Část Ⅱ Nedostatek Smad3 zlepšuje ostrůvkovou terapii diabetu a diabetického poškození ledvin podporou buněčné proliferace prostřednictvím mechanismu závislého na E2F3-
May 25, 2023
Metody
1. Zvířata
Myši Smad3-null (Smad3KO) jsou laskavým darem od prof. Chuxia Denga a jsou udržovány v heterozygotech (Smad3 plus /- ) na pozadí C57BL/6 [20]. Myši Smad3KO byly vytvořeny křížením myší Smad3 plus /-. db/db myši s mutací Lepru (leptinový receptor) na pozadí C57BLKS byly zakoupeny od Animal Experimental Center Čínské univerzity v Hong Kongu (CUHK). Všechna zvířata byla chována ve specifickém zařízení bez patogenů (SPF) s volným přístupem k potravě a vodě v cyklu den/noc 12/12 hodin. Všechny manipulace se zvířaty v této studii byly prováděny v souladu s předpisy a schváleny Etickou komisí pro pokusy na zvířatech CUHK s č.j. Ne. 18-177-MIS.
2. Diabetický myší model indukovaný streptozocinem (STZ).
Samcům myší C57BL/6 ve věku 8-10 týdnů byla intraperitoneálně podávána injekce 50 mg/kg/den STZ denně po dobu 5 nepřetržitých dnů. 5 dnů po poslední injekci STZ byly myši se stabilní náhodnou glykémií vyšší než 16 mM po 2 po sobě jdoucí dny považovány za úspěšný vznik diabetu a byly použity jako recipientní myši pro transplantaci ostrůvků.
3. Izolace ostrůvků, transplantace a hodnocení diabetického fenotypu
Ostrůvky byly izolovány ze samců nebo samic Smad3 knockout (KO) nebo myší divokého typu (WT) ve věku 8-10 týdnů, jak bylo popsáno dříve [21]. K provedení transplantace ostrůvků bylo indikováno, že několik ostrůvků bylo transplantováno pod ledvinové pouzdro samců db/db myší ve věku 4. týdne nebo diabetických myší indukovaných STZ v den 7 po poslední injekci STZ podle protokolu popsaného Szot et al [ 22]. Stručně, myš příjemce byla anestetizována anestezií Combo (1,5 procenta ketaminu a 0,15 procent xylazinu, 6 μl/g tělesné hmotnosti). Po ztrátě vědomí byl proveden řez 1 cm na kůži pokrývající levou ledvinu. Ledvinu jemně vytáhněte a během operace ji udržujte vlhkou sterilním fyziologickým roztokem. Jehlou 25G udělejte malý škrábanec na kapsli, abyste vytvořili zářez. Uvedený počet ostrůvků byl dodán do ledvinového pouzdra hadičkou PE50. Koneckonců, ostrůvky byly transplantovány, utěsněte zářez kauterizací nízkým teplem. Vyměňte ledvinu a uzavřete pobřišnici stehy. Kůži utěsněte sponkami. 100 ul roztoku penicilin-streptomycin (Gibco, kat. č. 15140122, USA) bylo injikováno intraperitoneálně, aby se zabránilo infekci. Ke zmírnění bolesti bylo intramuskulárně injikováno 100 μl Tegmic. Zvíře bylo umístěno v teplém prostředí až do úplného zotavení. Stejný operační postup byl také proveden u falešných kontrolních myší, ale bez ostrůvkové infuze. Jak náhodné, tak hladiny glukózy v krvi (RBG a FBG) po 6 hodinách nalačno v krvi na špičce ocasu byly kontrolovány každý týden pomocí přenosného glukometru (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Test inzulinové rezistence (IPITT), glukózový toleranční test (IPGTT), hladiny HbA1c a inzulin v séru byly měřeny, jak bylo popsáno dříve [9].
Pro získání klikněte semvýhody Cistanche
4. Celková bílkovina v moči a sérový kreatinin
24 hodinová moč byla shromažďována v metabolické kleci. Celkový protein v moči za 24 hodin byl vypočten vynásobením objemu moči a koncentrace proteinu v moči, které byly kvantifikovány soupravou Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, kat. č. 5000201, USA). Sérový kreatinin byl stanoven pomocí soupravy pro kvantifikaci kreatininu (Stanbio Laboratory, kat. č. 0430-120, USA).
5. Histopatologie
Renální histopatologické změny byly vyšetřeny na řezech fixovaných v paraformaldehydu a zalitých v parafínu (4 µm) pomocí činidla Periodic Acid-Schiff's (PAS), jak bylo popsáno dříve [23]. Expanze mezangiální matrice byla hodnocena pomocí programu pro kvantitativní zobrazování (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics), jak bylo popsáno dříve [23].
6. Imunohistochemie
Ledviny nebo slinivka nesoucí ostrůvky byly fixovány ve 4% paraformaldehydu, zalité v parafínu a nařezány na 4 μm. Po rehydrataci byly řezy ošetřeny mikrovlnami zprostředkovaným získáváním antigenu v 0.01 M citrátu (pH 6.0) po dobu 10 minut a blokováním v 5% BSA po dobu 1 hodiny . Primární protilátková inkubace byla prováděna přes noc při 4 stupních. Pro fluorescenční barvení byla aplikována fluorescenční sekundární protilátka při pokojové teplotě (RT) po dobu 1 hodiny. Pro termogenezi zprostředkovanou DAB byl před vyhledáním antigenu zařazen další krok 3procentní blokace H2O2 po dobu 15 minut. Po inkubaci primární protilátky byl přidán HRP-konjugovaný polymer (Envision plus System, Dako, USA). Pro barvení E2F3 bylo vyhledávání antigenu provedeno v roztoku EDTA-Tris (pH 9,0). Protilátky používané v imunohistochemii jsou podrobně uvedeny v tabulce S2. Oblast pozitivní na barvení byla kvantifikována pomocí softwaru Image J (v1.47, NIH, USA).
Extrakt z cistanche
7. Měření roubované buněčné hmoty v ledvině nesoucí ostrůvky
Index průměrné buněčné plochy na řez byl použit pro semikvantitativní kvantifikaci buněčné hmoty v ostrůvkovém štěpu. Stručně řečeno, ledvina nesoucí ostrůvky (zalitá v parafínu) byla postupně nařezána na 4 μm podél sagitální osy. Kontinuální řezy v intervalech 160 μm byly fluorescenčně imunobarveny na inzulín. Pro výpočet buněčné plochy na řez u každé myši bylo použito alespoň 6 řezů s inzulín-pozitivním barvením. Oblast inzulin-pozitivních buněk v každém řezu byla kvantifikována pomocí softwaru Image J (v1.47, NIH, USA). Index průměrné plochy buněk na řez u každé myši byl vypočten dělením celkové plochy pozitivní na inzulín do všech řezů počtem řezů pozitivních na inzulín.
8. Primární kultura buněk ostrůvků
Izolované ostrůvky byly disociovány na jednotlivé buňky a nasazeny do 96-jamkové destičky ve 200 μl RPMI 1640 (Gibco, USA) plus 10 procent FBS (Gibco, USA) plus 1 procento penicilin-streptomycin (Gibco, USA) doplněné 20 mM glukózou. Buňky ostrůvků byly kultivovány po uvedenou dobu v inkubátoru nastaveném na 37 stupňů, 5 procent C02 a 100 procent vlhkosti. Pro adenovirem zprostředkované knockdown E2F3 byly disociované buňky ostrůvků kultivovány v médiu obsahujícím adenovirus nadměrně exprimující krátkou vlásenkovou RNA (shRNA) cílící myší E2F3 (shE2F3) nebo kontrolní nespecifickou shRNA (zobrazeno) v titru 10 pfu na buňku po dobu 2 dní následovaných výměnou média. Kmenová sekvence duplexu shE2F3 byla 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Dispergované buňky z 50 ostrůvků byly nasazeny na jamku pro imunobarvení a RT-PCR a 100 ostrůvků na jamku pro Western blot, které byly provedeny, jak bylo popsáno dříve [9].
9. In vivo a in vitro značení BrdU
Pro provedení in vivo značení BrdU bylo myším intraperitoneálně injikováno 50 mg/kg/den BrdU (v PBS) po dobu 7 dnů od 2. dne po transplantaci ostrůvků a usmrceny 2 hodiny po poslední injekci. Pro in vitro značení BrdU byly dispergované buňky ostrůvků kultivovány po dobu 48 hodin, poté byly nahrazeny čerstvým médiem obsahujícím 10 uM BrdU a kultivovány dalších 24 hodin. Fluorescenční imunobarvení proti BrdU ve tkáni a kultivovaných buňkách bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve [9].
Cistanche prášek
10. RNA-Sekv
Ostrůvky byly izolovány z myší Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m a Smad3KO-db/m. Pro každý genotyp byly shromážděny ostrůvky od více než 5 myší pro izolaci RNA. RNA byla připravena pomocí miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Německo). RNA-seq a následná analýza dat byly popsány dříve [9]. Úroveň exprese daného genu byla prezentována jako fragmenty na kilobázi transkriptu na milion mapovaných čtení (FPKM). Diferenciálně exprimovaný gen (DEG) byl definován jako větší nebo rovný 2násobku rozptylu FPKM mezi dvěma skupinami. Upregulované a downregulované DEG byly zkombinovány a použity pro analýzu genové ontologie (GO) a kjótské encyklopedie genů a genomů (KEGG) s využitím online bioinformatických zdrojů DAVID (v6.8) s výchozím nastavením. Pro analýzu GO byla použita podkategorie GOTERM_BP_DIRECT.
11. Imunoprecipitace
K provedení imunoprecipitace v myších ostrůvcích bylo asi 500 čerstvě izolovaných ostrůvků lyžováno v 500 ml RIPA pufru. Byla přidána králičí anti-Smad3 protilátka (2 ug) nebo králičí IgG izotyp a inkubovány při 4 stupních přes noc s mírnou rotací. Poté bylo přidáno 20 ul proteinu A agarózových kuliček (Beyotime, kat. č. P2051, Čína) a inkubováno po dobu 2 hodin při 4 stupních. Po důkladném promytí čerstvým pufrem RIPA byl navázaný protein uvolněn denaturací v nanášecím pufru 1xSDS a podroben analýze Western blot. Aby se zabránilo vlivu těžkého řetězce IgG, byl k rozpoznání vysráženého proteinu Smad3 použit myší anti-králičí IgG specifický pro lehký řetězec (HRP konjugovaný, Abmart, kat# M21006, Čína).
12. Imunoprecipitace chromatinu-ChIP
K provedení ChIP na myších ostrůvcích bylo odebráno asi 2000 ostrůvků od 8-10 týdnů starých myší C57BL/6 a použity jako jeden přípravek ChIP. Čerstvě izolované ostrůvky byly stimulovány 10 ng/ml TGF- 1 (Gibco, USA) po dobu 15 minut v RPMI 1640 plus 1 procento FBS plus 1 procento penicilin-streptomycin. ChIP byl proveden pomocí SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, USA) podle doporučených pokynů. Protilátky a primery použité v testu ChIP jsou podrobně uvedeny v tabulce S1 a S2.
Standardizované Cistanche
13. Duální luciferázový reportérový test
Myší E2F3 promotor (-1000 až plus 451 bp) byl klonován do pGL3-základního vektoru (pGL3-E2F3.Pro). Současně byla provedena bodová mutace vazebného místa Smad3 za účelem vytvoření pGL3- E2F3.Pro. Mut. K provedení duálního luciferázového reportérového testu byly buňky HEK293T nasazeny do 24-jamkové destičky v hustotě 5 x 104 buněk/jamku. Následující den byly buňky transfekovány 500 ng pGL3-Basic nebo pGL3-E2F3.pro nebo pGL3-E2F3.pro.mut v kombinaci s pcDNA3.{26}}Smad3, který nadměrně exprimuje myší Smad3 nebo ne (jak je uvedeno na obrázku 10F) metodou fosforečnanu vápenatého. Vektor pEGFP-C1 byl doplněn pro vyvážení transfekční dávky při každém ošetření. Do každého ošetření bylo zahrnuto 10 ng vektoru pGL4.73.huc/SV40 exprimujícího luciferázu renilla, aby se normalizovala účinnost transfekce. 6 hodin po transfekci se médium vyměnilo a následovala inkubace po dobu dalších 48 hodin. Buňky byly lyžovány a aktivita luciferázy byla stanovena pomocí Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, USA) a kvantifikována v luminometru (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, USA). Transkripční aktivita klonovaného promotoru E2F3 byla prezentována jako poměr hodnot luciferázy světlušek k luciferáze renilla. Každé ošetření bylo provedeno v triplikátech.
14. Statistika
Data byla prezentována jako průměr ± SD a analyzována pomocí softwaru SPSS (16.0). Normalita dat byla ověřena testem Kolmogorov-Smirnov s jedním vzorkem. Homogenita rozptylů mezi skupinami byla testována statistikou Levene. Pro srovnání mezi oběma skupinami byl použit Studentův t-test. Pro srovnání mezi více skupinami byla použita jednocestná ANOVA s testem LSD, pokud se předpokládala stejná odchylka. Pro stejný rozptyl, který se nepředpokládal, byla použita alternativní statistika Welchova testu, po níž následovalo vícenásobné srovnání s Tamhaneovým T2 testem. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.
Doplňky Cistanche
Závěry
Nedostatek Smad3 do značné míry zlepšuje substituční terapii ostrůvků u T1DM i T2DM a chrání před diabetickým poškozením ledvin. Zvýšená E2F3-závislá buněčná proliferace může být klíčovým mechanismem terapie ostrůvků Smad3KO u T1DM i T2DM. Buněčná substituční terapie Smad3KO tedy může být klinicky lepší terapeutickou strategií pro diabetes.
Reference
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinická transplantace pankreatických ostrůvků. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferenciace lidských pluripotentních kmenových buněk na funkční pankreatické buňky pro léčbu diabetu: Inovace, výzvy a budoucí směry. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histologické hodnocení štěpu po klinické transplantaci ostrůvků. Transplantace. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Různé role TGF-beta/Smads při renální fibróze a zánětu. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Signalizace TGF-beta/Smad u renální fibrózy. Přední Physiol. 2015; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K a kol. Smad signální síť reguluje proliferaci buněk ostrůvků. Diabetes. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibice signalizace TGF-beta podporuje replikaci lidských pankreatických beta-buněk. Diabetes. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Kombinovaná inhibice cest DYRK1A, SMAD a trithoraxu se synergizuje k indukci robustní replikace v dospělých lidských beta buňkách. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH a kol. Deficit Smad3 podporuje proliferaci a funkci beta buněk u db/db myší prostřednictvím obnovení exprese Pax6. Teranostika. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metoda pro izolaci myších ostrůvků a subkapsulární transplantaci ledvin. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Transplantace izoštěpu ostrůvků zlepšuje citlivost na inzulín u myšího modelu diabetu 2. typu. Endokrinní. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukce p16ink4a a p19ARF pomocí TGFbeta1 přispívá k zastavení růstu a senescenci myších keratinocytů. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Barvíř MA, Cepko CL. Regulace proliferace během vývoje sítnice. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Regulace E2F proteiny rodiny pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Přechodné potlačení signalizace receptoru TGFbeta usnadňuje transplantaci lidských ostrůvků. Endokrinologie. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Narušení SMAD2 v myších pankreatických beta buňkách vede k hyperplazii ostrůvků a zhoršené sekreci inzulínu v důsledku zeslabení aktivity K plus kanálu citlivého na ATP. Diabetologie. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P a kol. Nadměrná exprese E2F3 podporuje proliferaci funkčních lidských beta buněk bez indukce apoptózy. Buněčný cyklus. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Signalizace rodiny TGF-beta v kontrole buněčné proliferace a přežití. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--Pokroky a výzvy v proliferaci lidských beta-buněk. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H a kol. Cílené narušení SMAD3 má za následek zhoršenou slizniční imunitu a sníženou schopnost T-buněk reagovat na TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol pro izolaci ostrůvků z myšího pankreatu. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantace pankreatických ostrůvků do pouzdra ledvin diabetických myší. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q a kol. Delece Smad3 zabraňuje renální fibróze a zánětu u diabetické nefropatie 2. typu. Metabolismus. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 a Hui-Yao Lan2,7
1 Výzkumné centrum pro integrovanou medicínu a oddělení nefrologie, přidružená nemocnice tradiční čínské medicíny Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Čína.
2. Oddělení medicíny a terapie a Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Čínská univerzita v Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Čína.
3. Guangdong-Hong Kong Joint Laboratory on Immunological and Genetic Kidney Diseases, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, China.
4. Státní klíčová laboratoř bioelektroniky, Jiangsu klíčová laboratoř pro biomateriály a zařízení, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Čína.
5. Klíčová laboratoř prevence a léčby chronického onemocnění ledvin města Zhanjiang, Institut nefrologie, přidružená nemocnice Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Čína.
6. Národní klinická výzkumná základna tradiční čínské medicíny, přidružená nemocnice pro tradiční čínskou medicínu Jihozápadní lékařské univerzity, Luzhou, Sichuan, 646000, Čína.
7. Společná výzkumná laboratoř pro imunologická a genetická onemocnění ledvin provinční lidové nemocnice CUHK-Guangdong, Čínská univerzita v Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Čína.