ČÁST Ⅰ: Podávání synbiotického kmene Lactobacillus Bulgaricus 6c3, inulin a fruktooligosacharid snižuje koncentraci indoxylsulfátu a poškození ledvin
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales, JoseS.Merino, Sindy T.Diaz-Castillo & et al.
1. Úvod
Chronické onemocnění ledvin(CKD) se považuje za trvalou změnuledvinastruktura, její funkce nebo v nejzávažnějších případech obojí. CKD přímo ovlivňuje zdraví a kvalitu života jedince [1,2]. Na fyziologické úrovni jsou často pozorovanými změnami způsobenými CKD zvýšené sérové hladiny kreatininu, cystatinu Cor ureic dusíku [2]. Intenzivnější dohled a informovanost v populaci zvýšily diagnózy CKD, které dosáhly například toho, že bylo zjištěno, že touto patologií je postiženo 15 procent populace USA [3]. Progrese onemocnění, stejně jako účinky výše uvedených metabolitů, mají vážný dopad na více systémů těla, včetně kardiovaskulárního a gastrointestinálního systému, protože přítomnost těchto metabolitů je spojena se zvýšenou úmrtností v prvním a ovlivnění asimilace, motility a permeability u posledně jmenovaných [4,5]. Gastrointestinální změny vyvolávají zvýšenou absorpci metabolitů ve střevě, což přispívá k udržení systémového zánětu, který následně ovlivňuje složení normální mikrobioty a její metabolické funkce a může způsobit střevní dysbiózu [6].
Kliknutím zobrazíte vedlejší účinky cistanche a přípravek Cistanche na ledviny
Souvislost mezi CKD a intestinální dysbiózou nemusí být vysvětlena pouze změnami ve stravě, ale kromě toho také zvýšením luminálního pH, sekundárním ke zvýšené koncentraci amonia [7]. Pacienti s chronickým onemocněním ledvin v konečném stádiu mají ve srovnání se zdravými jedinci výrazné rozdíly v množství několika bakteriálních taxonů ve stolici [8]. Zejména na úrovni bakteriálního rodu vykazují pacienti s CKD nárůst Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella a Allobaculum a pokles Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactocobacillus, Lactocobacillus , Leuconostoc, Alkaliphilus a Pseudomonas [9-11]. Buď špatnou renální depurací nebo střevní dysbiózou dochází k úbytku bakteriálních rodů schopných metabolizovat a inhibovat patogeny produkující toxické metabolity, což má za následek jejich nárůst [12]. Wong a kol. [8] prokázali, že pacienti trpící pokročilým CKD vykazovali nárůst bakteriálních skupin majících enzymy, jako je ureáza, urikáza a ty, které produkují p-kresol a indol.
Akumulace uremických retenčních metabolitů (URM) v krvi, včetněindoxylsulfát(IS), p-kresylsulfát (pCS), triethylamin a trimethylamin-N-oxid (TMAO)[5] jsou postulovány jako akcelerátory CKD [13]. JE(Indoxylsulfát), nejznámější uremický indol, je vylučován proximálními stočenými tubulyledvinaa pochází z metabolismu tryptofanu bakteriální tryptofanázou. Důkazy ze zvířecích modelů ukazují, že IS(Indoxylsulfát)může ovlivnit funkci ledvin a může poškodit buňky tubulů, což generuje oxidační stres v endoteliálních buňkách, inhibuje opravné mechanismy a podporuje intersticiální tubulární fibrózu, protože zvyšuje genovou expresi TGF{0}}, tkáňového inhibitoru metaloproteináz (TIMP -1) a kolagenu [14]. Nicméně nerovnováhu střevní mikrobioty a současnou produkci toxických metabolitů lze upravit. Bylo popsáno, že suplementace určitými probiotiky a prebiotiky může snížit produkci určitých uremických toxinů a obnovit normální mikrobiotu [5]. Metaanalytické studie například došly k závěru, že u pacientů s CKD, kteří dostávali suplementaci probiotickými kmeny, se zvýšily jejich protizánětlivé cytokiny a snížily hladiny uremických toxinů [15,16]. Některé studie uvádějí, že podávání synbiotik, kombinace probiotik a prebiotik, může s příznivými výsledky snížit progresi CKD [12]. V kontextu této práce jsou fruktany inulinového typu relevantními prebiotiky, protože prokázaly jejich schopnost snižovat progresi CKD [17] a snižovat URM, jako jsou pCS a IS(Indoxylsulfát)[18]. Panza a kol. (2017) podávali probiotika L.acidophlilus a Bifidobacterium longum plus fruktooligosacharidy (FOS) u pacientů ve stádiu 2-5 CKD a uvedli, že neléčení pacienti měli významně vyšší pCS a jsou(Indoxylsulfát)v krvi než u pacientů, kteří podstoupili synbiotickou léčbu [19]. V této práci jsme nejprve hodnotili schopnost probiotických kmenů snižovat IS(Indoxylsulfát)in vitro vybrat ten nejslibnější. Poté byl tento kmen kombinován s prebiotiky inulinem a fruktooligosacharidy (FOS), aby se získalo domnělé synbiotikum. Tato prebiotika byla vybrána, protože prokázala, že mohou snížit pCS a IS(Indoxylsulfát)koncentrace v krvi [17,18]. Nakonec byla účinnost domnělého synbiotika testována in vivo hodnocením krevního IS(Indoxylsulfát)a hladiny kreatininu aledvinaa poškození srdce za použití krysího modelu (krysy Sprague-Dawley), včetněledvinadeficitní (nefrektomizovaná) a neléčená zvířata.
2. Výsledky
2.1.Isolace kmenů schopných snížit IS(Indoxylsulfát)In Vitro
Z 36 vzorků mléčných výrobků bylo izolováno 84 kmenů na MRS agaru doplněném bromfenolovou modří (MRS-BFB), použitém jako diferenciální médium. Toto médium umožňuje diferenciaci bakterií mléčného kvašení. Při pH 3 budou kolonie zbarveny žlutě a při pH blízkém 5 budou zbarveny modře [19]. Všech 84 izolovaných kmenů bylo testováno in vitro za účelem stanovení jejich schopnosti zprostředkovat redukci IS(Indoxylsulfát). K tomu byly kmeny kultivovány v MRS bujónu doplněném 2,8 mM IS(Indoxylsulfát)po dobu 48 hodin a poté IS(Indoxylsulfát)byla měřena vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Kmeny lc2, 6c3 a VIc2 byly schopny významně snížit (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Indoxylsulfát)vyhodnotit, zda při snižování invazivních druhů působily synergicky(Indoxylsulfát). Když byly všechny tři kmeny kultivovány společně v přítomnosti IS(Indoxylsulfát), koncentrace IS(Indoxylsulfát)bylo také významně sníženo, ale méně než bylo dosaženo samotnými kmeny, což vylučuje možnost synergické aktivity (tabulka 1).
Stůl 1.Snížení in vitro, pokudindoxylsulfát(IS), se hodnotí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC), zprostředkovanou bakteriálními kmeny.
2.2. Identifikace vybraných kmenů
Tyto tři kmeny byly vybrány na základě jejich schopnosti snižovat IS(Indoxylsulfát)byly identifikovány sekvenováním 16S rRNA po PCR amplifikaci DNA. Kmen 1c2 byl grampozitivní řetězec tvořící kokus, který se v molekulární analýze amplifikoval s LacZ primery pro Streptococcus thermophilus. Kmeny 6c3 a VIc2 byly oba gram-pozitivní bacily a byly amplifikovány LbG primery pro identifikaci rodu Lactobacillus. Analýza sekvenování 16SrRNA umožnila identifikovat kmen lc2 jako Streptococcus thermophilus (97,3 procent podobnosti; přístupové číslo: AY188354.1), kmen 6c3 jako Lactobacillus bulgaricus (99,7 procenta podobnost; přístupové číslo: CR954253 jako kmen Lacocillus VIc 99,5% podobnost; Přístupové číslo: AY773947.1). Pouze jeden ze tří kmenů byl vybrán pro přípravu synbiotika a pro provedení následujících testů. Kmen Streptococcus thermophilus 1c2 byl vyřazen, protože vykazoval nízkou rychlost růstu. Ze zbývajících dvou kmenů byl vybrán kmen Lactobacillus bul-garicus 6c3, protože vykazoval lepší probiotickou funkčnost a bezpečnostní charakteristiky než kmen Lactobacillus acidophilus VIIc2.
2.3. Vliv synbiotika na krevní kreatinin a IS(Indoxylsulfát)úrovně
Probiotikum L. bulgaricus 6c3 bylo lyofilizováno ve spojení s prebiotiky Inulinem a FOS, což byla koncentrace probiotika 10 stupňů CFU/g lyofilizovaného produktu. 10 gramů synbiotika bylo podáváno denně v pitné vodě skupině nefrektomizovaných krys Sprague-Dawley (Lac) léčených synbiotikem. Nefrektomizovaná neléčená skupina (Nef) a nefrektomovaná kontrolní skupina nedostaly synbiotikum. Sérový kreatinin a IS(Indoxylsulfát)hladiny krys byly měřeny pomocí HPLC na začátku (jeden týden po nefrektomii) a na konci testu. Kromě toho byly zaznamenány hematokrity zvířat všech skupin. Variace hladin sérového kreatininu na konci testu byly významně odlišné (str<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Indoxylsulfát)hladiny se signifikantně zvýšily pouze ve skupině Nef odpovídající nefrektomovaným (renálním deficitním) zvířatům, kterým nebylo podáno synbiotikum (38,8 procenta) (p<0.05).>(Indoxylsulfát)hladiny ukázaly nevýznamný 0,5% nárůst v kontrolní skupině a nevýznamný 0,8% pokles ve skupině Lac (obrázek 2). Při srovnání skupin nefrektomizovaných zvířat vykazovala skupina nekonzumující synbiotikum (Nef) významně vyšší hladinu IS(Indoxylsulfát)ve srovnání se skupinou, která konzumovala synbiotikum (Lac). Mezi skupinou Lac a kontrolní skupinou nebyl žádný významný rozdíl. Analýza dat hledající možnou korelaci mezi kreatininem a IS(Indoxylsulfát)úrovně ukázaly, že tato korelace nebyla přítomna (doplňkové materiály: obrázky S1-S3). Konečně, výsledky hematokritu neukázaly žádné významné rozdíly mezi třemi skupinami (obrázek 3).
Obrázek 1. (a) Hladiny kreatininu v séru u potkanů Sprague-Dawley na začátku a na konci 16týdenního podávání synbiotika. (b) Rozdíly středních hodnot pro konečné koncentrace kreatininu s 95% Tukeyho simultánními intervaly spolehlivosti (Pokud interval neobsahuje nulu, odpovídající průměry jsou významně odlišné). Nef: nefrektomizované krysy, které nedostávají synbiotikum, Lac: nefrektomizované krysy, které dostávají synbiotikum, kontrola: falešně nefrektomizované krysy.
Obrázek 2(a) Sérumindoxylsulfát(IS) hladiny u potkanů Sprague-Dawley na začátku a na konci 16týdenního podávání synbiotika.(b) Rozdíly v průměrech pro konečnou IS(Indoxylsulfát)koncentrace s 95 procenty Tukeyho simultánních intervalů spolehlivosti (Pokud interval neobsahuje nulu, odpovídající průměry jsou výrazně odlišné). Nef: nefrektomizované krysy, které nedostávají synbiotikum, Lac: nefrektomizované krysy, které dostávají synbiotikum, kontrola: falešně nefrektomizované krysy.
2.4. Histologická analýza ukázala, že podávání sybiotik snížilo progresi CKD
Na konci experimentu byly krysy usmrceny, aby se získaly vzorky zlevaledvinya srdce ke zpracování pro histologickou analýzu. Fibrózní oblast byla určena Massonovým trichromem (MT) pomocí informatického nástroje Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) pro výpočet procenta poškozené (tj. fibrotické) oblasti (Tabulka 2) a dvoufotonovou excitační mikroskopií, což je metoda, která detekuje kolagen emisí dvou fotonů, což způsobuje, že kolagen generuje druhou harmonickou, kterou lze vizualizovat konfokální mikroskopií, čímž se získá specifický obraz blízko organizace a distribuce kolagenu uvnitř tkáně. Při srovnání fibrotických oblastí ledvin, hodnocených MT barvením, bylo možné pozorovat, že fibrotické oblasti byly o 25 procent větší ve skupině Nef, ale pouze o 12 procent větší ve skupině Lac, kterým bylo podáváno snbiotikum ve srovnání s falešným nefrektomizovaná kontrolní zvířata. Léze pozorované tímto postupem barvení byly lokalizovány v parietální vrstvě Bowmanova pouzdra a bazální membráně proximálních a distálních stočených tubulů zvířat skupin Nef a Lac. V případě skupiny Nef, včetně zvířat, kterým nebylo podáno synbiotikum, byla pozorována ztráta cytoplazmy buněk svinutých tubulů se současným rozvojem fibrotické tkáně. Když byly tkáně ledvin analyzovány dvoufotonovou excitační mikroskopií, kolagen byl pozorován ve všech vzorcích, které měly konformaci typu síťky. Skupiny Nef a Lac vykazovaly více lézí než kontrolní skupina, ve které byla nalezena pouze jedna fibrotická oblast (obrázek 4). Při pozorování pod dvoufotonovou excitační mikroskopií nebyly v žádném vzorku nalezeny žádné léze v renálních tělíscích.
Tabulka 2Procento fibrotické oblasti v Massonově trichrome obarvenémledvinahistologické řezy. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr plus standardní chyba.
 |  |
| Obrázek 3Hodnoty hematokritu u potkanů Sprague-Dawley na konci 16týdenního podávání synbiotika. Nef: nefrektomizované krysy, které nedostávají synbiotikum, Lac: nefrektomizované krysy, které dostávají synbiotikum, kontrola: falešně nefrektomizované krysy. | Obrázek 4.Histologické řezy ledvin krys Sprague-Dawley. (AC): Massonovo trichromové barvení nefronů. Fibrotické oblasti jsou pozorovány modře (šipky). (DF): stejná tkáň pozorovaná dvoufotonovou excitační mikroskopií. Fibrotická tkáň je pozorována zeleně. Nef: nefrektomizované krysy, které nedostávají synbiotikum, Lac: nefrektomizované krysy, které dostávají synbiotikum, kontrola: falešně nefrektomizované krysy. Měřítko∶ 100 μum pro (AC) mikrofotografie a 50 μm pro (DF) mikrofotografie. |
2.5. Podání synbiotika nezmírnilo srdeční fibrózu
V srdci MT barvení ukázalo přítomnost fibrotických oblastí ve tkáni nefrektomovaných potkanů, zatímco tyto oblasti chyběly u kontrolních zvířat. Indukce CKD u potkanů generuje srdeční fibrózu, které nebylo možné zabránit podáváním synbiotické léčby u nefrektomizovaných potkanů (obr. 5).
Obrázek 5.Massonovo trichromové (MT) barvení srdce krys Sprague-Dawley. Fibrotické oblasti jsou obarveny modře (šipky). Nef: nefrektomované krysy, které nedostávají synbiotikum, Lac: nefrektomizované krysy, které dostávají synbiotikum. Kontrola: krysy s falešnou nefrektomií. Měřítko 100 um.
