Část 2: Účinek celkových diterpenoidů z Euphorbiae Ebracteolatae Radix proti zhoubnému ascitu lze připsat změnám akvaporinů prostřednictvím inhibice aktivity PKC v ledvinách

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Všichni víme, že ledviny jsou nejdůležitějším orgánem v lidském těle. Pokud ledvina není dobrá, potřebuje ledvinu vyživovat. Existuje mnoho způsobů, jak vyživovat ledviny. Někteří lidé budou jístCistanchevyživovat ledviny. Cistanche je bohatá na alkaloidy,echinakosid, glykosidy Verbascumkrystalické neutrální látky, aminokyseliny, stopové prvky, vitamíny a další složky. Cistanche může také regulovat oběhový systém s následujícími účinky: chránit ischemický myokard; snižují krevní lipidy, odolávají ateroskleróze a odolávají trombóze; snížit periferní vaskulární odpor, rozšířit periferní krevní cévy a snížit krevní tlak; chránit játra a odolávat ztučnění jater.

3. Diskuse

EER se historicky používá v TCM k léčbě abdominální distenze a edému [1]. V této studii byly antiascitické účinky EER zkoumány pomocí ascitických myší nesoucích nádorové buňky H22. Maligní ascitické myši jsou široce používány ve výzkumu ke studiu léčby nádorů a ascitu [21,22]. Naše výsledky ukázaly, že EER i TDEE mohou významně snížit objem ascitu, zatímco NTDEE neměl žádný účinek. Tyto výsledky ukázaly, že TDEE byla anti-ascites aktivní frakcí EER. Předchozí studie ukázaly, že diterpenoidy z EER mají inhibiční aktivitunádorové buňkyin vitro [5,23]. Tato studie však zjistila, že nemají žádné účinky na životaschopnost nádorových buněk, buněčný cyklus nebo apoptózu nádorových buněk. Možné příčiny tohoto rozporu mohou zahrnovat rozdíly v dávkách a špatnou korelaci mezi aktivitami in vivo a in vitro. TCM zastává názor, že EER je účinná v léčbě edému především rychlou regulací vylučování moči a stolice [6]. Proto jsme analyzovali účinek TDEE na hmotnost moči a obsah vody ve stolici u ascitických myší. Je třeba poznamenat, že hmotnost moči a hmotnost ascitické tekutiny byly ovlivněny TDEE v dávkách 3 a 0,6 g syrových bylin/kg, zatímco obsah fekální vody se zvýšil pouze při 3 g syrových bylin/kg, takže TDEE hlavně snížení objemu ascitu snížením reabsorpce vody v ledvinách. Renální reabsorpce vody hraje ústřední roli v udržování homeostázy tělesné vody [16]. AQP poskytují ledvinám hlavní kanály pro reabsorbci vody a koncentraci moči [24]. V důsledku toho může studie exprese AQPs poskytnout mechanismus pro snížení ascitu.

Různé AQP jsou vyjádřeny v různých oblastechledvina.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>70 procent absorpce vody v glomerulárním filtrátu [16]. AQP2, AOP3 a AOP4 jsou exprimovány výhradně ve sběrných kanálcích, které jsou životně důležitými segmenty pro regulaci vodní bilance a koncentrace moči [16]. V této studii TDEE snížil proteinovou expresi AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v myších ledvinách. Tato zjištění byla potvrzena výsledky buněčných experimentů in vitro. Inhibiční aktivity AQPs hlavních diterpenoidů v TDEE byly hodnoceny v buněčných liniích proximálního tubulu a sběrného kanálku. Naše výsledky ukázaly, že diterpenoidy v TDEE snižují hladiny exprese proteinu AQPs a mRNA v buňkách HK-2 a mIMCD3.

Kliknutím kontaktujte dodavatele pro nákup cistanche tubulosa

Relativní úrovně exprese AQPs proteinu a mRNA každého diterpenoidu byly porovnány s kontrolní skupinou.Renálnítubuly jsou důležitou součástí reabsorpce vody. Mezi čtyřmi diterpenoidy měly ent-abietan diterpenoidy jolkinolid B (1269 procent TDEE) nejsilnější účinek na regulaci AQP1 v buňkách HK-2. Porovnáním se strukturou sloučeniny 2 má jolkinolid B (sloučenina 3) dva epoxidové kruhy v polohách C-11 a 14. Když byl epoxidový kruh na C-11 a 14 přeměněn na hydroxyl a dvojnou vazbu ve sloučenině 2, inhibiční aktivita AQP1 zmizela. Koncentrace moči se vyskytuje hlavně v renálních sběrných tubulech. Výsledky z buněk mIMCD3 ukázaly, že rosanová diterpenoidní sloučenina 4 a norditerpenoidní laktonová sloučenina 5 (představující 9,16 procenta a 39,26 procenta TDEE, v tomto pořadí) mají nejsilnější inhibiční účinky na expresi AQP2, AQP3 a AQP4. Inhibiční účinky ent-abietanových diterpenoidů byly slabé ve srovnání s těmito dvěma typy diterpenoidů. Inhibiční účinky různých typů diterpenoidů na různé AOP v ledvinách nebyly stejné, což může být způsobeno odchylkami v chemické struktuře diterpenoidů a dobou odezvy AQP na každou sloučeninu. Celkově mohou tyto diterpenoidy předávat synergické inhibiční účinky AQP. Protože aktivity těchto diterpenoidů byly odhadnuty in vitro, aktivity těchto sloučenin po metabolismu in vivo zůstávají nejasné, a proto vyžadují další výzkum.

Několik studií naznačuje, že PKC a PKA fungují při regulaci AQP [17-20]. PKC je rodina serin/threonin kináz zapojených do různých buněčných signálních transdukcí [26]. Rodina PKC zahrnuje několik izoforem [26]. Po aktivaci se PKC translokují z cytosolu do plazmatické membrány, navážou se na diacylglycerol (DAG) a následně indukují řadu fyziologických změn [27]. Translokace PKC z cytosolu do plazmatické membrány je indikátorem aktivace PKC [28]. DAG je generován PLC katalyzovanou hydrolýzou membránového fosfatidylinositolu-4,5-bisfosfátu (PIP2)[27]. V experimentech na zvířatech jsme měřili hladiny exprese PKCo a PKC v membránové frakci. Současně jsme také detekovali změny v upstream proteinech PKC. Výsledky naznačují, že TDEE snižuje expresi PKC na buněčné membráně a inhibuje aktivitu PKC. Nebyl však pozorován žádný účinek TDEE na hladinu fosforylace PLC. TDEE se může přímo vázat na PKC a inhibovat aktivaci PKC. Enzymatická aktivita PKA je primárně řízena regulačními podjednotkami, které tvoří holoenzymový komplex s katalytickými podjednotkami [29] Uvolňování katalytických podjednotek je charakteristickým znakem aktivace PKA [29]. Zjistili jsme, že léčba TDEE neměla žádný vliv na aktivaci PKA. Abychom prozkoumali, zda je inhibice AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v ledvinách zprostředkována blokováním aktivace signálů PKC, použili jsme PMA jako agonistu PKC k interferenci s expresí AOP1, AOP2, AQP3 a AQP4 v HK{ {19}} a mIMCD3 buňky. Naše výsledky ukázaly, že eufebrakteolatin A (diterpenoid z TDEE) snížil hladiny exprese AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 vledvinové buňky. Inhibice exprese AOP1, AOP2, AOP3 a AQP4 indukovaná eufebrakteolatinem A byla blokována PMA. Z toho vyplývá, že TDEE regulovala expresi AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 inhibicí aktivace PKC. PKC isoforem je mnoho; TDEE může také regulovat expresi AQP inhibicí jiných izoforem, které čekají na další výzkum. K dnešnímu dni zůstávají molekuly downstream od PKC, které regulují expresi AQP, špatně pochopeny. V dalším kroku se zaměříme na následné regulační mechanismy PKC.

Stručně řečeno, TDEE je aktivní složkou EER proti ascitu. TDEE se skládá z diterpenoidů, jako jsou ent-abietan, rosane a norditerpenové laktony. TDEE a jeho diterpenoidy mohou inhibovat reabsorpci a koncentraci vody v ledvinách snížením úrovní exprese AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4, čímž se řeší ascites. Inhibice exprese AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v ledvinách pomocí TDEE souvisí s inhibicí aktivace PKC. Tato studie může poskytnout základ pro klinickou aplikaci EER a identifikaci kandidátních léků, které udělují diurézu a účinky proti ascitu.

4. Materiály a metody

4.1. Chemikálie a činidla

Souprava pro stanovení albuminu byla zakoupena od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). Acetonitril čistoty pro HPLC byl zakoupen od Media Co. (Anqing, Čína). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM) bylo získáno od HyClone (Logan, UT, USA). Minimální esenciální médium s neesenciálními aminokyselinami (MEM NEAA) a fetální bovinní sérum (FBS) byly získány od Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Čína). Králičí anti-AQP1 a AQP3 protilátky byly získány od EnoGene Co., Ltd. (Nanjing, Čína). Králičí anti-AQP2, AQP4 a myší anti- -aktinové protilátky byly zakoupeny od Zen BioScience Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Králičí anti-PKC, PKC, PLC a fosfo-PLC(Tyr783) protilátky byly zakoupeny od Affinity Biosciences Co., Ltd. (Changzhou, Čína). Radioimunoprecipitační testovací pufr (RIPA pufr), soupravy pro detekci buněčného cyklu a buněčné apoptózy poskytla společnost Yifeixue Biotechnology (Nanjing, Čína). Sada BCA byla zakoupena od Beyotime Biotechnology (Shanghai, Čína). Reagenční pufr TRIzol byl zakoupen od Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). PVDF membrány byly zakoupeny od Millipore (Bedford, MA, USA). Souprava pro syntézu cDNA byla zakoupena od YEASEN Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína).

4.2. Rostlinný materiál

EER, kořen Euphorbia ebracteolate Hayata, byl zakoupen od Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd. (Bozhou, Čína) dne 15. září 2017 a ověřen profesorem Harbinem Hu z Jiangsu Institute for Food and Drug Control. Vzorek voucheru (WH20170915) byl uložen v Herbáři tradiční čínské medicíny na Farmaceutické fakultě Univerzity čínské medicíny v Nanjingu.

4.3. Extrakce a izolace TDEE a čištění diterpenoidů

EER byl rozdrcen pomocí mechanického mlýnku. Prášek (100 g) byl podroben postupné extrakci na Soxhletově extraktoru po dobu 6 hodin dichlormethanem. Poté byl extrakt zahuštěn za sníženého tlaku, čímž byl získán dichlormethanový extrakt. Dichlormethanový extrakt byl podroben kolonové chromatografii (CC) na ODS eluce postupně 40 procenty a 90 procenty methanolu. Eluent 90 procent methanolu se shromáždil, zakoncentroval a vysušil, aby se připravil TDEE (2,4 g). Extrahované zbytky byly spojeny a extrahovány třikrát 95% ethanolem. Extrakt se poté spojí a odpaří do sucha, čímž se získá NTDEE (15,6 g). TEER (19,8 g) byl extrahován z prášku EER (100 g) 95% ethanolem. Tyto extrakty byly použity při pokusech na zvířatech.

Hlavní sloučeniny TDEE byly izolovány pomocí následujícího postupu. Kořen EER (20 kg) byl rozdrcen na prášek a extrahován dichlormethanem po dobu 72 hodin při teplotě místnosti třikrát macerací. Získal se dichlormethanový extrakt a zakoncentroval se na rotační odparce. Zbytek se podrobil CC na silikagelu za použití gradientového systému se zvyšující se polaritou s CH, Cl a MeOH (100:0-0:100) za získání 8 frakcí (Fr. 1-Fr.8) . Fr.4 se podrobil koloně silikagelu s elucí směsí petrolether-EtOAc (od 50:1 do 1:1), následovala reverzní fáze ODS CCeluce s MeOH-H, O od 60 procent do 80 procent za získání sloučenin 5 a 6. Fr.5 byl chromatografován na silikagelové koloně s elucí petrolether-EtOAc (od 35:1 do 0:1), čímž bylo získáno 7 subfrakcí (Fr.5.1-Fr.5.7). Fr.5.3 byl separován pomocí ODS CC s elucí MeOH-H2O (od 75 procent do 100 procent), následně

semipreparativní HPLC (MeOH-H20, od 75 procent do 100 procenta), čímž se získá sloučenina 4. Fr.5.4 se chromatografuje na sloupci silikagelu s elucí směsí petrolether-EtOAc (od 30:1 do 5:1), poté Sephadex LH-20(MeOH:CH2CI, 1:1) a semipreparativní HPLC (MeOH-H,0, od 60 procent do 95 procent), čímž se získá sloučenina 3.Fr. 5.6 byl purifikován pomocí ODS CC elucí s MeOH-H20 gradientem od 40:60 do 100:0, následovaným Sephadexem LH-20 CC (CHCl-MeOH, 1:1), čímž byly získány sloučeniny 1 a 2.

4.4. Experimenty in vivo

4.4.1.Zvířata a experimentální design

Samci myší ICR (hmotnost: 18-22 g) byli získáni z chovu zvířat Qing Long Shan Animal Breeding Farm (Nanjing, Čína). Myši byly drženy ve standardních laboratorních klecích v mírné vlhkosti (50 procent ± 5 procent) při konstantní teplotě (22 ± 1 stupeň) ve 12hodinové cyklovací místnosti světlo-tma. Všechna zvířata měla během experimentálního období volný přístup k potravě a vodě. Experimentální protokol byl schválen Etickým výborem pro zvířata na Nanjing University of Chinese Medicine (Nanjing, Čína).

Celkem 90 myších samců bylo náhodně rozděleno do 9 skupin (n= 10). Kontrolní skupině byla intraperitoneálně injikována 0,2 ml fyziologického roztoku. Myši v ostatních skupinách byly ip inokulovány 1 x 1 {{10}} buňkami H22 stupně v objemu 0,2 ml. Všechna léčiva byla suspendována ve vodě s 0,5 procenta (wo/o) sodná sůl karboxymethylcelulózy (0,5 procenta Na-CMC). Po 24 hodinách byly myši léčeny sondou každý den podle následujícího schématu po dobu 8 dnů: normálním a modelovým skupinám byl podáván 0,5% Na-CMC. Furosemid (6 mg/kg) byl vybrán jako pozitivní kontrola, protože se široce používá k léčbě edematózních onemocnění, jako je ascites, díky diuréznímu účinku. Skupinám TEER, TDEE a NTDEE byly podávány odpovídající extrakty EER (3,0 a 0,6 g syrových bylin/kg).

4.4.2. Stanovení hmotnosti ascitické tekutiny, hmotnosti moči a obsahu vody ve stolici

Myši z modelové a léčené skupiny byly usmrceny a z peritoneální dutiny byla odebrána ascitická tekutina. Tekutina byla poté zvážena na elektronické váze.

Myši byly umístěny v jednotlivých klecích. Výkaly byly shromážděny do zvážených a uzavřených lahviček. Po 5 hodinách byly lahvičky obsahující vlhké výkaly zváženy. Poté byly lahvičky sušeny na konstantní hmotnost při 105 stupních. Obsah fekální vody ( procenta )=((hmotnost lahviček obsahujících vlhké výkaly – hmotnost lahviček obsahujících sušené výkaly)/(hmotnost lahviček obsahujících vlhké výkaly – hmotnost lahviček))× 100.

Hmotnost exkrece moči byla měřena modifikací předchozí metody [30]. Myši byly umístěny v jednotlivých kádinkách. Kádinky byly pokryty kovovou síťkou na ústech a poté obráceny na plastové misky obsahující superabsorpční polymer (SAP). Při tomto testu byly výkaly vyčištěny. Po 5 hodinách byly plastové misky obsahující SAP a moč zváženy. Pro stanovení hmotnosti moči byla použita následující rovnice: hmotnost moči (g)=hmotnost plastových misek obsahujících SAP a hmotnost moči plastových misek obsahujících SAP.

4.4.3. Analýza sérového albuminu

Krev ze všech skupin byla odebrána orbitální punkcí a centrifugována při 5000 x g po dobu 10 minut při 4 stupních. Sérový albumin byl měřen pomocí soupravy pro stanovení albuminu.

4.4.4. Testy životaschopnosti, cyklu a apoptózy nádorových buněk

Poté, co byly myši usmrceny, byla ascitická tekutina obsahující nádorové buňky odebrána z peritoneální dutiny a okamžitě zředěna 20krát fyziologickým roztokem. Životaschopnost nádorových buněk byla hodnocena 0,4% barvením trypanovou modří a počítána v automatickém počítadle buněk (ALIT Life Science Co., Ltd., Shanghai, Čína).

Zředěná buněčná suspenze (0,5 ml) byla centrifugována při 1000 g po dobu 5 minut při 4 °C. Buňky byly shromážděny a fixovány ve studeném 70% ethanolu při 4 °C přes noc. Po fixaci byly nádorové buňky dvakrát promyty v PBS a centrifugovány a poté inkubovány s roztokem RNázy A (100 ul) po dobu 30 minut při 37 stupních. Nakonec byly buňky inkubovány se 400 ul propidium jodidu

(PI) po dobu 30 minut při 4 stupních ve tmě a přefiltrován přes 300-síťovou nylonovou membránu. Procento buněk v různých fázích bylo analyzováno pomocí průtokového cytometru Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Apoptóza nádorových buněk byla detekována pomocí soupravy Annexin V-FITC/PI Apoptosis. Zředěná buněčná suspenze (0,5 ml) byla dvakrát promyta v PBS a centrifugována při 1000 g po dobu 5 minut při 4 stupních. Buňky byly shromážděny a resuspendovány ve 100 ul vazebného pufru s následnou inkubací s 5 ul Annexin V-FITC a 10 ul PI barvicího roztoku po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Po inkubaci bylo do každé zkumavky přidáno 400 ul vazebného pufru. Apoptóza buněk byla detekována pomocí průtokového cytometru Accuri C6.

4.4.5. Western Blot analýza AQP, PKC, PKA a PLC v ledvinách

Poté, co byly myši usmrceny, byly ledviny izolovány a rychle zmraženy a poté uloženy při -80 stupni pro analýzu proteinové exprese. Vzorky tkáně byly homogenizovány v RIPA lyzačním pufru. Po skladování při -20 stupních přes noc byly tkáňové lyzáty shromážděny po centrifugaci po dobu 10 min při 12,000×g. Po odstředění byl supernatant odebrán pro stanovení celkových a fosforylovaných proteinů. Membránové proteiny byly extrahovány z ledvin pomocí Membrane Protein Extraction Kit podle protokolu výrobce. Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí BCA kitu. Proteinové roztoky byly denaturovány ve vroucí vodě po dobu 5 minut a smíchány s 5x nanášecím pufrem. Stejná množství proteinů byla separována na 10% SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze, přenesena na polyvinylidendifluoridové (PVDF) membrány a následně blokována 5% albuminem z bovinního séra (BSA) po dobu 2 hodin. Po zablokování byly membrány inkubovány s primárními protilátkami proti AOP1(1:2000), AOP2(1:1000), AQP3(1:2000),AQP4(1:1000), PKC (1:2000), PKC (1: 2000), PKA (1:2000), PLC (1:2000), p-PLC (1:800) a -aktin (1:5000) při 4 stupních přes noc. Poté byly membrány promyty Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem obsahujícím 0,1 procenta Tween-20 (TBST) a primární protilátky byly detekovány sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou (1:5000). Proteiny byly vizualizovány chemiluminiscenčním činidlem a chemiluminiscenčním zobrazovacím systémem Tanon 5200 (Tanon, Shanghai, Čína). Pásy blotu byly kvantifikovány denzitometrií za použití ImageJ.

4.5. Stanovení šesti hlavních diterpenoidů v TDEE

Euphoria G, ent{{0}}l-hydroxyabicta-8(14),13(15)-dien-16,12-olid,jolkinolid B, EU-febrakteolatin A, Fischer A a jolkinolid E byly rozpuštěny v acetonitrilu na vhodné koncentrace. TDEE byl také rozpuštěn v acetonitrilu pro detekci obsahu složek pomocí HPLC. HPLC analýza byla provedena na separačním systému Waters 2695 vybaveném detektorem fotodiodového pole (Waters, Milford, CT, USA) a kolonou Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 um）). Mobilní fáze sestávala z 0,1 procenta kyseliny mravenčí vody (A) a acetonitrilu (B). Rozpouštědlo bylo vyvinuto s průtokovou rychlostí 1 ml/min s použitím následujícího gradientového programu:0-25 min, 65 procent B;25-40 min, 65 procent -85 procent B;{{25 }} min, 85 procent -100 procent B. Objem nástřiku byl 10 μl. Teplota kolony byla 30 stupňů a byla použita vlnová délka 265 mm.

4.6. Experimenty in vitro

4.6.1. Buněčná kultura

Buňky HK-2 a mIMCD3 byly zakoupeny od společnosti Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Čína). Všechny buňky byly kultivovány v inkubátoru v atmosféře 5 procent CO2 při 37 stupních až do 90 procent konfluence a poté byly ošetřeny různými sloučeninami a řízeny pro experimenty. Buňky HK-2 byly pěstovány v MEM NEAA doplněném 10 procenty FBS a 1 procentem antibiotik, zatímco buňky mIMCD3 byly pěstovány v médiu DMEM obsahujícím 10 procent FBS a 1 procento antibiotik.

4.6.2. Western Blot a kvantitativní reverzní transkripční-PCR (qRT-PCR) analýzy AQP

Buňky HK{{0}} a mIMCD3 byly nasazeny (5x 105/jamku) do 6-jamkových destiček po dobu 24 a 12 hodin před ošetřením. Buňky byly ošetřeny různými sloučeninami po dobu 8 hodin v 5% CO, inkubátoru při 37 stupních. Buňky ošetřené 0,1 procentem dimethylsulfoxidu byly použity jako kontrola vehikula. Po ošetření byly buňky dvakrát promyty studeným PBS, sklizeny seškrábáním v RIPA lyzačním pufru a poté lyžovány. Po skladování při -20 stupni přes noc byly lyzáty vyčeřeny centrifugací při 12,000xg po dobu 10 minut a supernatanty byly shromážděny a použity v analýze Western blot. Western blot byl proveden tak, jak bylo dříve popsáno v experimentech na zvířatech v tomto článku.

Pro izolaci celkové RNA. Po inkubaci s různými sloučeninami po dobu 8 hodin byly buňky promyty PBS a rozpuštěny v pufru činidel TRIzol a RNA byla izolována podle pokynů výrobce. cDNA byla syntetizována ze stejného množství RNA pomocí soupravy pro syntézu cDNA. Reakční směs pro gRT-PCR byla připravena přidáním cDNA, přímých a reverzních primerů uvedených v tabulce 1, DEPC vody a zelené hlavní směsi SYBR. Pro analýzu genové exprese byl použit přístroj Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR. Podmínky PCR byly následující: počáteční denaturace při 95 stupních po dobu 5 minut následovaná 40 cykly při 95 stupních po 10 s a 60 stupních po 34 s. Nakonec byla PCR data analyzována metodami dvojitého delta CT na tabulkovém procesoru Microsoft Excel.

4.6.3. Účinek PKC agonisty PMA na expresi AQPs proteinu v buňkách ledvin

Buňky HK-2 a mIMCD3 byly naneseny na 6-jamkové destičky v hustotě 5×10 stupňů buněk/jamku. Po připojení buněk byly buňky preinkubovány s nebo bez 200 nM agonisty PKC (PMA) po dobu 1,5 hodiny a poté byly ošetřeny eufebrakteolatinem A (2,5 uM) po dobu 8 hodin. Extrakce celkových a membránových proteinů a analýza Western blotting byly provedeny tak, jak bylo podrobně popsáno dříve.

4.7 Statistická analýza

Pro statistickou analýzu byl použit analytický software SPSS 19.{1}}. Data byla analyzována pomocí jednocestné ANOVA nebo testu pořadí-součtu. Číselné údaje byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). Rozdíly s p<0.05 were="" considered="" statistically="">