Část 3: Účinky isorhamnetinu na diabetes a jeho přidružené komplikace: Přehled studií in vitro a in vivo a post hoc transkriptomová analýza zapojené molekulární dráhy

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

5. Post hoc transkriptomová analýza předpovídá potenciální účinek isorhamnetinu na diabetes v nástroji založeném na kmenových buňkách

Zavedli jsme nástroj založený na kmenových buňkách s použitím perinatálníkmenová buňka, lidské amniotické epiteliální buňky (hAEC), k vyhodnocení bioaktivity přírodních sloučenin pomocí celogenomové mikročipové analýzy [71,140-144]. V posledních letech se stále větší počet bioaktivních sloučenin v léčivých rostlinách testuje na jejich potenciální terapeutické a preventivní účinky. V této souvislosti je věnována velká pozornost přístupům založeným na kmenových buňkách využívajících lidské pluripotentní kmenové buňky (hPSC) jako fyziologicky relevantnější lidské modely in vitro pro screening léků a validaci tisíců sloučenin jak v akademickém výzkumu, tak ve farmaceutickém průmyslu[{{4} }]. Nicméně hPSC, včetně embryonálních kmenových buněk (hESC) a indukovaných pluripotentních kmenových buněk (hiPSC), mají omezené buněčné zdroje, vyžadují invazivní extrakční postupy, drahé přeprogramování buněk a kritické postupy údržby, stejně jako představují etická omezení, a proto jsou méně příznivé jako praktický zdroj pro screening drog. Na druhé straně jsou hAEC odvozeny z vyřazené termínové placenty, lékařského odpadu. Nevyžadují invazivní postupy sběru a mají minimální etické obavy. Kromě toho jsou hAEC odvozeny z pluripotentních epiblastů, a tak si udržují ESC-podobný multilineární diferenciační potenciál a lze je diferencovat na buňky ze všech tří zárodečných vrstev [148-151].

Stojí za zmínku, že na základě vhodného diferenciačního protokolu lze hAEC diferencovat na buňky podobné hepatocytům [152-155], cholangiocyty [156], a co je nejdůležitější, buňky produkující inzulín podobné pankreatu[157-160 ]. Transplantace hAEC-indukovaných pankreatických buněk do streptozotocinem indukovaných diabetických myší by mohla normalizovat hladinu glukózy v krvi [161]. hAEC[162], stejně jako exozomy odvozené z hAECs [163], by mohly urychlit hojení diabetických ran podporou angiogeneze a funkce fibroblastů a snížením zánětu. Začlenění hAEC do ostrůvkových organoidů [164] a stínění nativních ostrůvků vrstvou hAEC [165] by mohlo zlepšit přihojení ostrůvků a revaskularizaci u modelů diabetických myší. Kromě toho bylo popsáno, že buňky podobné hepatocytům odvozené od hAEC, stejně jako samotné hAEC, mají terapeutickou účinnost u onemocnění jater, včetně jaterní fibrózy [166,167], cirhózy [168] a jaterního selhání [169].

Vzhledem ke komplexní patofyziologii DM nemusí být hAEC ideálním in vitro modelem pro studium antidiabetických účinků sloučenin. Nicméně, vzhledem k jeho vlastnostem podobným kmenovým buňkám, může být použit pro počáteční screening cílových sloučenin. Již dříve jsme zkoumali antifibrotický[71] a jaterní diferenciaci indukující [170]potenciál isorhamnetinu u hAEC. V této studii jsme provedli cílenou sekundární analýzu našich dříve publikovaných dat [71], abychom prozkoumali potenciální funkce isorhamnetinu vcukrovka(Figure 4). Data analysis was conducted for three biological replicates of day 10 control (n = 3) and isorhamnetin-treated (n =3) hAECs. The cells were grown in 3D cell culture. Control cells were maintained in placental basal epithelial cell medium(Promo Cell, Cat.#C-26140)in absence of any differentiation medium or growth factors, whereas treatment cells were supplemented with 20 mM of isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Japan) for 10 days. Differentially expressed genes (DEGs) are referred to as genes with a linear fold change>2 a p-hodnota<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">

Kliknutím sem se dozvíte více o produktech

5.1. Sady genů pro podpis typu buňky

V našich předchozích studiích o hAEC jsme zjistili, že různé typy sloučenin by mohly nasměrovat diferenciaci hAEC k různým buněčným liniím, jako je ester kyseliny kávové, kyselina rozmarinová [142] a derivát kyseliny kofeoylchinové3,4,5- Kyselina tri-O-kafeoylchinová (TCQA)[140], která by mohla zvýšit diferenciaci nervových buněk, zatímco anthokyanin, kyanidin-3-O-glukosid (Cy3G), indukoval diferenciaci adipocytů [143] v hAEC. Pozorovali jsme, že biologické aktivity nebo funkce přírodních sloučenin lze obecně předvídat z typů obohacených buněk pomocí DEG.

Zkoumali jsme významně obohacené datové soubory podpisů typu buněk pomocí databáze Molecular Signatures Database (MSigDB) ver. 7.4 online softwaru GSEA (https://software. broadinstitute.org/gsea/index.jsp; přístupné 26. listopadu 2021)[171]. Tyto sady genů obsahují geny pro signaturu klastrových markerů pro buněčné typy identifikované ve studiích sekvenování jednotlivých buněk lidské tkáně a usnadňují přiřazení typů buněk v souborech dat, jako jsou experimenty s vývojem organoidních modelů.

Zjistili jsme, že nejvýznamněji obohaceným souborem genů pro typ buněk byly mezenchymální stromální buňky pankreatu [172] (obrázek 4A). Kromě toho byly významně obohaceny typy pankreatických duktálních a endoteliálních buněk [172]. Pankreatické signaturní geny v hAEC ošetřených isorhamnetinem se účastní epiteliálně-mezenchymálního přechodu, signalizace TGF, signalizace TNF prostřednictvím NF-kB, signalizace KRAS a metabolismu mastných kyselin. Významně bylo obohaceno také několik sad genů pro jaterní signaturu, jako jsou HSC, Kupfferovy buňky, buňky žlučovodů [173] a mezoteliální buňky fetálních jater [174]. Existovalo také několik významně obohacených sad genů pro podpis kosterního svalstva, včetně fibrillinu1 plus fibroadipogenních progenitorových (FBN1 plus FAP) buněk, fibroadipogenních progenitorových (FAP) buněk a pericytů kosterního svalstva [175]. Biologické funkce genů jaterních signatur v hAEC léčených isorhamnetinem zahrnují několik drah zánětlivé reakce, zatímco signaturní geny kosterního svalstva regulují hojení ran, organizaci kolagenních vláken a kaskádu MAPK. Významnost byla měřena jako míra falešných objevů, analog hypergeometrické p-hodnoty po Benjaminiho a Hochbergově korekci pro testování více hypotéz (FDR q-hodnota<>

5.2. Výrazně obohacené sady genů Hallmark

Dále jsme zkoumali významně obohacené sady charakteristických genů na MSigDB (získáno 26. listopadu 2021). Hallmarkové genové sady představují specifické, dobře definované biologické stavy nebo procesy vytvořené na základě identifikace překryvů genových sad a zachování genů, které vykazují koherentní expresi. Charakteristické znaky mají sbírku 50 genových sad zhuštěných z více než 4000 překrývajících se genových sad, a tak mají snížený šum a redundanci [176].

Významně obohacené sady charakteristických genů zahrnují geny definující epiteliálně-mezenchymální přechod, geny upregulované v reakci na hypoxii, geny regulované NF-kB v reakci na TNF, geny up a downregulované aktivací KRAS, geny zprostředkovávající apoptózu aktivací kaspáz, geny zapojené do myogeneze, geny upregulované v reakci na TGF- 1, geny upregulované pomocí STAT5 v reakci na stimulaci IL-2, geny definující zánětlivou odpověď, geny zapojené do drah a sítí p53 a geny kódující proteiny zapojené do glykolýzy a glukoneogeneze (obrázek 4B). Významnost byla zvažována při q-hodnotě FDR<>

Zajímavým zjištěním je obohacení aktivace KRAS o stupně hAEC ošetřených isorhamnetinem. Bylo zjištěno, že několik genových expresí indukovaných KRAS je významně downregulováno isorhamnetinem, jako je MMP9, TSPAN1 a ITGBL1. Hyperglykémie spouští genomovou nestabilitu vedoucí k mutaci KRAS v buňkách slinivky břišní [177] a je také spojována se zvýšeným rizikem a invazivitou rakoviny slinivky [178] a tlustého střeva [179]. Wang et al. uvedli, že isorhamnetin potlačuje proliferaci buněčné linie adenokarcinomu pankreatu PANC-1 prostřednictvím downregulace aktivity signální dráhy Ras/MAPK [134]. Proto, jak je uvedeno v části 4.2.4, účinek isorhamnetinu na KRAS-indukované riziko rakoviny u diabetu, zejména rakoviny pankreatu, stojí za další prozkoumání.

5.3. Výrazně obohacené cesty

Další analýza dráhy DEGs byla provedena pomocí Comparative Toxicogenomics Database (CTD) (http://ctdbase.org/; přístupné 29. listopadu 2021)[180]. CTD představuje cesty Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a REACTOME. Zjistili jsme, že několikzánětlivédráhy, tvorba a sestavení kolagenu, signální dráha PI3K-Akt a signální dráha AGE-RAGE u diabetických komplikací byly významně obohaceny (obrázek 4C).

Konečné produkty pokročilé glykace (AGE) jsou produkovány neenzymatickou glykací a oxidací proteinů, lipidů a nukleových kyselin. Receptory pro koncové produkty pokročilé glykace (RAGE) patří do superrodiny imunoglobulinů. Signalizace AGE/RAGE je komplexní a spletitá kaskáda, která aktivuje mnohočetné intracelulární signální dráhy zahrnující proteinkinázu C, NADPH oxidázu a MAPK, což vede k expresi IL-1, IL-6 indukované NF-kB, TNF-, VCAM-1 a VEGF. Zejména se signalizace AGE/RAGE podílí na vaskulární kalcifikaci zprostředkované diabetem prostřednictvím aktivace fibrózy zprostředkované TGF, NFkB a ERK1/2 drah [181-184]. Zjistili jsme, že isorhamnetin významně snížil genovou expresi související se signalizací AGE/RAGE, jako jsou COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 a SERPINE1. Jak bylo diskutováno v předchozí části, antifibrotické účinky isorhamnetinu byly dobře zdokumentovány [71,74,99,119], a proto lze tvrdit, že isorhamnetin může mít také příznivé účinky na vaskulární patologii indukovanou diabetem.

5.4. Výrazně obohacená metabolická onemocnění a příbuzné genové projevy

Z CTD (získáno 29. listopadu 2021) byla získána data o kurativním spojení gen-onemocnění. Léčili jsme pouze významně obohacená metabolická onemocnění. Význam obohacení byl vypočten pomocí hypergeometrického rozložení upraveného Bonferroniho metodou. Významně obohacená metabolická onemocnění zahrnovala DM, poruchy metabolismu glukózy a lipidů, hyperglykémii a obezitu (obrázek 4D). Heatmap ukazuje, že PPAR, TGF, TNF, IL, kolagen a genové exprese indukující apoptózu byly významně downregulovány v hAEC ošetřených isorhamnetinem (obrázek 4E). Na druhé straně, inzulínové receptory, lipoproteinové lipázy a inhibitory apoptózy byly významně upregulovány v hAEC ošetřených isorhamnetinem.

Naše cílená mikročipová analýza dat hAEC ošetřených isorhamnetinem také potvrdila potenciál isorhamnetinu při regulaci biologických funkcí souvisejících s DM a jeho přidruženými komplikacemi.

6. Biologická dostupnost a intestinální absorpce isorhamnetinu aglykonu a jeho glykosylovaných derivátů

S přítomností různých kategoriíflavonoidyv přírodě je zajímavé analyzovat přítomnost těchto sloučenin v těle. Když mluvíme o metabolismu isorhamnetinu a jeho dostupnosti v lidském těle po konzumaci, mluvíme o původu, metabolismu a transportu. To je založeno na pozorování provedeném chromatografií některých flavonoidů, jako jsou flavonoly v lidském séru. Kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie poskytuje náhled na biologickou dostupnost určitých flavonoidů v jejich aglykonových a glykosidových formách v těle [49]. Hmotnostní spektrometrie lze použít ke stanovení flavonoidů v biologických vzorcích [185]. Studie uvádí 23 smíšených sulfátových, methylových, glukuronidových a glukózových derivátůkvercetinv moči i plazmě lidských dobrovolníků 1 hodinu po požití lehce osmažené červené cibule. Tato studie detekovala glykosidy jak kvercetinu, tak isorhamnetinu v plazmě [186].

Při vstupu živin trávicím traktem hraje roli několik faktorů. Například enzymy ze střevní mikroflóry ovlivňují vstup fenolických sloučenin.

Studie provedená na extraktech z listů ginkga na myším modelu ukázala význam střevní mikroflóry na biologickou dostupnost a absorpci některých bioaktivních molekul z gastrointestinálního traktu, zejména isorhamnetinu [187]. V tomto kroku produkují enzymy střevní mikroflóryflavonoidaglykony a různé produkty štěpení prstenců. Analýzy vzorků plné krve ukázaly, že vychytávání isorhamnetinu se zvýšilo antibakteriální léčbou, což naznačuje, že enzymy střevní mikroflóry mají negativní vliv na farmakokinetiku přirozených molekul, jako je isorhamnetin.Antibakteriálnínebo konzumace probiotik může zvýšit biologickou dostupnost glykosidové formy isorhamnetinu. Kromě toho se in vitro biotransformační rychlosti a doby zdržení bioaktivních molekul lišily mezi normálními, diabetickými a diabetickými potkany s nefropatií [188].

Na druhé straně různé membránové transportéry řídí transport flavonoidů, jako je sodík-dependentní glukózový transportér 1 (SGLT1) a proteiny 2 a 3 spojené s multilékovou rezistenci (MRP2 a MRP3)[189]. V této souvislosti transportéry MRP regulují transcelulární a paracelulární transportní cesty isorhamnetinu [190]. Uvnitř buněk byl transport isorhamnetinu z apikální na bazální stranu 6.{11}}.3-krát vyšší. Na obrázku 5 jsou shrnuty antidiabetické účinky isorhamnetinu.

7. Závěry

Isorhamnetin je fenolická sloučenina ze skupiny flavonoidů, přesněji flavonolů. Původně je to molekula kvercetinu, ale prošla methylací. Isorham-netin je distribuován v rostlinné říši v mnoha divokých a kosmetických rostlinách. Kromě toho tuto molekulu produkuje několik léčivých rostlin a několik studií potvrdilo její antidiabetický účinek mimo jiné biologické aktivity. Všechna tato data tak ukazují zájem o isorhamnetin v terapeutickém průmyslu. Z tohoto pohledu by bylo velmi zajímavé prozkoumat vliv isorhamnetinu a jeho derivátů, izolovaných zejména z přírodních zdrojů, na metabolické poruchy. Je také nutné vyzdvihnout a přezkoumat klinické studie provedené v této souvislosti s použitím frakcí bohatých na flavonoidy a přírodních produktů, aby se předešlo dopadu vedlejších účinků způsobených syntetickými a chemickými léky.

Reference

1. Gill, SS; Tuteja, N. Reaktivní formy kyslíku a antioxidační mechanismy v toleranci abiotického stresu u plodin. Plant Physiol. Biochem. 2010, 48, 909–930. [CrossRef] [PubMed]

2. Corpas, FJ; Gupta, DK; Palma, JM Místa produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) v organelách z rostlinných buněk. In Reactive Oxygen Species and Oxidative Damage in Plants under Stres; Springer: Berlín/Heidelberg, Německo, 2015; s. 1–22.

3. Falleh, H.; Oueslati, S.; Guyot, S.; Dali, AB; Magné, C.; Abdelly, C.; Kouri, R. LC/ESI-MS/MS charakterizace prokyanidinů a propelargonidinů odpovědných za silnou antioxidační aktivitu jedlého halofytu Mesembryanthemum edule L. Food Chem. 2011, 127, 1732–1738. [CrossRef]

4. Trabelsi, N.; Oueslati, S.; Falleh, H.; Waffo-Téguo, P.; Papastamoulis, Y.; Mérillon, J.-M.; Abdelly, C.; Ksouri, R. Izolace silných antioxidantů z léčivého halofytu Limoniastrum guyonianum. Food Chem. 2012, 135, 1419–1424. [CrossRef] [PubMed]

5. Boulaaba, M.; Mkadmini, K.; Tsolmon, S.; Han, J.; Smaoui, A.; Kawada, K.; Ksouri, R.; Isoda, H.; Abdelly, C. In vitro antiproliferativní účinek extraktů Arthrocnemum Indicum na rakovinné buňky Caco{1}} prostřednictvím kontroly buněčného cyklu a související identifikace fenolu LC-TOF-MS. Doplněk založený na důkazech. Alternativní. Med. 2013, 2013, 529375. [CrossRef]

6. Karker, M.; De Tommasi, N.; Smaoui, A.; Abdelly, C.; Ksouri, R.; Braca, A. Nové sulfatované flavonoidy z Tamarix Africana a biologické aktivity jeho polárního extraktu. Planta Med. 2016, 82, 1374–1380. [CrossRef]

7. Bourgou, S.; Rebey, IB; Mkadmini, K.; Isoda, H.; Kouři, R.; Kouri, WM LC-ESI-TOF-MS a GC-MS profilování Artemisia herbal a hodnocení jeho bioaktivních vlastností. Food Res. Int. 2017, 99, 702–712. [CrossRef]

8. Boulaaba, M.; Medini, F.; Hajlaoui, H.; Mkadmini, K.; Falleh, H.; Kouři, R.; Isoda, H.; Smaoui, A.; Abdelly, C. Biologické aktivity a fytochemická analýza fenolických extraktů ze Salsola kali L. Role endogenních faktorů při výběru nejlepších rostlinných extraktů. S. Afr. J. Bot. 2019, 123, 193–199. [CrossRef]

9. Najjar, H.; Abdelkarim, BA; Doria, E.; Boubakri, A.; Trabelsi, N.; Falleh, H.; Tlili, H.; Neffati, M. Fenolové složení některých tuniských léčivých rostlin spojených s antiproliferativním účinkem na buňky MCF -7 lidského karcinomu prsu. EuroBiotechnol. J. 2020, 4, 104–112. [CrossRef]

10. Bourgou, S.; Bettaieb Rebey, I.; Ben Kaab, S.; Hammami, M.; Dakhlaoui, S.; Sawsen, S.; Msaada, K.; Isoda, H.; Ksouri, R.; Fauconnier, M.-L. Zelené rozpouštědlo jako náhrada hexanu pro extrakci bioaktivních lipidů ze semen černého kmínu a bazalky. Jídlo 2021, 10, 1493. [CrossRef]