Část 1: Geraniol zmírňuje poškození ledvin zprostředkované doxorubicinem prostřednictvím změny antioxidačního stavu, zánětu a apoptózy: Potenciální role NF-kB a Nrf2/Ho-1

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: Zprostředkováno doxorubicinempoškození ledvinje vážným problémem v léčbě rakoviny. V souladu s tím tato práce zkoumala schopnost geraniolu modulovat indukovanou doxorubicinempoškození ledvinpomocí modelu krysy. Potkani byli náhodně rozděleni do čtyř skupin: kontrola, doxorubicin (20 mg/kg, intraperitoneálně, ip), doxorubicin plus 100 mg/kg geraniolu a doxorubicin plus 200 mg/kg geraniolu. Jediná injekce doxorubicinu vyvolala poškození ledvin, o čemž svědčí změněné hodnoty sérového kreatininu, dusíku močoviny v krvi a albuminu; to také způsobilo histologické změny v architektuře ledvin. Doxorubicin navíc zvýšil peroxidaci lipidů a zároveň snížil snížený glutathion, katalázovou aktivitu a expresi glutathionperoxidázy a superoxiddismutázy. Je zajímavé, že předběžná léčba geraniolem zachránila doxorubicinem vyvolané změny v ledvinových antioxidačních parametrech, enzymatické aktivitě a expresi genů a proteinů zprostředkujících zánět a apoptózu. Navíc profylaktická léčba geraniolem zachovala většinu histologických charakteristik ledvin způsobem závislým na dávce. Tato zjištění podporují, že geraniol by mohl chránit před doxorubicinemdysfunkce ledvin. K objasnění mechanismů ochranných účinků geraniolu proti dysfunkci ledvin zprostředkované doxorubicinem je však zapotřebí dalšího výzkumu.

Klíčová slovadoxorubicin; zánět; oxidační stres; apoptóza; poškození ledvin; geraniol

1. Úvod

Od svého objevu byl antracyklinový protirakovinný lék doxorubicin (Dox) široce používán proti solidním nádorům a hematologickým malignitám. Mezi jeho nejčastější vedlejší účinky patří nefrotoxicita, popisovaná jako renální dysfunkce se sníženou filtrací, reabsorpcí a vylučováním, která je spojena s významným rizikem morbidity a mortality. Přibližně u 60 procent pacientů s rakovinou, kteří dostávají chemoterapii, se rozvine nefrotoxicita, což omezuje terapeutickou účinnost Dox [5,6]. Zatímco základní procesy, které způsobují nefrotoxicitu zprostředkovanou Dox, zůstávají neznámé, literatura naznačuje, že pravděpodobnými přispěvateli jsouoxidační stres, zánět, aapoptóza. Zejména důkazy naznačují, že snížení Dox souvisíoxidační stres, záněta apoptotické události mohou pomoci snížit renální toxicitu léku.

Nukleární faktor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) je redox-senzitivní transkripční faktor s antioxidačními, protizánětlivými a cytoprotektivními schopnostmi, které podporují buněčné obranné systémy. Při oxidativním stresu Nrf2 uvolňuje svůj cytoplazmatický inhibiční protein, který vstupuje do jádra a aktivuje několik genů zapojených do antioxidační obrany, jako je hemoxygenáza-1(Ho-1), glutathionperoxidáza (GPx), kataláza( CAT) a superoxiddismutáza (SOD) [14-19]. Bylo prokázáno, že léčba Dox snižuje jak mRNA, tak proteinové exprese Nrf2, a tedy i downstream antioxidačních genů a proteinů, což vede k toxicitě ledvin.

Nukleární faktor-kB (NF-kB) je transkripční faktor, který reguluje expresi mnoha zánětlivých genů; jako ústřední postava NF-kB dráhy, která je aktivována reaktivními formami kyslíku (ROS), může vyvolat zánětlivou odpověď a následné poškození tkáně [8,22,23]. Četné studie uvádějí, že Dox způsobuje zánět a zvyšuje produkci prozánětlivých cytokinů, jako je interleukin-6(IL-6), interleukin-1 beta (L-1 ), a tumor nekrotizující faktor-alfa(TNF-)[11,13]. Navíc se ukázalo, že zvýšená produkce ROS po poškození ledvin zprostředkovaném Dox hraje klíčovou roli při aktivaci vnitřní apoptotické dráhy prostřednictvím mitochondriální nestability. Klíčovými determinanty této dráhy jsou mitochondriálně asociované proteiny Bax a Bcl-2; vyvážený poměr Bcl-2 k Bax zabraňuje apoptóze, zatímco nerovnováha vede ke zvýšené propustnosti membrány a úniku cytochromu c do cytosolu, což aktivuje kaspázu-9(Casp-9) a kaspázu{ {21}} (Casp-3). Taková aktivace obecně vede k fragmentaci DNA a buněčné smrti.

Je velmi zajímavé maximalizovat klinické využití chemoterapeutických léků a zároveň minimalizovat jejich negativní účinky. V souladu s tím bylo vynaloženo výzkumné úsilí ke zkoumání použití různých látek ve spojení s Dox ke zmírnění jeho nežádoucích účinků [13,30,31]. Bylinné extrakty a jejich bioaktivní složky jsou již dlouho uznávány pro svou schopnost snižovat toxicitu zprostředkovanou léky. Geraniol je acyklický monoterpenový alkohol, který se nachází téměř ve všech esenciálních olejích, jako jsou zázvor, růže, pomeranč, levandule a citron [32,33]. Četné studie uvádějí, že geraniol má různé příznivé vlastnosti, jako je protivředový, protirakovinný [35], antidepresivní [36], protizánětlivý [33] a navíc může zmírnit diabetickou nefropatii [37]. .

Podle našich nejlepších znalostí v současné době neexistují žádné konkrétní informace o preventivních účincích geraniolu proti nefrotoxicitě zprostředkované Dox. Studovali jsme tedy účinky a pravděpodobné mechanismy působení geraniolu na poškození způsobené Dox prostřednictvím signálních drah NF-kB a Nrf2/Ho-1 v ledvinách potkanů ​​Wistar.

2. Materiál a metody

2.1.Zvířata

Samci krys Wistar byli získáni z centra péče o zvířata King Saud University (KSU) v Rijádu v Saúdské Arábii. Zvířata byla chována v kontrolovaných podmínkách, jako byla chována při pokojové teplotě (25 ± 1 stupeň) s 12hodinovým cyklem světlo/tma a měla neomezený přístup k vodě a standardní stravě, jak to schválila KSU Local Institutional Study Ethics Committee (REC) pod autorizačním číslem KSU-SE-19-122.

2.2. Experimentální design

Tento výzkum zkoumal celkem 32 samců potkanů ​​Wistar o hmotnosti 190-210 g, rozdělených do čtyř skupin. Krysy dostaly týden, aby se před studií adaptovaly na prostředí. Skupina vehikula, také známá jako kontrolní skupina, se skládala z krys, kterým byla podávána orální formulace normálního fyziologického roztoku. Skupinu II tvořili krysy, kterým byl 17. den podáván Dox (20 mg/kg ip jedna dávka) [11]. Krysám skupiny ⅢI a IV byly podávány profylaktické dávky geraniolu (orálně) 100 a 200 mg/kg, v daném pořadí, po dobu 18 dnů a v den 17 byly podobně podrobeny Dox (20 mg/kg, ip). V den 18 byly krysy usmrceny za použití kombinace ketamin/xylazin v kontrolovaném prostředí. Odebrala se krev a izolovalo se sérum a obě ledviny se vyjmuly a okamžitě rychle zmrazily v kapalném dusíku. Na zmrazených tkáních byly provedeny biochemické, genové a proteinové expresní testy. Pro histologické vyšetření byly vzorky ledvinové tkáně promyty v PBS a poté konzervovány ve 4% roztoku formaldehydu. V průběhu vyšetřování nebyly žádné známky utrpení nebo smrti u pokusného zvířete.

2.3. Stanovení markerů funkce ledvin

Pro izolaci séra z krve odebrané v době usmrcení byly vzorky krve odstřeďovány po dobu 10 minut při 2000 x g v předem chlazené odstředivce. Získané sérum bylo poté analyzováno pro kvantifikaci albuminu, dusíku močoviny v krvi (BUN) a kreatininu. Hodnotyfunkce ledvinmarkery byly vypočteny pomocí Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, USA.

2.4.Eohodnocení peroxidace lipidů

Peroxidace lipidů byla hodnocena v ledvinových tkáních, jak bylo popsáno dříve Ohkawa et al., s mírnými modifikacemi.

2.5. Kvantifikace redukovaného glutathionu

Hladiny redukovaného glutathionu (GSH) v renálním postmitochondriálním supernatantu (PMS) byly měřeny podle metody popsané Sedlakem a Lindsayem, s menšími úpravami.

2.6. Kvantifikace aktivity katalázy

Aktivita CAT u renálního PMS byla stanovena podle metody popsané Claibornem s menší modifikací.

2.7. Analýza genové exprese (RT-qPCR)

K extrakci celkové RNA z ledvinových tkání bylo použito činidlo TRIzolTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) podle pokynů výrobce. Čistota a množství extrahovaných vzorků RNA byly stanoveny pomocí spektrofotometru NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, USA). Izolovaná RNA byla poté reverzně transkribována do cDNA pomocí cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, USA) a genová exprese byla kvantifikována pomocí SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, USA) na Applied Biosystems 7500 Fast Real- Systém Time PCR. Přístup AACt byl poté použit ke stanovení relativní exprese různých genů mezi skupinami, přičemž GAPDH byl použit jako provozní gen. Tabulka 1 uvádí sekvence primerů použité v této studii (IDT, Leuven, Belgie).

2.8. Imunoblotová analýza

Analýza Western blot byla provedena tak, jak je popsáno v Alasmari et al. [41]. Stručně, izolované proteiny (30-50 ug) byly podrobeny elektroforéze na SDS-PAGE gelech a poté přeneseny na PVDF membrány. Po blokování 5% odtučněným sušeným mlékem po dobu 60 minut byly bloty sondovány přes noc při 4 stupních se selektivními primárními protilátkami (proti Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, štěpená kaspáza{{{ 14}}, Bcl-2, Bax a GAPDH, ředění 1:1000). Membrány byly následně promyty a poté inkubovány po dobu 60 minut při teplotě místnosti s vhodnými sekundárními protilátkami konjugovanými s HRP (ředění: 1:5000). K detekci přítomnosti proteinů na membráně byla použita reagenční souprava ECL a zařízení pro zobrazování na gelu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.9.Histopatologické studie

Tkáně ledvin byly dodatečně fixovány ve 4% formaldehydu a poté zpracovány pro parafinové řezy a barvení. Pro řezání parafinových řezů o tloušťce 3 μm byl použit mikrotom. Nařezané řezy byly poté ošetřeny, aby se odstranil vosk, a obarveny pomocí barviva hematoxylin plus eosin (H&E) pro histopatologické vyšetření. Histologické snímky ledvin byly získány pomocí kamery DP72 spojené s mikroskopem Olympus BX.

2.10. Analýza dat

Data byla analyzována pomocí počítačového programu Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, USA) a výsledky jsou prezentovány jako průměry a standardní odchylky (průměr ± SD). Rozdíly mezi skupinami byly vyhodnoceny pomocí jednosměrné ANOVA následované Tukeyho srovnávacím testem, přičemž p-hodnota menší než 0,05 ukazuje na statistickou významnost (p<>