Část Ⅰ Účinky dietních bílkovin a vlákniny na výkonnost růstu, výskyt dny, střevní mikrobiální komunity a imunoregulaci v ose Gutkidney u housat

Abstraktní

Současná studie hodnotila účinky hladin bílkovin a vlákniny ve stravě na růstovou výkonnost, výskyt dny, střevní mikrobiální komunity a imunoregulaci v ose střevo-ledviny housat. Byl přijat zcela randomizovaný faktoriální design 2 £ 3 se 2 úrovněmi CP (180 [18CP] a 220 [22CP] g/kg) a 3 úrovněmi hrubé vlákniny (CF) (30 [nízká CF], 50 [střední CF], a 70 [vysoký CF] g/kg). Diety s vysokým CP nebo nízkým CF predisponovaly housata ke dně. Diety s vysokým obsahem bílkovin zhoršily funkci ledvin; sérové ​​koncentrace UA a Cr, stejně jako aktivita XOD u 9-denních housat krmených 22% CP dietou, byly významně zvýšeny. Ačkoli hladiny CF od 3 do 7 procent přímo neovlivnily zdraví ledvin, zvýšení hladiny CF by mohlo urychlit nárůst probiotik ve slepém střevě housat a zadržet škodlivé bakterie, zmírnit střevní dysbiózu způsobenou dietami s vysokým obsahem bílkovin. Analýza cekální mikroflóry prostřednictvím sekvenování 16Sr RNA odhalila, že abundance Enterokoka ve skupině 22CP byla vyšší než ve skupině 18CP, ale klesala se zvyšujícími se hladinami CF v den 9. Množství Lactobacillus se zvyšovalo se zvyšujícími se hladinami CF. Kromě toho vyšší koncentrace LPS a prozánětlivých cytokinů v séru a zvýšená hladina exprese mRNA v tkáních slepého střeva, mandlí a ledvin naznačovaly, že diety s vysokým obsahem bílkovin by mohly aktivovat dráhu TLR4/MyD88/NFkB a vyvolat zánět střev a ledvin u mladých housat. Bylo zjištěno, že koncentrace LPS v séru v d 9 klesají se zvyšující se CF, ačkoli změna hladin CF v potravě přímo neovlivnila sérové ​​imunitní indexy housat. Závěrem lze říci, že dieta s vysokým CP měla negativní vliv na výskyt dny, mikrobiální komunity a imunoregulaci v ose střevo-ledviny housat, zatímco vhodně zvýšené hladiny vlákniny ve stravě pomáhaly udržovat střevní rovnováhu a snižovaly koncentraci LPS v séru. Jako optimální kombinaci pro krmivo pro housata navrhujeme dietu s 18 procenty CP ve spojení s 5 procenty CF.

Klíčová slova

hrubá vláknina, protein, husí dna, střevní mikrobiální komunity, osa střevo-ledviny,Výhody Cistanche.

Chcete-li to vědět, klikněte semjaké jsou účinky Cistanche na ledviny

Úvod

Husy, které jsou býložravé, závisí na vláknině, aby mohly vykonávat běžné činnosti. Je známo, že mírné hladiny hrubé vlákniny (CF) ve stravě zvyšují odolnost vůči chorobám a podporují růst drůbeže tím, že modulují střevní mikroekologickou rovnováhu a posilují imunitní funkce (Jha a Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). uvedli, že zahrnutí dietního pektinu zvýšilo expresi IL- 12 v ileální sliznici a zvýšilo produkci interferonu-g ve slepých mandlích. Několik studií ukázalo, že dieta s nízkým CF snižuje mikrobiální diverzitu a také relativní množství prospěšné mikroflóry u husích slepých střev v 70. den, čímž negativně ovlivňuje růstovou výkonnost, využití živin a imunitu střevní sliznice u těchto hus (Li et al., 2017; Li a kol., 2018a). Dietní CF může pomoci udržet funkci střevní bariéry posílením struktury a funkce sliznice a také zvýšením populace a diverzity komenzálních bakterií v gastrointestinálním traktu. Ještě důležitější je, že mladí ptáci jsou údajně citlivější na změny ve stravě živin a střevních mikrobiálních komunit než dospělí (Gao et al., 2017). Studie o vlivu dietních hladin CF na střevní mikroflóru a odolnost vůči chorobám u housat jsou však vzácné.

Růstová výkonnost ptáků je méně citlivá na změny v hladinách bílkovin než na změny dietní energie v krmivu, aby uspokojila jejich původní volní povahu (Shi et al., 2006). Bylo hlášeno, že nebyl pozorován žádný významný rozdíl v přírůstku hmotnosti u hus s hladinami bílkovin v potravě v rozmezí od 16 do 22 procent, což se zdá být příliš obecné (Summers et al., 1986). Naopak koncentrace bílkovin ve stravě mají silný vliv na rovnováhu střevní flóry a odolnost vůči chorobám u drůbeže (Lee et al., 2020). Viscerální dna, která se vyskytuje hlavně u ptáků, je metabolické onemocnění způsobené poruchou funkce ledvin, po které následuje akumulace krystalů urátů v různých orgánech (Zhang et al., 2018). Naše předchozí studie ukázala, že diety s vysokým obsahem bílkovin se podílejí na poškození ledvin a dysbióze střevní mikroflóry spojené s dnou u housat (Xi et al., 2020a). Výsledky této studie ukázaly, že ve srovnání s housaty krmenými 16 a 18 procenty surových proteinů (CP) trpěla housata krmená 22 procenty stravy CP poraněním střevních epiteliálních buněk a dysbiózou cekální mikroflóry, což vedlo k poškození ledvin nebo dokonce dně hus. Zdá se, že mikrobiota gastrointestinálního traktu a její metabolity hrají ústřední roli při posilování imunity osy střevo-ledviny u drůbeže (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). Identifikace vhodného nutričního programu, který se zaměřuje na účinky dietních hladin CF a CP, může pomoci minimalizovat výskyt dny a posílit imunitu udržováním střevní mikroekologické rovnováhy a zlepšením relativní imunitní regulace u housat.

Střevní mikrobiom má výrazný vliv na imunitní regulaci střev, což ovlivňuje systémovou imunitu a přispívá k imunitní rovnováze. Změny ve složení stravy, včetně hladin CP a CF, ovlivňují složení a metabolické aktivity mikrobioty, které se přizpůsobují střevnímu prostředí (Liu et al., 2014). U drůbeže může jakékoli narušení mikrobiomu vyvolat nerovnováhu v systémové imunitě, což přispívá ke snížení odolnosti vůči chorobám. V naší předchozí studii jsme zjistili, že dysbióza střevní mikroflóry zvyšuje riziko viscerální dny u housat zvýšením zánětu a také translokací lipopolysacharidu odvozeného ze střeva (LPS) v ose střevo-ledviny. V této komplexní kaskádě ligace LPS aktivuje nukleární faktor, kappa-light-chain-enhancer aktivované dráhy B buněk (NF-kB) a produkci prozánětlivých cytokinů, jako je interleukin 1b (IL1b) a tumor nekrotizující faktor a (TNFa), čímž podporuje rozvoj imunologické tolerance jak ve střevě, tak v ledvinách housat (Xi et al., 2019). Tato studie se zaměřila na zkoumání mikrobiálních komunit obývajících slepé střevo housat krmených různými úrovněmi dietní CP a CF a měřila změny ve výskytu dny pomocí analýzy imunoregulace a zánětlivých reakcí indukovaných v ose střevo-ledviny.

Standardizované Cistanche

Materiály a metody

1. Etické schválení

Studie byla schválena Výzkumným výborem Akademie zemědělských věd Jiangsu a provedena v souladu s Předpisy správy záležitostí týkajících se experimentálních zvířat (příkaz č. 63 Akademie zemědělských věd Jiangsu ze dne 8. července 2014). Všechny experimenty byly prováděny podle pokynů ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments).

2. Experimentální design

Tato studie byla provedena od 2. do 17. listopadu 2020 v Centru experimentálních zvířat Akademie zemědělských věd Jiangsu (Nanjing, Čína). Celkem 1,620 jednodenních hus Taizhou (Anser domestica, 100 procento), dodaných společností Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, Čína) bylo náhodně přiděleno 6 experimentálních skupin. Každé ošetření mělo 6 replikátů a každý replikát obsahoval 45 ptáků. Pro experiment byl použit zcela náhodný faktoriální design 2 £ 3. Bylo připraveno šest diet se 2 úrovněmi CP a třemi úrovněmi CF (tabulka 1). 2 úrovně CP byly 180 (18CP) a 220 (22CP) g/kg a tři úrovně CF byly 30 (nízká CF), 50 (střední CF) a 70 (vysoká CF) g/kg. Všechna housata byla chována v termostatickém domku s nerezovými klecemi stejné velikosti (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 housat na klec, hustota chovu: 7,5 ptáků/m2), které byly umístěny 0,50 m nad zemí. Housata byla krmena za standardních podmínek hospodaření peletovým krmivem a vodou ad libitum. Počet závěsných krmítek a napáječek na bradavky v každé kleci byl během studie dostatečný. Okolní teplota byla udržována na 30 stupních od d 0 do 3, 29 stupních od d 4 do 6, 28 stupních od d 7 do 9 a 26 stupních od d 10 až do konce experimentu. Relativní vlhkost během 21- experimentálního období byla přibližně 60 procent. Světelné zdroje (bílé světlo, 400 −760 nm) byly vyrovnány na osvětlení 15 až 0,3 luxu na úrovni hlavy ptáka, se světelným plánem 22 h světla od d 0 do 3, 18 h světla od d 4 až 14 a 16 h světla od d 15 do 21 v 24-h cyklu.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 procento čerstvého krmiva) náhodně získané z 5 míst bylo smícháno pro analýzu. CP a CF byly měřeny podle GB/T6432 (čínský národní standard: Stanovení hrubého proteinu v krmivu) a GB/T6434 (čínský národní standard: Stanovení hrubé vlákniny v krmivu).

ADFI a BW (živá hmotnost) housat byly zaznamenány pomocí elektronické váhy (YP60001, Hengji, Shanghai, Čína) před krmením během testu a ADG a poměr konverze krmiva (FCR) byly vypočteny na konci experimentu. Kromě toho byla po experimentálním období sečtena kumulativní morbidita dny všech replikátů (každý replikát obsahoval 45 ptáků) mezi různými léčbami. Selekční standard pro dnu byl definován jako housata vykazující velké léze ledvin a koncentraci kyseliny močové v séru (UA) nad hraniční hodnotou přesycení urátů (samci 416 mmol/l a samice 357 mmol/l). Typické převládající makroskopické léze ledvin jsou bledé, skvrnité a oteklé a renální tubuly a močovody jsou roztažené s nadbytkem urátů (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Měření metabolitů v séru

Třicet šest housat (n=6 housat/léčba) bylo náhodně vybráno pro okamžitý odběr krve (5 ml/housa) po dekapitaci pomocí zkumavek pro odběr krve bez antikoagulantu v den 9 a 18, v daném pořadí. Všechny krevní vzorky byly inkubovány při 37 stupních po dobu 2 hodin po odběru a centrifugovány při 1,5{{10}}0 £ g po dobu 15 minut. Získaná séra byla skladována v 0,6 ml Eppendorfových zkumavkách při 80 stupních až do další analýzy. Hladiny UA v séru byly stanoveny pomocí kolorimetrie kyseliny fosfowolframové. Koncentrace kreatininu (Cr) a močovinového dusíku (UN), stejně jako aktivita xanthinoxidázy (XOD) byly stanoveny pomocí enzymatické kolorimetrie za použití mikrodestičkového spektrofotometru (Promega Corporation, Madison, WI). Tyto soupravy dodal Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína); kódy byly C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) a A002 (XOD). Koncentrace IgM, IgA a IgG v séru u experimentálních hus byly měřeny pomocí souprav husího imunoglobulinu ELISA zakoupených od Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Čína). Koncentrace sérových cirkulujících imunitních komplexů (CIC), IL-1b a TNF-a byly stanoveny pomocí komerční soupravy ELISA pro husy (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína). Aktivita diaminoxidázy (DAO) byla měřena pomocí enzymatické kolorimetrie pomocí automatického biochemického analyzátoru (Hitachi, Tokio, Japonsko). Sérový LPS byl měřen pomocí tradičního testu Limulus (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, Čína). Detekční rozsahy LPS v testu Limulus se pohybovaly od 0,015 do 0,6 EU/ml. Všechny materiály použité pro odběr krve a měření endotoxinů byly apyrogenní. Všechny testy byly provedeny podle pokynů výrobce. Vzorky séra byly testovány v triplikátech. Variační koeficienty uvnitř a mezi testy pro testy byly<10% and <15%, respectively.

4. Histomorfologické pozorování

Céka (délka {{0}} cm) 36 housat (n=6 housat/léčba) byla odebrána po odběru vzorku krve v 9. a 18. den pro histologickou analýzu. Vzorky odebrané od housat byly fixovány ve 4% paraformaldehydu, zality v parafínu a nařezány (tloušťka řezu: 3 mm; 4 řezy na housa). Patologické změny ve slepém střevě (přibližně 7 cm distálně od pylorického svěrače) byly zkoumány pod světelným mikroskopem (OLYMPUS, Tokio, Japonsko) po barvení hematoxylinem a eosinem (HE). Výška klků a hloubka krypt slepého střeva byly měřeny pomocí softwaru ImageJ (verze 1.8.0; National Institutes of Health, Bethesda, MD). Bylo zaznamenáno osm měření různých intaktních klků na řez (8 měření ve 3 po sobě jdoucích zorných polích). Statistické analýzy histologických měření byly provedeny na základě průměru 32 měření na housa (4 řezy na housa a 8 měření na řez). Hustota pohárkových buněk byla vypočtena jako počet pohárkových buněk dělený odpovídající délkou klků, která byla poté zprůměrována a vyjádřena jako počet pohárkových buněk na 100 mm délky klků.

Cistanche tubulosa

5. 16S rRNA sekvenování obsahu céka

Obsah slepého střeva housat (6 housat/ ošetření £ 6 skupin £ odběr vzorků dvakrát=72 housat) byl odebrán dne 9 a 18 ve 2ml sterilních kryogenních lahvičkách s vnitřním závitem a okamžitě uložen v kapalném dusíku pro analýzu 16S rDNA . DNA ze vzorků obsahu slepého střeva byla extrahována pomocí soupravy MicroElute Genomic DNA Kit (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) podle pokynů výrobce. Slepé vzorky sestávající z nepoužitých tamponů byly zpracovány extrakcí DNA a byly zkontrolovány, zda nevytvářejí 16S amplikon. Celková DNA byla eluována v 50 ml elučního pufru za použití modifikovaného postupu popsaného výrobcem (QIAGEN, Dusseldorf, Německo) a skladována při 80 stupních.

S použitím celkové DNA vzorků jako templátu a 16S rDNA primerů (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30) jsme amplifikovali oblast V3–V4 bakteriální 16S rRNA. Všechny reakce byly provedeny ve 25 ml (celkový objem) směsi obsahující 25 ng extraktu genomové DNA, 12,5 ml PCR premixu, 2,5 ml každého primeru a vodu v kvalitě PCR pro úpravu objemu. Produkty PCR byly normalizovány pomocí AxyPrep Mag PCR Normalizer (Axygen Biosciences, Union City, CA), což umožnilo přeskočit krok kvantifikace, bez ohledu na objem PCR předložený k sekvenování. Amplikonové pooly byly připraveny pro sekvenování pomocí kuliček AMPure XT (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; provedl OebioTech Co., Ltd, Shanghai, Čína). Velikost a množství amplikonové knihovny byly hodnoceny pomocí LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) a Kapa Library Quantification Kit pro Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA). Knihovna PhiX Control (v3) (Illumina) byla kombinována s amplikonovou knihovnou (očekává se 30 procent). Knihovna byla shlukována při hustotě přibližně 570 K/mm2. Knihovny byly sekvenovány na 300PE MiSeq běhech, kde jedna knihovna byla sekvenována oběma protokoly s použitím standardních Illumina sekvenačních primerů, čímž se eliminovala potřeba čtení třetího (nebo čtvrtého) indexu. Odečty byly filtrovány pomocí kvantitativních náhledů na kvalitní filtry mikrobiální ekologie (QIIME;). Potrubí CDHIT bylo použito k výběru provozních taxonomických jednotek (OTU) přípravou tabulky OTU. Sekvence s 97procentní podobností byly přiřazeny OTU. Pro každou OTU byly vybrány reprezentativní sekvence a taxonomická data pak byla přiřazena každé reprezentativní sekvenci pomocí klasifikátoru Ribosomal Database Project (RDP). Přírůstkové číslo GenBank těchto nukleotidových sekvencí OTU je SAMN21014082. Pro odhad alfa diverzity byla tabulka OTU zpřesněna a byly vypočteny následující 4 metriky: metrika Chao1 pro odhad bohatosti; metrika pozorovaných druhů jako počet jedinečných OTU nalezených ve vzorku; Shannonův index; a Simpsonův index.

6. Real-Time PCR

ing. (n {{0}} housat/ošetření) byly shromážděny v den 9 a 18 pro analýzu PCR v reálném čase (RT-PCR). Celková RNA byla extrahována z tkání pomocí činidla TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) a reverzně transkribována pomocí soupravy Reverse Transscription Levels (TaKaRa, Dalian, Čína) podle protokolu výrobce. b-aktin byl použit jako invariantní kontrola. Primery byly navrženy pomocí softwaru Primer Premier 5.0 a jejich sekvence jsou uvedeny (tabulka 2). RT-PCR byla provedena za použití SYBR Premix Ex Taq (Roche, Basel, Švýcarsko). Všechny RT-PCR byly provedeny trojmo. Relativní úrovně exprese cílových genů byly stanoveny pomocí 2 DDCt metod.

7. Analýza dat

Experimentální data odvozená ze 6 replikátů na ošetření byla analyzována pomocí programu IBM SPSS Statistics 16 (IBM Corporation, Somers, NY). Každý replikát byl považován za experimentální jednotku a použitým statistickým postupem byla vícerozměrná analýza rozptylu za použití postupu obecného lineárního modelu (GLM). Když byly stanoveny významné rozdíly, léčebné prostředky byly odděleny a porovnány pomocí Duncanova testu s více rozsahy. Dvoustranný test byl považován za statisticky významný na úrovni pravděpodobnosti nižší než 5 procent (P < 0,05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang, y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * a Zhendan Shi *.

* Klíčová laboratoř pro integrované zemědělství plodin a zvířat Ministerstva zemědělství a venkova, Animal Husbandry Institute, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Čína;

# College of Animal Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510000, Čína.