM je výkonný způsob pro současné stanovení několika složek na základě poměru hmotnosti k náboji (m/z) molekulárního iontu (((MH] ) a jeho odpovídajícího dceřiného iontu. Umožňuje zvýšení selektivity a citlivost LC-MS/MS analýz [30]Tato metodika je velmi spolehlivá a vhodná pro analýzy rostlinných extraktů a dalších komplexních směsí vedoucí k nejvyšší specifičnosti, vynikající citlivosti a extrémní multiplexní kapacitě díky možnosti rozlišení sloučenin majících stejné rodičovské ionty, ale různé fragmenty [31,32]. Pomocí této metody jsme získali významné snížení chromatografických běhů, vyšší specificitu a přesnost poskytovanou dobrou separací sloučenin detekovaných se stejnými přechody, přičemž jsme se vyhnuli ztrátě citlivosti v případě různých společně eluovaných sloučenin nebo pro sloučeniny přítomné ve velmi nízké koncentraci [24,334].
Mezi 13 fenolickými sloučeninami identifikovanými pomocí autentických standardů (doplňková tabulka S1) bylo deset výhradně přítomno v květových extraktech (obrázek 1 červená čára, tabulka 1 HF): katechin a epikatechin (vrcholy 16b a 23), kyselina chlorogenová (vrchol 18), peonidin-3-O-glukosid a oenin (vrcholy 21 a 22), kyselina trans-ferulová (vrchol 27), tři glykosidové deriváty kaempferolu (kaempferol-3-O-rutinosid, kaempferol-7-O- glukosid a kaempferol-3-O-glukosid; vrcholy 30, 31b a 32) a salidrosid (vrchol 34). Navíc floridzin (vrchol 33b) byl detekován pouze v extraktech z listů (obrázek 1 modrá čára, tabulka 1 HL), zatímco rutin a kvercetin-3--O-glukosid (vrcholy 26b a 28a) byly identifikovány v obou typech extraktů (obrázek 1, tabulka 1HF/HL). Podobné deriváty kvercetinu, jako je kvercetin-3-O-sambubiosid a isoquercitrin, byly dříve pozorovány u H.sabdariffa [26,29,35,36]a v extraktech H. rosa-sinensis [18]. Některé z těchto glykosidů by mohly odpovídat derivátům kvercetinu, které jsme detekovali u H. roseus. Kromě toho byl tilirosid také dříve detekován ve fenolových extraktech H. květy sabdariffa [37,38]. Oenin (malvidin-3-O-glukosid) a peonidin-3--glukosid, dva antokyany zde poprvé identifikované v květech H. roseus, byly odlišné od těch, které byly dříve popsány u květů H. sabdariffa, delphinidin 3-sambubiosid, delphinidin-3-glukosid a kyanidin{48}}-O-sambubiosid [27,35,39,40]. Je však důležité zmínit, že nejvíce studovaná část květy H. sabdariffa je kalich (kališní lístky), nikoli okvětní lístky, jak jsme zde zkoumali u H.roseus.
Kromě sloučenin identifikovaných a potvrzených autentickými cílovými standardy bylo v extraktech z listů a květů H.roseus domněle identifikováno dalších 27 sloučenin na základě jejich MRM (m/z) a jejich dceřiných iontů, s ohledem na získané produkty fragmentace. z prekurzoru (doplňková tabulka S1). Zejména byla v obou extraktech zjištěna přítomnost derivátů kyseliny p-kumarové, trans-ferulové a chlorogenové a deriváty kvercetinu, jakož i deriváty florretinu a floridzinu (tabulka 1).
Kvantifikace fenolických látek identifikovaných v těchto extraktech byla provedena analýzou HPLC-DAD (vysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s detekcí diodového pole; tabulka 2). Obsah derivátů kyseliny hydroxyskořicové (THC) byl vyšší v listech než v květech, zatímco větší množství flavonoidů (TFC) bylo nalezeno v květech než v listech (p<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistanche AustráliePodobně jako u extraktů H. sabdariffa byly hlavními třídami sloučenin nalezených v listech H. roseus chlorogenové a deriváty kyseliny p-kumarové a také kyseliny caffeoylchinová a p-kumaroylchinová [26,40,41]. Kromě toho byly antokyany hlášeny výhradně u Hibiscus spp. květy a kalichy spolu s katechiny [19,28,35].
Naproti tomu kyselina ferulová a její deriváty byly méně uváděny jako složky Hibis-cus spp. extrakty, ale mohou mít velký význam pro jejich biologické aktivity [6,42-44]. Deriváty kyseliny ferulové získané z různých druhů Hibiscus skutečně vykazovaly důležité farmakologické vlastnosti, jako je antivirová aktivita a inhibiční aktivita enzymu konvertujícího angiotensin [43,44]. Kromě toho byla kyselina ferulová popsána jako aktivní molekula v extraktech H. mutabilis, H. taivanensis [45,46] a v extraktech z kalichu H. sabdariffa [28,38].
Pokud jde o potenciální kosmetické aplikace, bylo prokázáno, že kyselina ferulová inhibuje tvorbu melaninu [6,42], zatímco deriváty kyseliny p-kumarové mají depigmentační [47,48], protizánětlivé a inhibiční účinky na tyrosinázu[49]. Kromě toho mnoho výzkumů zdůrazňuje další úlohy flavonolů a antokyanů, které mohou působit jako ochranné sloučeniny kůže, zejména inhibují melanogenezi [50,51] a prostřednictvím svého působení jako sloučeniny proti stárnutí a prevence melanomu [52,53]. Kromě toho by potenciální aplikace extraktů H. roseusleaf při kožních poruchách mohla být také zvýšena přítomností floridzinu, u kterého bylo prokázáno, že snižuje expresi prozánětlivých cytokinů indukovaných UVB v kůži vystavené UV záření [54].
2.2. Testy antioxidační aktivity
V současné době je široce prokázáno, že akumulace reaktivních forem kyslíku (ROS) je zodpovědná za procesy stárnutí kůže, což vede k suchosti, ztrátám podkožní tkáně a tvorbě vrásek [55,56]. Proto je nalezení přírodních potenciálních antioxidačních sloučenin, které lze použít v produktech péče o pleť, pro kosmetický průmysl velmi důležité.
Naše výsledky ukázaly, že extrakty z listů H. roseus měly nižší antioxidační aktivitu (vyjádřenou jako hodnoty ECso) než květy (tabulka 3). Antioxidační aktivity extraktů nižších rostlin byly skutečně alespoň dvakrát vyšší než u extraktů z listů v obou testech (tabulka 3). Tyto výsledky souhlasí s fenolickým složením a obsahem těchto extraktů (obrázek 1, tabulky 1 a 2), protože HF extrakty byly bohatší na fenolické sloučeniny (tabulka 2). Korelační analýza mezi hodnotami EC50 a obsahem různých tříd fenolických látek se skutečně ukázala jako významná a negativní pro všechny sloučeniny kromě THC. Vyšší množství flavonoidů, katechinů, antokyanů, dihydrochalkonů a celkový obsah fenolů jako takové přispívají k vyšším antioxidačním kapacitám (nižší hodnoty EC50 – tabulka 4).
Mezi flavonoidy jsou kvercetin a jeho deriváty nejlépe zavedenými antioxidanty a lapači volných radikálů, které také působí jako účinné inhibitory oxidáz a lipoxygenáz [57]. Kromě toho byly dihydrochalkony, jako je phloretin, také popsány jako silné antioxidanty v testech pohlcujících 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) a OH[58]. Kromě toho se ukázalo, že antokyany izolované z extraktů ibišku jsou hlavními antioxidačními sloučeninami v lidských buňkách [59].
Extrakty různých částí druhů ibišek prokázaly vysokou antioxidační kapacitu [18,21,27,35,40]. Frakce etanolových extraktů H. sabdariffa vykazovaly v antioxidačních testech velmi nízké hodnoty EC50, které korelovaly s vysokým obsahem kyseliny protokatechuové [21,59], kyseliny chlorogenové, flavonoidů a antokyanů [24,60]. Kromě toho studie na H. esculentus prokázala in vitro antioxidační potenciál derivátů kvercetinu a katechinů přítomných v jeho extraktech[61]. Konečně u H. acetosella antioxidační aktivita silně korelovala s obsahem anthokyanů [62].
Výsledky naší studie na ethanolových extraktech H. roseus ukázaly antioxidační aktivitu, která byla stokrát vyšší než u vodných extraktů z kalichu H. sabdariffl, pro které se EC blížila 45 mg ml- v podobném DPPH in vitro model [56]Avšak na rozdíl od našich zjištění byl celkový obsah flavonoidů a antioxidační kapacita listových extraktů H. sabdariffa vyšší než u květů[63,64]. 2.3. Ochranný sluneční faktor (SPF) in vitro
Ultrafialové záření je jedním z nejškodlivějších environmentálních faktorů ovlivňujících zdraví a fyziologii kůže a je důležitou vnější příčinou stárnutí kůže [65,6] Neustálé vystavení ultrafialovému záření zvyšuje riziko poruch pigmentace a fotostárnutí kůže[67]. To je většinou způsobeno zvýšením hladin ROS, které vede ke stimulaci produkce kolagenázy a má za následek značné poškození kožních buněčných funkcí [56]. Proto jsou složky chránící před UV zářením, včetně těch, které jsou přítomny v rostlinných extraktech, široce používány v kosmetice, aby se zabránilo pronikání ultrafialového záření do pokožky, ale také zabránily produkci ROS tím, že působí jako antioxidanty [56,
Jednoduchou metodou, jak ověřit účinnost různých přírodních složek jako UV filtrů, je test slunečního ochranného faktoru (SPF), což je rychlá a spolehlivá metoda in vitro založená na screeningu absorbance v UV-B spektrální oblasti (mezi 290 a 320 nm), což je užitečné v rané fázi výběru aktivních složek fotoprotekce [69].
Vysoký obsah fenolů a antioxidační aktivita H.cistanche výhodyroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05):2,6±0,15 pro HL a 2,4±0,19 pro HF. Tyto výsledky jsou slibné, protože standardní přípravek na ochranu proti slunečnímu záření obsahující 8 procent homosalátu (rozsáhle aplikovaný chemický opalovací krém) vykazoval hodnotu SPF 4 [69,70]. Zde zjištěné výsledky pro H.roseus byly podobné výsledkům zjištěným u jiných rostlinných druhů[68,69,71,72]a jsou důležité s ohledem na nízkou koncentraci extraktů použitých k testování tohoto účinku.
Extrakty H. rosa-Sinensis již prokázaly pozitivní účinky proti poškození kůže myší ultrafialovým zářením prostřednictvím antioxidační ochrany [73]. Přírodní produkty vykazující SPF spolu s vysokou antioxidační kapacitou a inhibicí kolagenázy a elastázy jsou důležitými kandidáty pro použití k ochraně pokožky před poškozením světlem a k prevenci vzniku vrásek[66,71]. Ve skutečnosti je spojení mezi schváleným tradičním sluncem filtry a tyto deriváty přírodních zdrojů představuje trend v kosmetickém průmyslu, protože spotřebitelé tyto produkty vnímají jako bezpečnější kvůli vedlejším účinkům syntetických UV filtrů[72].
Vyšší obsah celkových fenolických sloučenin HF extraktů (TPC;Tabulka 2) by mohl naznačovat jejich vyšší UV absorpční aktivitu. Extrakty z listů i květů však vykazovaly velmi podobné výsledky, což naznačuje, že více než celkový obsah fenolických látek by fenolický profil extraktů souvisel s ochranou proti UV záření. Zejména vyšší obsah derivátů kyseliny hydroxyskořicové v HL( Tabulka 2) může přispět ke zvýšení jejich hodnoty SPF, protože tyto sloučeniny mají UV absorpci kolem 300-320 nm [74], která je tedy centrována v oblasti UV-B. Naopak flavonoidy a antokyany, většinou přítomné v extraktech z květů, mají širší spektrum absorbance, ve kterém jsou přítomny alespoň dva pásy, s hlavním pásem ve viditelném rozsahu nebo blízko něj, kolem 350 nm pro flavonoly a 505-550 nm pro antokyany [53,69]. Deriváty kyseliny hydroxyskořicové jsou skutečně produkovány rostlinami, zejména pro jejich ochranu před UV zářením [75]. Proto by tyto deriváty kyseliny hydroxyskořicové mohly výrazně přispět k absorpci UV-B lidskou kůží [6]. Nicméně, vezmeme-li v úvahu přítomnost anthokyanů a flavonoidů, které pokrývají hraniční rozsah absorpce vlnových délek, včetně UV-A a viditelných oblastí, extrakty z květů H. roseus by mohly být slibné pro další analýzu a vývoj kosmetických produktů s ochranným faktorem proti slunečnímu záření. Navíc vyšší antioxidační aktivita pozorovaná u HF (tabulka 3) by mohla zvýšit účinky ochrany před sluncem v případných dalších formulacích[69].
2.4. Inhibiční aktivita kolagenázy
Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05),IC50květinové extrakty =0,14 ± 0,02 mg ml-1 a IC50list extrakty =0,13±0,01 mg ml-1, navzdory jejich rozdílům ve fenolickém složení a obsahu (tabulky 1 a 2). To by mohlo být způsobeno synergickými interakcemi mezi fenolickými látkami a kolagenázou, které by mohly hrát důležitou roli v mechanismu inhibice. Kromě toho se na antikolagenázové aktivitě mohou podílet další sloučeniny, které mohou být přítomny v extraktech H. roseus a nejsou zde analyzovány, včetně vitaminu E a kyseliny askorbové [71,7]. Kromě toho dvě testované standardní sloučeniny, kyselina chlorogenová a kvercetin, jejichž deriváty jsou přítomny v extraktech listů a květů H. roseus (tabulka 1), vykazovaly velmi vysokou inhibici kolagenázy s hodnotami IC50 5,8 ± 0,5 a 5,6 ± 0,7 ug ml. -l resp. Proto mohou být tyto sloučeniny zodpovědné za pozorovanou anti-kolagenázovou aktivitu. Je důležité poznamenat, že různé třídy fenolických látek, které jsou také přítomné v našich rostlinných extraktech, již prokázaly anti-aging aktivitu prostřednictvím inhibice degradace kolagenu a přispívající ke zvlhčování pokožky [78]. Například kyselina ferulová a její deriváty prokazatelně hydratují pokožku a stimulují syntézu kolagenových vláken a používají se v kosmetice, jako jsou krémy proti vráskám [6]. Kromě toho jsou flavonoly, zejména deriváty kvercetinu, silnými inhibitory enzymu kolagenázy [79].
Naše výsledky ukazují slibný účinek extraktů H. roseus proti degradaci kolagenu, který je jedním z největších proteinů odpovědných za ztráty elasticity a integrity pokožky a za tvorbu vrásek [80,81]. Enzym kolagenáza inhibuje zachování elasticity kůže a pevnosti v tahu [82]. Různé studie skutečně prokázaly důležitost přírodních antioxidantů díky jejich účinnosti při oddalování předčasného stárnutí prostřednictvím inhibice aktivity kolagenázy [78,83].
Byly provedeny předchozí studie hodnotící účinky druhů Hibiscus na stimulaci produkce kolagenu a na inhibici aktivity kolagenázy [56,84,85]. Inhibice kolagenázové aktivity vodných extraktů H. sabdariffa byla nedávno popsána v literatuře [56]. Podobně jako u našich zjištění autoři nepozorovali účinky inhibice kolagenázy při nízkých koncentracích extraktů, ale pouze při významně vysokých koncentracích [56]. V jiné studii byla hodnota ICso v inhibici kolagenázy etanolových extraktů H. sabdariffin 0,75±0,04 mg ml-1[65], což je aktivita, která je téměř šestkrát nižší než zde popsané pro H. roseus.
3. Materiály a metody
3.1. Rostlinný materiál
Deset rostlin Hibiscus roseus Thore, zakoupených v komerční školce ve Florencii (Itálie), bylo zasazeno do 10-litrových květináčů naplněných písčitou půdou (písek/rašelina, 60:40, v/v) a udržováno ve skleníku Ministerstvo zemědělství, potravinářství, životního prostředí a lesnictví (DAGRI) – Univerzita ve Florencii (UNIFD, Sesto Fiorentino (Itálie, 43949/N,1137/E). Rostliny byly pěstovány ve skleníku od ledna do července 2019 podle manuálu zavlažování ve vodní kapacitě květináče. Z těchto deseti různých rostlin byly na konci července v období květu shromážděny listy a květy ve dvou sdružených skupinách a okamžitě uskladněny při -80 stupních až do extrakce. 3.2. Ultrazvukem asistovaná extrakce
Lyofilizované vzorky (900 mg) květů (HF) a listů (HL) H.roseus byly rozemlety v kapalném dusíku a extrahovány 3 x 15,0 ml 75% ethanolu (pH 2,5 upraveno pomocí HCOOH) ultrazvukem asistovaná extrakce (UAE). UAE bylo prováděno v ultrazvukové lázni (BioClass@ CP104) za použití konstantní frekvence 39 kHz a vstupního výkonu 100 W po dobu 30 minut při 5 stupních. Po centrifugaci (5 min, 9000 ot./min, 5 stupňů; ALC@4239R, Milán, Itálie) byly supernatanty rozděleny 3 x 15 ml n-hexanu, aby se odstranily lipofilní sloučeniny, které by mohly interferovat s analýzou. Ethanolická fáze byla zredukována do sucha, zvážena na digitálních analytických vahách (Precisa[125A) a zbytek byl resuspendován v okyseleném roztoku methanol/voda (1:1 obj./obj., pH 2,5 upravené HCOOH). Proces extrakce byl proveden trojmo.
3.3. LC-MS analýza: Fenolický profil extraktů
LC-MS analýza byla provedena pomocí ABSciex API3000 trojitého kvadrupólového hmotnostního spektrometru (AB Sciex LC, Framingham, MA, USA) spojeného se systémem Agilent 1100 HPLC s binárním čerpadlem a automatickým vzorkovačem (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA, USA ). Získávání a redukce dat byly prováděny pomocí softwaru Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, USA).
HPLC separace byla provedena na Agilent Phenyl Column (3 x 10 mm; 2,7 um) a eluenty byly (A) okyselená voda (na pH 2,5 upravené HCOOH) a (B)acetonitril/ voda (90/10, při pH 2,5 upraveném pomocí HCOOH). Byl použit následující systém rozpouštědel s gradientem: 0-3 min, 5 procent B; 3-18 min, 5-40 procent B; 18-28 min,40 procent B;28-38min, 40-80 procent B; 38-43min, 80 procent B,43-45min, 80-5 procent B, při průtoku 0,4 mLmin -l. Analýza MS byla provedena za následujících experimentálních podmínek: Atmosférický tlak Chemická ionizace (APCI) pomocí vyhřívaného rozhraní nebulizátoru; Proud jehly （NC）, -5 μA; Nebulizer Gas (vzduch), 10 (libovolné jednotky); Pomocný plyn （vzduch）,3L min-l; Teplota pomocného plynu (TEM), 550 stupňů; Clonový plyn (CUR, dusík), 6 (libovolné jednotky); Kolizní plyn (CAD, Dusík),9 (libovolné jednotky, odpovídající 2,6×10~ Torr tlaku kolizního článku).
Identifikace různých fenolických složek byla provedena cíleným přístupem, za použití metody monitorování více reakcí (MRM), optimalizované se standardy pro 19 cílových sloučenin (vybraných na základě předchozích studií polyfenolického složení Hibiscus spp.[25,35] ): dva flavanové-3-oly (katechin a epikatechin), sedm flavonolů (quercetagetin-7-O-glukosid, rutin, kvercetin-3-O-glukosid, kaempferol-3-O. rutinosid , kaempferol-7-O-glukosid, kaempferol{11}}O-glukosid a kvercetin), jeden cinnamátový ester (kyselina chlorogenová), dvě hydroxyskořicové kyseliny (p-kumarová a trans-ferulová kyselina), dva dihydrochalkony ( floridzin a phloretin), jeden oxyflavon (salidrosid) a čtyři antokyany (myrtillin, kuromanin, peonidin-3--O-glukosid a oenin). Retenční čas a relativní přechody MRM (kvantifikátor a kvalifikátor) byly uvedeny v doplňkové tabulce S1. Kromě toho byly navrženy další předběžné identifikace pomocí necíleného přístupu, skenování kvadrupólu od m/z 100 do 100 Da.
3.4. Analýza HPLC-DAD: Kvantifikace fenolických látek
Pro kvantifikaci různých tříd fenolických látek (deriváty kyseliny hydroxyskořicové, katechiny, dihydrochalkony, flavonoidy a antokyaniny) v extraktech byla provedena analýza HPLC-DAD. Alikvoty vzorků (15 μl) byly vstříknuty do kapalinového chromatografu Perkin Elmer Flexar vybaveného kvartérní čerpadlo 200Q/410 a detektor diodového pole LC 200 (DAD) (vše od Perkin Elmer, Bradford, CT, USA). Chromatografické podmínky byly stejné jako ty, které byly použity pro analýzy HPLC-MS/MS (oddíl 3.3). .
Chromatogramy byly získány při 280, 330,350 a 520 nm (pro kvantifikaci anthokyanů). Identifikace a kvantifikace fenolických sloučenin byla provedena na základě retenčního času, UV spektrálních charakteristik a srovnání se standardy, jakož i na základě literárních údajů [25] a předchozí analýzy LC-MS. K tomu byly použity pětibodové kalibrační křivky s různými standardy (kyselina chlorogenová, p-kumarová, rutin, epikatechin, naringin a peonidin-3-O-glukosid, všechny od Sigma-Aldrich"-Merck KGaA, Darmstadt, Německo). kvantifikovat různé polyfenoly detekované a identifikované v extraktech. Pokud nebyl k dispozici komerční standard, byla kvantifikace provedena pomocí kalibrační křivky standardů ze stejné fenolické třídy, která poskytla odhadovaný obsah. Linearita křivek byla určena koeficientem stanovení (R4), která je vyšší než 0,99 pro všechny standardy.
Všechny extrakty byly analyzovány v triplikátech a kvantitativní výsledky fenolických látek byly uvedeny v mg gl suché hmotnosti (mg gl DW), vyjádřeno jako celkový obsah derivátů kyseliny hydroxyskořicové (THC), celkový obsah flavonoidů (TFC), celkové deriváty katechinů obsah (TCD), celkový obsah dihydrochalkonů (IDC), celkový obsah anthokyanů (TAC) a celkový obsah fenolů (TPC), které byly odhadnuty jako součet jednotlivých identifikovaných sloučenin patřících do každé třídy.
3.5. Stanovení antioxidační aktivity
Zkouška antioxidační aktivity byla provedena pomocí dvou různých metod: DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl) a hydroxylových radikálů (OH)-scavenging (HRS).
Pro stanovení DPPH byla použita metoda Khandiho a Charlese [{{0}}]. Stručně, zředěné vzorky extraktů (0,5 ml) byly přidány k 0,5 ml roztoku DPPH (0,1 mM v methanolu; Sigma-Aldrich@, St. Louis, MI, USA) a směs byla ponechána reagovat při teplotě místnosti po dobu 40 minut ve tmě. Tato doba (40} min) byla definována na základě výsledků kinetických analýz každého extraktu a standardů kyseliny chlorogenové a rutinu. Po reakční době byla měřena absorbance při 518 nm pomocí spektrofotometru PerkinElmer® Lambda 25UV/VIS. Hodnotily se také absorbance slepého pokusu (0,5 ml methanolu a 0,5 ml vzorků) a negativní kontroly (0,5 ml methanolu a 0,5 ml roztoku DPPH). Všechny analýzy byly provedeny trojmo. Procento antioxidační aktivity bylo vypočteno následovně (1).
4. závěr
Sekundární metabolity jsou potenciálními aktivními složkami pro nové kosmetické přípravky. Mezi nimi mohou mít fenolické sloučeniny extrahované z rostlin skvělé antioxidační vlastnosti a vlastnosti proti stárnutí, protože jsou účinné při inhibici dermálních enzymů (např. kolagenázy) a při absorpci UV záření. Proto nedostatečně prozkoumané rostlinné extrakty, jako jsou ty z H. roseus, mohou představovat neodhalené zdroje bioaktivních molekul.
Ukázali jsme, že listy a květy H.roseus jsou bohaté na deriváty kyseliny hydroxyskořicové a flavonoidy, přičemž květy mají větší množství glykosidů kempferolu, katechinů, dihydrochalkonů a anthokyanů, všechny tyto sloučeniny zatím nejsou pro tento druh v literatuře popsány. . Velká antioxidační kapacita, zejména květových extraktů, spolu s ochranou proti slunci a antikolagenázovou aktivitou listových i květových extraktů poukazují na slibné využití tohoto málo prozkoumaného druhu v aplikacích péče o pleť. Závěrem lze říci, že naše výsledky ukázaly potenciál květů a listů H. roseus jako zdrojů fenolických látek a také aktivitu jejich extraktů jako činidel proti stárnutí, které lze použít jako přísady do funkčních kosmetických produktů.
Tento článek je převzat z Plants 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants
