Část 1: Účinek celkových diterpenoidů z Euphorbiae Ebracteolatae Radix proti zhoubnému ascitu lze připsat změnám akvaporinů prostřednictvím inhibice aktivity PKC v ledvinách

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: Tato studie hodnotila antiascitický účinek celkových diterpenoidů extrahovaných z Euphorbiae ebracteolate Radix (TDEE) na maligní ascitické myši a objasnila jeho základní mechanismus. TDEE byl extrahován dichlormethanem a podroben kolonové chromatografii. Čistota šesti diterpenoidů izolovaných z TDEE byla stanovena na 77,18 procent pomocí HPLC. TDEE (3 a 0,6 g syrových bylin/kg, po) snížil ascites a zvýšil výdej moči. Mezitím analýza životaschopnosti nádorových buněk, cyklu a apoptózy ukázala, že TDEE neměl žádnéprotinádorovéaktivita. Kromě toho hladiny exprese aquaporinů (AQP) a hladiny membránové translokace proteinkinázy C (PKC) a PKC vledvinya buňky byly měřeny. TDEE snížilo hladiny AQP1-4 a inhibovalo expresi PKC v membránové frakci. Čtyři hlavní diterpenoidy, kromě sloučeniny 2, snižovaly hladiny AQP1 v buňkách lidských ledvin-2. Sloučeniny 4 a 5 inhibovaly expresi AQP2-4 v buňkách vnitřního dřeňového sběrného kanálku myší. Diterpenoidem indukovaná inhibice exprese AQP1-4 byla blokována forbol-12-myristát-13-acetátem (PMA; agonista PKC). Diterpenoidy z TDEE jsou hlavními složkami proti ascitu. Antiascitický účinek diterpenoidů může být spojen se změnami AOP v ledvinách za účelem podpory diurézy. Inhibice exprese AOP1-4 pomocí TDEE souvisí s inhibicí aktivace PKC.

Klíčová slova: Euphorbia ebracteolate Hayata; diuréza; bioaktivní složky; terpenoidy; ledvinové buňky; PKC inhibitor

Kliknutím se dozvíte výhody bylin cistanche

1. Úvod

Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) je členem rodu Euphorbia v rodině Euphorbiaceae a je široce používán při léčbě abdominální distenze a edému, parazitární infekce, tuberkulózy a dalších onemocnění v tradiční čínské medicíně (TCM)[1]. Kořen EEH (EER) obsahuje různé terpenoidy, které jsou považovány za účinné složky. K jejich určení byly provedeny nedávné studie terpenoidůprotizánětlivé, antivirový,antituberkulóza a další účinky in vitro [2-5]. Základní výzkumy tradičních účinků EER při léčbě abdominální distenze a edému jsou však omezené. Podle teorie TCM může EER rychle eliminovat abdominální distenzi a edém podporou močení a průjmu [6]. Naše předchozí studie ukázaly, že celkové diterpenoidy z EER (TDEE) mohou způsobit průjem regulací exprese aquaporinu (AQP)-1 a AQP3 [7]. Dosud však zůstávají účinné látky anti-ascites v EER nejasné.

Abdominální distenze a edém jsou v moderní medicíně popisovány jako ascites. Ascites je patologické nahromadění peritoneální tekutiny [8]. Existuje mnoho příčin tvorby ascitu, jako je cirhóza, nádor, srdeční selhání a nefrotický syndrom [9]. Výskyt ascitu souvisí s portální hypertenzí, která vede ke splanchnické arteriální vazodilataci, snížení efektivního cirkulujícího objemu, aktivaci endogenních vazokonstrikčních systémů a náruživé retenci vody v ledvinách [10]. AQP jsou rychlé membránové transportéry vody pro překonání epiteliálních a endoteliálních bariér a hrají tak zásadní roli při udržování vodní rovnováhy [11]. Četné studie prokázaly, že AQP hrají klíčovou roli při vzniku a poruchách ascitu [12-15]. V ledvinách je mnoho druhů AQP, jako AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4[16]. Protože TDEE může regulovat expresi AQP ve střevě [7], navrhujeme, aby TDEE bylo možné využít při léčbě ascitu regulací AQP v ledvinách.

AQP hrají kritickou roli při tvorbě moči, avšak mechanismy regulace exprese AQP v ledvinách nebyly objasněny. V současné době pouze omezený počet zpráv naznačuje, že AQP jsou regulovány prostřednictvím drah proteinkinázy C(PKC) a proteinkinázy A(PKA) [17-20]. Některé terpenoidy izolované z Euphorbia (např. uphold a ingenol 3-angelate) mají regulační účinky na PKC. TDEE může regulovat expresi AQP v ledvinách cestou PKC.

V této studii jsme extrahovali TDEE a hodnotili jeho anti-ascitický účinek a také analyzovali expresi AQPs, PKC a PKA aktivity v ledvinách ascitických myší. Poté jsme izolovali a purifikovali hlavní diterpenoidy z TDEE, abychom prozkoumali jeho účinky na hladiny exprese proteinu AQPs a mRNA ve dvou druzíchledvinové buňky(buňky lidských ledvin-2 (HK-2) a buňky vnitřního sběrného dřeňového kanálku myší (mIMCD3)). Nakonec vybereme diterpenoidní sloučeninu (eufebrakteolatin A) pomocí forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA; agonista PKC) k aktivaci PKC dráhy, abychom zjistili, zda je exprese AQP v ledvinách regulována cestou PKC. Cílem této studie bylo určit antiascitický účinek TDEE u EER a poskytnout základ pro klinickou aplikaci EER a identifikaci kandidátních léků pro diurézu a antiascitické účinky.

2. Výsledky

2.1. Účinky TDEE na hmotnost ascitické tekutiny, hmotnost moči a obsah fekální vody

Léčba ascitických myší celkovým extraktem EER (TEER) a TDEE (3 a 0,6 g syrových bylin/kg, po) a furosemidem (pozitivní lék) významně snížila nárůst hmotnosti ascitické tekutiny ve srovnání s modelem skupina (obrázek 1A). Obrázek 1C ukázal, že moč významně váží (str<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. Účinky TDEE na hladiny sérového albuminu u ascitických myší

Sérový albumin je nejhojnější protein v plazmě obratlovců a může udržovat osmotický tlak krve a regulovat transport vody. Obrázek 1B ukazuje, že produkce ascitu u modelových myší způsobila významný pokles sérového albuminu ve srovnání s normální skupinou. Po ošetření furosemidem, TEER a TDEE (3 a 0,6 g syrových bylin/kg, po) byly hladiny sérového albuminu účinně obnoveny ve srovnání s modelovou skupinou. Žádné zlepšení tohoto indexu nebylo pozorováno ve skupinách NTDEE.

2.3. Účinky TDEE na životaschopnost, cyklus a apoptózu nádorových buněk u ascitických myší

U maligního ascitu nádorové buňky plavou v ascitické tekutině. Hodnotili jsme, zda snížení ascitu souvisí s protirakovinnou aktivitou TEER a TDEE. Výsledky ukázaly, že tyto léky neinhibovaly životaschopnost nádorových buněk (obrázek 2A) a nevedly k zastavení buněčného cyklu (obrázek 2B) a apoptóze (obrázek 2C, D).

2.4. Účinky TDEE na expresi AQP v ledvinách ascitických myší

Ledviny jsou důležitým orgánem pro reabsorpci vody a koncentraci moči. Vodní kanály AQP zprostředkovávají rychlý transport vody v ledvinách. Zkoumali jsme tedy expresi AQP v ledvinách. Obrázek 3 ukázal, že zvýšení ascitu mělo malý vliv na expresi AQP v ledvinách ve srovnání s normální skupinou. Při léčbě TEER a TDEE byla exprese proteinů AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 výrazně nižší než v modelové skupině při většině dávek. TEER vedl k významnému snížení exprese AQP2, AQP3 a AQP4 při dávkách 3.0 a {{10}},6 g syrových bylin/kg, zatímco exprese AQP1 byla snížena pouze při nízká dávka (0,6 g syrových bylin/kg). Je pozoruhodné, že TDEE měl stejné inhibiční účinky na expresi AQP3 a AQP4 jako TEER ve dvou dávkách. Rozdíl mezi TDEE a TEER spočívá v tom, že TDEE inhiboval expresi AQP1 a AQP2 pouze ve vysoké dávce (3 g syrových bylin/kg). NTDEE měl slabé účinky na hladiny AQP v ledvinách a reguloval expresi proteinu AQP4 pouze v dávce 3 g syrových bylin/kg.

2.5. Účinky TDEE na aktivaci PKC a PKA v ledvinách ascitických myší

Předchozí studie ukázaly, že exprese AQPs by mohla být regulována aktivací PKC a PKA. Zkoumali jsme účinky TDEE na aktivaci PKC-a, PKC- a PKA. Aktivace PKC byla měřena její translokací z cytosolu do buněčné membrány. Jak je ukázáno na obrázcích 4A a B, hladina exprese proteinu PKC- v membránové frakci byla významně snížena ve skupinách TDEE, zatímco nebyl žádný významný účinek na hladinu exprese membránového proteinu PKC-. Fosfolipáza C(PLC) je důležitá upstream signální molekula, která zprostředkovává aktivaci PKC. Léčba TDEE neměla žádný vliv na hladiny fosforylované a celkové PLC (obrázek 4D). PKA je heterotetramer sestávající ze dvou katalytických podjednotek vázaných na dvě regulační podjednotky. Uvolnění katalytických podjednotek je charakteristickým znakem aktivace PKA. Na obrázku 4C TDEE neovlivnil expresi katalytických podjednotek PKA.

2.6. Stanovení obsahu šesti diterpenoidů v TDEE pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC)

Výsledky pokusů na zvířatech ukázaly, že TDEE byl hlavní účinnou složkou EER. Z TDEE jsme izolovali šest diterpenoidů (struktury sloučenin 1 až 6 jsou znázorněny na obrázku 5; spektrální data byla přidána do doplňkového materiálu) a tyto sloučeniny jsme použili jako standardy pro stanovení obsahu diterpenoidů v TDEE. HPLC chromatogramy pro TDEE a šest standardů diterpenoidů jsou uvedeny na obrázku 6. Obsah sloučenin 1 až 6 byl 1,07 procenta, 12.00 procent, 12,69 procenta, 9,15 procenta, 39,26 procenta a 3,02 procenta. pro 77,18 procenta TDEE.

2.7. Účinky diterpenoidů z TDEE na expresi AQP v buňkách ledvin

TDEE byla aktivní frakce EER, která inhibovala ascites snížením exprese AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v ledvinách. Současně TDEE také významně snížila expresi proteinů a mRNA AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 v buňkách lidských ledvin-2 (HK-2) a myších buňkách vnitřního medulárního sběrného kanálku (mIMCD3) (Obrázek 7). Hlavními složkami TDEE jsou diterpenoidy. Porovnali jsme účinky mezi TDEE a směsí diterpenoidů (šest izolovaných diterpenoidů bylo smícháno podle jejich obsahu v TDEE). Výsledky ukázaly, že inhibiční účinky směsi diterpenoidů a TDEE na expresi AQP1, AQP2, AQP3 a AQP4 byly podobné (obrázek 7). In vitro byly hodnoceny aktivity čtyř hlavních diterpenoidů z TDEE. Obrázky 8 a 9 ukázaly, že hladiny exprese proteinu a mRNA AQP1 v buňkách HK-2 byly významně sníženy sloučeninami 3, 4 a 5. Ošetření sloučeninou 2 nevyvolalo výrazné snížení AOP1 na proteinu a mRNA úrovně. U těchto sloučenin byla sloučenina 3 (diterpenoid ent-abietanového typu) aktivnější než ostatní sloučeniny. V buňkách mlMCD3 vyvolaly čtyři diterpenoidní sloučeniny různé stupně inhibice exprese AQP2, AQP3 a AQP4. Výsledky exprese proteinu a genu jsou uvedeny na obrázcích 8 a 9. Sloučeniny 4 a 5 měly silné inhibiční účinky na AQP2, AQP3 a AQP4 ve srovnání s kontrolní skupinou na úrovni genu a proteinu. Sloučeniny 2 a 3 pouze vykazovaly různé účinky na expresi mRNA Aqp2, Aqp3 a Aqp4.

2.8. Účinky aktivátoru PKC na diterpenoidy indukovanou inhibici AQP

Výsledky experimentu na zvířatech ukázaly, že TDEE současně inhiboval aktivitu PKC a expresi AQPs v ledvinách myší nesoucích nádorové buňky H22. Aby se dále objasnilo, zda PKC reguluje expresi AQP v ledvinových buňkách, byl agonista PKC (PMA) předem ošetřen v buňkách HK-2 a mIMCD3 1,5 hodiny před stimulací diterpenoidu (Euphebracteolatin A). Byla detekována změna membránové exprese PKC, AOP1, AOP2, AOP3 a AOP4. Výsledky Western Bolt ukázaly, že eufebrakteolatin A by mohl snížit proteinovou expresi membránových PKC, AOP1, AOP2, AOP3 a AOP4 a účinky by mohly být zmírněny předúpravou PMA (obrázek 10).