ČÁST Ⅱ: Role lidských primárních renálních fibroblastů v zařízeních napodobujících fibrózu zprostředkovanou TGF- 1-

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ČÁST Ⅱ: Role lidských primárních renálních fibroblastů v zařízeních napodobujících fibrózu zprostředkovanou TGF- 1-

Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee a kol.

Abstraktní

Renální fibrózaje progresivní chronické onemocnění ledvin, které nakonec vede ke konečnému selhání ledvin. Přes několik přístupů k bojirenální fibróza, experimentální model pro hodnocení aktuálně dostupných léků není ideální. Vyvinuli jsme modely napodobující b pomocí trojrozměrných (3D) kokultivačních zařízení navržených se třemi samostatnými vrstvami intersticia tubulů, konkrétně epiteliální, fibroblastickou a endoteliální vrstvou. Zavedli jsme lidské renální proximální tubulární epiteliální buňky (HK-2), lidské endoteliální buňky pupečníkové žíly a renální fibroblasty získané od pacienta a vyhodnotili jsme účinkyttransformační růstový faktor - (TGF-)aTGF-Inhibiční léčba na totoledvinovéfibrózaModelka. Výrazfibrózamarker alfa-smooth muscle actin uponTGF- 1léčba byla rozšířena v monovrstvě kultivovaných HK-2 buňkách ve 3D modelu onemocnění. V cévním kompartmentuledvinovéfibrózau modelů byla hustota cév zvýšena a snížena vTGF--léčená skupina aTGF--skupina léčení inhibitory, resp. Multiplexní ELISA s použitím supernatantů vTGF-– stimulující 3D modely ukázaly, že hladiny prozánětlivých cytokinů a růstových faktorů včetně interleukinu-1 beta, tumor nekrotizujícího faktoru alfa, základního fibroblastového růstového faktoru aTGF- 1, TGF- 2, aTGF- 3byly zvýšené, což napodobovalo fibrotické mikroprostředí lidských ledvin. Tato studie může umožnit konstrukci člověkaledvinovéfibróza-napodobující model zařízení nad rámec tradičních kulturních experimentů.

Klíčová slova: renální fibroblast; fibróza; TGF- 1

cistanche tubolosa zdravotní přínosy: léčba chronických onemocnění ledvin

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅰ

3. Diskuse

TGF- 1hraje důležitou roli v akumulaci matrice při renální fibrogenezi a inhibuje proliferaci ve většině buněk, včetně glomerulárních epiteliálních a endoteliálních buněk, stejně jako tubulárních epiteliálních buněk【1】. TGF-ß1 však indukuje proliferaci v lidských renálních fibroblastech prostřednictvím indukce základního fibroblastového růstového faktoru (FGF-2) [8].

V této studii jsme založili afibróza- napodobující zařízení využívající tři základní buněčné složky, včetně lidských primárních renálních fibroblastů, renálních tubulárních epiteliálních buněk a lidských endoteliálních buněk, a vyhodnotil je jakoledvinovéfibrózamodel založený naTGF- 1stimulace. Vygenerovatledvinovéfibróza-on-a-chip jsme vytvořili nový 3D kultivační systém navržený se třemi samostatnými částmi tkáně, jehož cílem je překonat překážky spojené s modelováním onemocnění ledvin. Naše studie to prokázalaTGF- 1indukované buněčné reakce, včetně tubulárního epiteliálně-mezenchymálního přechodu (EMT) epiteliálních buněk, mikrovaskulární alterace endoteliálních buněk a cytokinové změny v renálních fibroblastech. Toto je první studie, která představila afibróza- napodobující zařízení obsahující primární fibroblasty pocházející z lidských ledvin a stimulované fibroblasty izolované od pacientů sTGF- 1, známý induktor fibrotických odpovědí obecně používaný jako standard k napodobovánífibrózav buněčných kulturách [9]. Tyto výsledky tomu nasvědčujíTGF- 1-ošetřené epiteliální buňky se převedou na fenotyp podobný mezenchymálním buňkám. KdyžTGF- 1Při podávání fibroblastům jsou různé cytokiny změněny tak, aby odrážely indukci fibrotických procesů. Je zřejmé, že vledvinovéfibrózafibroblasty jsou hlavní silou rozvoje zavedeného kultivačního systému prostřednictvím stimulace TGF.

Davis et al uvedli, že 3D kultivace endoteliálních buněk je dostatečná k tomu, aby buňky napadly a vytvořily síť lumen a trubic po intaktním organismu in vivo [10,11]. Několik skupin uvedlo, že modely 3D kultury vykazují vyšší úrovně nefrotoxicity než modely 2D buněčné kultury [12]. Kromě toho byla exprese genů souvisejících s nefrotoxicitou a zánětem významně vyšší v modelu renální 3D buněčné kultury než v typické 2D kultuře[13].

V této studii média kultury člověkaledvinovéfibróza-on-a-chip měl významně vyšší hladinu cytokinů ve srovnání s 2Dculture. Naše skupina ukázala, že fibroblasty získané od pacienta mohou znovu vytvořit nativní renální tkáně, včetně endoteliálních a epiteliálních buněčných vrstev, prostřednictvím námi navrženýchfibróza-model na čipu. V důsledku toho tato zjištění naznačují, želedvinovéfibróza-on-a-chip model přesně simuluje mikrofyzikální prostředí lidské ledviny. Navíc, protože fibroblasty kultivované v čipu pocházejí od pacientů, lze snadno a jasně bezpečným způsobem získat další klinicky relevantní modely pacientů. Proto člověkledvinovéfibróza-on-a-chip modelový systém může umožnit vývoj personalizované medicíny s citlivým měřením epiteliálních a endoteliálních funkcí. V našich experimentech,fibrózaa angiogeneze byla snížena vTGF-skupiny léčené inhibitory. Inhibitory TGF- jsou přirozenými antagonisty TGF-, které byly prokázány na různých modelech onemocnění ledvin. Zdá se, že je možné provést experimenty k potvrzení účinnosti léčby na modelech onemocnění s použitím terapeutických činidel, jako je tento inhibitor TGF. Proto tento čip poskytl prostředek pro vývoj vylepšeného modelu renální fibrózy pro měření buněčné morfologie a funkce a mohl by být užitečný při provádění hodnocení nefrotoxicity léčiv.

TGF-je převládajícím profibrotickým faktorem u různých onemocnění ledvin [14] a hraje roli v angiogenezi [15]. Angiogenní účinky TGF- jsou velmi komplexní a mohou mít buď proangiogenní nebo antiangiogenní aktivitu v závislosti na prostředí a různých regulačních faktorech [16]. Zdá se, že angiogenní růstové faktory, jako je VEGF a FGF-2indukují angiogenezi in vivo, hrají ústřední roli v modulaci angiogeneze in vivo [17-20]. Některé důkazy naznačují, že tyto dva faktory mohou působit synergicky při podpoře morfogenetických událostí endoteliálních buněk [21,22]. Poskytli jsme důkaz, že exprese mRNA VEGF a sekrece proteinu FGF-2 jsou významně zvýšeny pomocí TGF- 1 ve 3D čipech ve srovnání s 2D kulturou.

Naše omezenífibrózamodely mohou být tím, že byly vytvořeny v relativně krátkém časovém období, 24 hodin. TGF-beta má brzy pro-fibrotické a protizánětlivé vlastnostifibrózaprocesu, nikoli v chronickém procesu. konvenčně,TGF-se primárně používá u cytokinů indukovanýchfibrózamodely. Protože však in vivo nemůže být zastoupen pouze jeden cytokin,fibrózaindukční modely využívající několik dalších kandidátních látek, jako napřTGF-a BMP7 byly navrženy. Dva nebo tři cytokiny však stále nestačí k reprodukci in vivo. Použili jsmeTGF-jako výchozí bod; nicméně jsme se pokusili implementovat in vivo mikroprostředí na čipu indukcí rozmanitější cytokinové bouře. Fibroblast, hlavní buněčná složkafibróza, byla zavedena sekundární stimulace více různorodých cytokinů (IL-1 , TNF- , b-FGF,TGF- 1, TGF-2, aTGF-3) byl indukován ve fibroblastech stimulovaných sTGF-. Tedy prostředí podobnéfibrózav lidském těle byl reprodukován.

extrakt z cistanche deserticola: léčba onemocnění ledvin

4. Materiály a metody

4.1. Buněčné kultury

Kidney fibroblasts(KFs)were isolated from biopsies of the normal tissue portion of renal cell carcinoma patients with an estimated glomerular filtration rate (eGFR)>60 ml/min/1,73 m2 poté, co pacienti dali souhlas s druhou biopsií pro výzkumné účely. KF byly kultivovány ve fibroblastovém růstovém médiu (FGM-2, Lonza, Švýcarsko) a pro experimenty byly použity pasáže 3 až 4. Renální fibroblasty byly seškrabávány z kultury po dobu 1-2 týdnů, dokud buňky nevytvořily monovrstvu. Pro odstranění epiteliálních buněk kontaminujících kulturu byly fibroblasty selektovány pomocí magnetických anti-fibroblastových kuliček (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) po první pasáži. Buňky byly odděleny pomocí 0.05% kyselina trypsin-ethylendiamintetraoctová (EDTA) (Welgene, Gyeongsan, Korea), inkubovány s kuličkami proti fibroblastům a odděleny pomocí magnetické kolony a průtokem- přes bylo shromážděno. Purifikované primární fibroblasty byly charakterizovány analýzou fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) s použitím PE-konjugovaných anti-fibroblastových protilátek. Jemný magneticky aktivovaný separátor buněk (MACS) Dissociator byl použit pro šetrné mletí ledvinové tkáně. Magnetický separátor Octo MACSTM s kolonami MACS LS (s písty) použitý pro čištění buněk značených mikrokuličkami byl zakoupen od Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Jemné zkumavky MACS C (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) byly použity pro mletí ledvin pro separaci buněk. MACS Smart Strainers (70 um) byly získány od Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). K promytí kolon a resuspendování buněčných pelet byl použit sloupcový pufr. Pufr byl připraven jako roztok obsahující 0,5 procenta hovězího sérového albuminu (BSA) s 2 mM EDTA ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) (pH 7,4) a zakoupen od Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Lidské endoteliální buňky pupečníkové žíly exprimující zelený fluorescenční protein (GFP-HUVEC, Lonza, Švýcarsko) byly kultivovány v endoteliálním růstovém médiu (EGM-2, Lonza, Švýcarsko) a byly použity buňky v pasážích 3 až 4. Lidská proximální tubulární buněčná linie (buňky lidské ledviny-2(HK-2) byly získány z American Type Culture Collection (ATCC). Buněčná linie byla pěstována ve vysoce glukózovém Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) doplněné 10% fetálním bovinním sérem (FBS), penicilinem (100 U/ml) a streptomycinem (100 ug/ml).Reagencie byly zakoupeny od Gibco (Rockville, MD, USA).Všechny buňky byly odděleny pomocí 0,05% trypsinu- EDTA a udržovány ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních a 5 procentech CO2. KF byly resuspendovány v FGM-2 při buněčné koncentraci 4×10 stupňů buněk/ml. Tubulární epiteliální buňky lidských ledvin (HK{49 }}) byly resuspendovány na koncentraci 2×10 buněk/ml v DMEM s vysokým obsahem glukózy. GFP-HUVEC byly resuspendovány na koncentraci 2×10 buněk/ml v EGM-2.

4.2. Činidla

Matrice se skládala z fibrinových gelů, včetně komerčně dostupného fibrinogenu z hovězí plazmy, aprotininu z hovězích plic a trombinu z hovězí plazmy. Výše uvedené tři materiály byly zakoupeny od společnosti Sigma (St. Louis, MO, USA). Fibrinogen byl rozpuštěn v lxPBS ve vodní lázni (37 stupňů) po dobu 30 min v koncentraci 10 mg/ml. Trombin a aprotinin byly rozpuštěny v deionizované vodě v koncentraci 50 jednotek/ml a 4 TIU/ml. Tyto tři roztoky byly sterilizovány filtrací přes 0,22 um filtr. Rekombinantní člověkTGF- 1byl získán od PeproTech EC Ltd. (Londýn, Velká Británie). Specifický inhibitor kinázy receptoru TGF-beta, SB431542, byl zakoupen od Tocris Cookson, Inc. (Ellisville, MO, USA).

4.3. Vzorování buněk v zařízení

Před naočkováním buněk k usnadnění těsného spojení bylo zařízení ošetřeno po dobu 1 minuty v plazmovém zařízení (Femto Science Inc., Suwon, Korea) s výkonem 70 W, 50 Hz. Ošetřením plazmou indukovala hydrofilnost povrchu a pomohla usnadnit tvorbu gelu a naplnění média. Aby se zabránilo změnám v hydrofilitě, byly experimenty provedeny do 30 minut po ošetření plazmou. Různé buněčné vzorování v zařízeních lze provádět vysoce přizpůsobitelným způsobem. Bylo důležité předem určit složení a koncentraci různých typů buněk, které měly být vzorovány. Pro buněčné hydrogelové suspenze bylo připraveno 37,5 μl buněčné suspenze a oddělený alikvot 12,5 μl 10 mg/ml roztoku fibrinogenu （250 μl 10 mg/ml roztoku fibrinogenu se 40 μl 4 TIU/ml aprotininu) k okamžitému smíchání před naložením. Bezprostředně před nanesením bylo 37,5 ul buněčné suspenze smícháno s 12,5 ul 10 mg/ml fibrinogenu až do homogenizace. 50 ul hydrogelu bylo smícháno s 1 ul kapkou trombinu (0,5 jednotky/ml). Ihned po smíchání byl trombin s fibrinovou suspenzí GFP-HUVEC (koncentrace buněk 2 x 10' buněk/ml) injikován do vnějšího okraje vnějšího kanálu (obrázek 3, gel A). Čekali jsme 3 minuty na dokončení zesítění fibrinogenu. Ihned po smíchání byl trombin s fibrinovou suspenzí KFs (koncentrace buněk 4 x 10 stupňů buněk/ml) umístěn na každou stranu dna zásobníku na jamku (obrázek 3, gel C). Tato fibrinová suspenze KF se nechala zesíťovat při teplotě místnosti po dobu 3 minut. Buněčná suspenze 10 μl lidských renálních proximálních tubulárních epiteliálních buněk (HK-2) byla injikována do injekčního portu vnitřního kanálu (obrázek 3, Gel B). K připojení HK-2 ke stěně fibrinového gelu v kanálu GFP-HUVECs, zařízení bylo otočeno o 90 stupňů a umístěno do 5% CO, inkubátoru na 30 minut při 37 stupních. HK-2 se usadil a vytvořil buněčnou vrstvu na straně fibrinového gelu.

Po připojení HK-2 bylo zařízení naplněno elektrogramem-2. Zařízení bylo inkubováno po dobu 3 dnů při 37 stupních v inkubátoru s 5% CO. Médium bylo vyměněno s nebo bez 5 ng/mlTGF- 1a s 5 ng/mlTGF- 1a 10 umTGF- 1inhibitor po třech dnech inkubace (obrázek 3).

co je cistanche

4.4. Imunocytofluorescence

Tkáně společně kultivované v zařízení byly fixovány 4% (hmotn./obj.) roztokem paraformaldehydu (Biosesang, Seongnam, Korea) v PBS (Welgene, Gyeongsan, Korea) po dobu 20 min, poté byla permeabilizována 20 minimální ponoření do 0,15% Tritonu X-100(Sigma, St. Louis, MO, USA). Vzorky byly poté ošetřeny 3% BSA (Sigma, USA) po dobu 1 hodiny. Buňky byly inkubovány s protilátkami zakoupenými od Abcam. Primárními protilátkami byly anti-cytokeratin 8 a anti-o-SMA, ponechány 2 dny při pokojové teplotě (RT). Alexa Fluor 647 konjugovaný oslí anti-králičí IgG(H plus L) byl použit jako sekundární protilátka. Značení DNA bylo prováděno s ředěním 1:250 Hoechst33342 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) po dobu 3 hodin při teplotě místnosti. Snímky byly shromážděny pomocí konfokálního laserového mikroskopu Zeiss LSM 710. Průměrná intenzita fluorescence (MFI) byla měřena pomocí ImageJ a analyzátoru intenzity fluorescence.

4.5. Multiplexní analýza cytokinů

Souprava MSD V-Plex Cytokine and Angiogenesis Panel 1 Human (Rockville, MD, USA) byla použita k měření koncentrací interleukinu-1 beta （IL-1ß） a základního fibroblastového růstového faktoru （b-FGF） v jednotlivých vzorcích podle pokynů výrobce. Všechny vzorky byly hodnoceny na celkové hladiny proteinu IL-1 a b-FGF. Množství (v pg/ml) bylo kvantifikováno ze standardní křivky každého měření.

4.6. Multiplexní imunologický test na kuličky

Koncentrace cytokinů byly analyzovány pomocí multiplexního systému imunologického testu (Procarta Cytokine Assay Kit; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA), založeného na technologii multi-plexing (xMAP; Luminex, Austin, TX, USA), podle pokyny výrobce. Data byla získána pomocí pracovní stanice kompatibilní s Luminex a jejího manažerského softwaru (pracovní stanice Bio-Plex a verze 6.0 softwaru; Bio-Rad, Tokio, Japonsko), podle pokynů výrobce. Lidský TGF- 1, TGF- 2 a TGF- 3 související sfibrózaProces byl analyzován současně ve zředěných vzorcích. IzoformyTGF-byly detekovány pomocí Bio-Plex 200 Systems a komerčně dostupného Bio-Plex ProTM HumanTGF-testy (Bio-Rad Laboratories, Inc); na základě informací poskytnutých výrobcem. Multiplexní testovací souprava může kvantitativně měřit více cytokinů ze supernatantu se spodním limitem detekce 1 pg/ml na cytokin. Každý vzorek byl proveden jako jediné měření pro omezené množství odebraného supernatantu.

4.7. PCR v reálném čase

Extrakce RNA byla provedena pomocí TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Pro reverzní transkripci celkové RNA byly použity Master Mix a Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit. qPCR byly provedeny pomocí Applied BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Specifické primery byly připraveny společností Bioneer (Daejeon, Korea) a použity v tomto experimentu následovně. Sekvence primerů jsou shrnuty v tabulce 1.

Deset mikrolitrů PowerUp SYBR Green Master Mix, 4 μl cDNA a 2 pmol každého primeru bylo použito pro PCR v reálném čase v konečném objemu 20 μl. Reakce byla prováděna při 95 stupních po dobu 1 s a 60 stupních po 20 s po 45 cyklů po denaturaci při 95 stupních po 20 s. PCR byla provedena v duplikátech nebo triplikátech pro každý vzorek. Hladiny cDNA byly stanoveny pomocí standardní křivky prahových hodnot cyklu. Všechna data pro každou cDNA byla v rámci odpovídající standardní křivky. Získaná data byla normalizována na -aktinovou cDNA.

4.8. Statistická analýza

Kvantitativní data jsou prezentována jako průměr ± SD nebo SE z alespoň tří nezávislých experimentů. Statistické analýzy byly provedeny pomocí dvoustranného Studentova t-testu. Zvažovali jsme významný rozdíl pouze na úrovni spolehlivosti 95 procent nebo vyšší (str<>

5. Závěry

Stručně řečeno, protokoly v této studii umožnily konstrukci člověkaledvinovéfibróza-napodobování zařízení jako modelu a ukázalo různé efekty, které nejsou možné v experimentech s 2D kulturou. Věříme, že strategie hodnocení navržená v této studii povede k lepšímu pochopení detailůfibrózamechanismy podílející se na patologických změnách běhemnemoc ledvin. Vyvinutá 3D renální fibróza-on-a-chip by mohla být použita jako potenciální in vitro model, který nás přiblíží k vytvoření vylepšeného modelu ledviny na čipu.

cistanche phelypaes: léčba onemocnění ledvin

Reference

1. Border, W.; Noble, N. Transformující růstový faktor v tkánifibróza.N. Engl. J. Med. 1994, 331, 1286-1292.

2. Wang, W.; Huang, XR; Li, AG; Liu, F; Li, J.; Truong, LD; Wang, XJ; Lan, HYSignalizační mechanismus TGF-betal v prevenci zánětu ledvin: Role Smad. Jsem. Soc. Nephrol.2005, 16, 1371-1383. [CrossRef]

3. Liu, Y.Renálnífibróza: Nové pohledy na patogenezi a terapeutika. Kidney Int.2006,69,213-217. [CrossRef][PubMed]

4. Andes, D.; Craig, WA Farmakokinetika a farmakodynamika zvířecího modelu: kritický přehled. Int. J.Antimicrob.Agents 2002, 19,261-268. [CrossRef]

5. Kim, S.; Takayama, S.Organ-on-a-chip a ledviny. Kidney Res. Clin. Pract.2015, 34, 165-169.[CrossRef][PubMed]

6. Jang, KJ; Mehr, AP; Hamilton, GA; McPartlin, LA; Chung, S.; Suh, KY; Ingber, DEHuman proximální tubulus ledvin na čipu pro transport léčiv a hodnocení nefrotoxicity. Celé číslo. Biol. 2013, 5, 1119-1129. [CrossRef[PubMedl

7. Reardon, S. 'Organs-on-chips' jde do hlavního proudu. Příroda 2015, 523, 266. [CrossRef]

8. Strutz, F; Zeisberg, M; Renziehausen, A.; Raschke, B.; Becker, V; Kooten, CV; MuLler, GATGF- 1indukuje proliferaci v lidských renálních fibroblastech prostřednictvím indukce základního fibroblastového růstového faktoru (FGF-2). Kidney Int. 2001, 59, 579-592.[CrossRef][PubMed]

9. Zanotti, S.; Bragato, C.; Zucchella, A.; Maggi, L.; Mantegazza, R.; Morandi, L.; Mora, M. Antifibrotický účinek pirfenidonu ve svalových fibroblastech od pacientů s DMD. Life Sci. 2016, 145,127-136. [CrossRef]

10. Davis, GE.: Camarillo. C, W. Pinocytický mechanismus závislý na alfa 2 beta 1 integrinu zahrnující tvorbu intracelulárních vakuol a koalescenci reguluje tvorbu kapilárního lumenu a trubice v trojrozměrné kolagenové matrici. Exp. Cell Res. 1996, 224, 39-51.[CrossRef]

11. Bayless, KJ; Davis, G. Cdc42 a Race GTPázy jsou vyžadovány pro tvorbu kapilárního lumenu v trojrozměrných extracelulárních matricích. J. Cell Sci. 2002,115,1123-1136. [CrossRef [PubMed]

12. DesRochers, TM; Suter, L.; Roth, A.; Kaplan, DL Bioengineered 3D lidské ledvinové tkáně, platforma pro stanovení nefrotoxicity. PLoS ONE 2013, 8, e59219. [CrossRef]

13. Astaškina, AI; Mann, BK; Prestwich, GD; Grainger, DW Porovnání prediktivních biomarkerů nefrotoxicity léčiv v primární kultuře organoidů ledvin 3-D a imortalizovaných buněčných liniích. Biomateriály 2012, 33, 4712-4721. [CrossRef] [PubMed]

14. Meng, XM; Nikolic-Paterson, DJ; Lan, HY TGF-beta: Hlavní regulátorfibróza. Nat.Rev.Nephrol.2016,12, 325-338. [CrossRef]

15. Pardali,E.;Goumans, MJ;ten Dijke,P. Signalizace členy rodiny TGF-beta při vaskulární morfogenezi a onemocnění. Trends Cell Biol.2010, 20, 556-567. [CrossRef] [PubMed]

16. Cunha, SL; Pietras, K. ALK1 jako nový cíl pro antiangiogenní terapii rakoviny. Krev 2011, 117,6999-7006.[CrossRef]

17. Klagsbrun, M.; D'Amore, PA Regulátory angiogeneze. Annu. Physiol.1991,53, 217-239. [CrossRef]

18. Folkman, J.; Shing, Y. Angiogenesis. J.Biol. Chem. 1992, 267, 10931-10934. [CrossRef]

19. Shweiki, D. Itin, A.Soffer, D.Keshet, E. Vaskulární endoteliální růstový faktor indukovaný hypoxií může zprostředkovat angiogenezi iniciovanou hypoxií. Nature 1992, 359, 843-848. [CrossRef]

20. Kim, KJ; Li, B.; Winer, J.; Armanini, M; Gillett, N.; Phillips, HS; Ferrera, N. Inhibice angiogeneze indukované vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem potlačuje růst nádoru in vivo. Nature 1993, 362, 841-844. [CrossRefl]

21. Pepř, MS; Ferrara, N.; Orci, L.; Montesano, R. Silný synergismus mezi vaskulárním endoteliálním růstovým faktorem a základním fibroblastovým růstovým faktorem při indukci angiogeneze in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun.1992,189,824-831.[CrossRefl

22. Goto, F.; Goto, K.; Weindel, K.; Folkman, J. Synergické účinky vaskulárního endoteliálního růstového faktoru a základního fibroblastového růstového faktoru na proliferaci a tvorbu provazce bovinních kapilárních endoteliálních buněk v kolagenových gelech. Laboratoř. Investig.1993,69, 508-551.[PubMed]

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅰ