Část Ⅲ: Renální manipulace s albuminem – od raných nálezů k současným koncepcím

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Část Ⅲ: Renální manipulace s albuminem – od raných nálezů k současným konceptům

Jakub Gburek, Bogusława Konopska a Krzysztof Goł ˛ab

PRO ROZDĚLENÍ KLIKNĚTE ZDEⅠ & ČÁST Ⅱ

Abstraktní:albuminje hlavní bílkovinou krevní plazmy, lymfy, mozkomíšního a intersticiálního moku. Protein se podílí na řadě důležitých biologických funkcí, jako je udržování správného koloidního osmotického tlaku, transport důležitých metabolitů a antioxidační působení. Syntézaalbuminprobíhá hlavně v játrech a jeho katabolismus se vyskytuje většinou ve vaskulárním endotelu svalů, kůže a jater a také v tubulárním epitelu ledvin. Dlouhotrvající výzkum v této oblasti načrtl hlavní cestu jeho katabolismu zahrnující glomerulární filtraci, tubulární endocytární vychytávání prostřednictvím multiligandového scavenger receptorového tandemu – megalin a cubilin-amnion méně komplexní, stejně jako lysozomální degradaci na aminokyseliny. Výzkumy posledních desetiletí však naznačují, že v tomto procesu mohou do určité míry fungovat i další mechanismy. Přímý příjemalbuminv glomerulárních podocytech prostřednictvím receptoru pro krystalizovatelnou oblast imunoglobulinů (neonatální FCreceptor). Dále byla navržena luminální recyklace krátkých peptidů do krevního řečiště a/nebo zpět do tubulárního lumenu nebo transcytóza celých molekul. Článek pojednává o molekulárních aspektech těchto procesů a představuje hlavní poznatky a kontroverze vzniklé ve světle výzkumu za poslední desetiletí. Jejich lepší charakterizace je nezbytná pro další výzkum patofyziologie proteinurikledvinovéselhání a vývoj účinných terapeutických strategií.

klíčová slova:albumin; ledvinovékatabolismus proteinů; renální proximální tubul; proteinurie; megalin;cubilin

renální manipulace s albuminem scistanche

4. Intracelulární transport a degradace albuminu

4.1. Transport do lysozomů a degradace

Intracelulární tokalbuminprobíhá vezikulárním transportem. Díky raným experimentům se již zjistilo, že tříděníalbumin, jeho receptorů a samotných vezikul úzce souvisí s okyselením jejich prostředí. Alkalizace vezikul roztokem bafilomycinu Al nebo NHACl vedla k rychlému snížení valbuminvstřebávání i při nízkých koncentracích. Ve stejné době, jak členění oalbuminv lysozomech a recyklace receptorů do buněčné membrány byla zpomalena [48,49,86].

Acidifikace vezikul je zpočátku doprovázena disociaci klatrinového pláště a tvorbou časných endozomů. Další okyselení vede k disociacialbuminz komplexů s megalinem a cubilinem a pučením hustých apikálních tubulů, které obracejí receptory zpět na buněčný povrch. Disociace komplexů je pozorována již pod pH =6,5 [26,75,81].

Transportéry podílející se na acidifikaci endocytárních vezikul byly identifikovány v posledních letech. V-ATPáza umístěná v membráně této organely se účastní procesu přenosu protonů uvnitř endozomu [87]. Na druhou stranu je nutné zavést záporné ionty pro kompenzaci potenciálu endozomální membrány. V buňkách proximálních tubulů hrají chloridové CLC-5 kanály důležitou roli v transportu opačného iontu. Bylo prokázáno, že CLC-5 souvisí salbumin- obsahující endozomy. Nelze jej nalézt v endozomech obsahujících dextran, ačkoli V-ATP- je také přítomen v obou typech endozomů. Snížení exprese CLC-5 inhibujealbuminendocytóza v proximálním tubulu, ale neovlivňuje první fázi dextranové endocytózy. Studie provedená na myších s knockoutem genu CLC-5 potvrdila jeho význam pro recirkulaci megalinu a kubilinu. Účast CLC-5 v procesu endocytózy je také zajímavá u dědičných onemocnění ledvin. Dentova choroba, u níž je jedním z prvních příznaků proteinurie, je způsobena mutací CLC-5 kódujícího genu [88,89].

Na acidifikaci prostředí endozomálních váčků se podílejí i Na*/Ht antiportery (výměniče sodík/proton – NHE), které odstraňují H ionty z vnitřku buňky za současného příjmu iontů Nat. Přenášejí molekuly nacházející se v plazmatické membráně mnoha buněk a jejich úkolem je udržovat správné pH uvnitř buňky. Tyto proteiny se skládají ze dvou funkčních domén, a to hydrofobní domény obsahující několik transmembránových sekvencí a hydrofilní domény zodpovědné za regulaci jejich transportní aktivity [90]. Protein NHE-3 je exprimován ve střevních epiteliálních buňkách a v proximálních buňkáchledvinovétubuly, vždy na apikální straně. Je schopen cirkulovat mezi buněčnou membránou a časným endozomálním kompartmentem, čímž přispívá k okyselení obsahu vezikuly. K internalizaci transportéru NHE-3 dochází prostřednictvím klatrinových vezikul [91]. NHE-3 se pravděpodobně podílí na absorpci Na iontů v těchto buňkách. Endozomální NHE-3 hrají hlavní roli v procesualbuminmolekul endocytóza. Předpokládá se, že gradient Na plus napříč endozomálním prostředím se rozptýlí podél endozomální dráhy, a proto by NHE3 měl být důležitý pro rané kroky endocytózy, možná před stádiem (stadii), kde H plus -ATPáza vykonává svou funkci [91]. Inhibitory NHE-3 způsobují poruchy acidifikace časných vezikul, což značně zpomaluje procesalbuminendocytóza. Tyto poruchy se částečně vysvětlují zpomaleným návratem receptorů do buněčné membrány v důsledku poruch v procesu jejich disociace. Dalším důvodem může být narušení tvorby a fúze transportních vezikul alkalizací. Navíc bylo zjištěno, že NHE-3 je zodpovědný pouze za snížení pH ve velmi rané fázi endocytózy. Jeho farmakologická inhibice vede k výraznému snížení účinnosti tohoto procesu [92]. Navíc může obezita downregulovat expresi NHE-3 a Na*/K plus ATPázy v důsledku snížených hladin p-Akt faktoru a následně snížitalbuminreabsorpce a endocytóza [93]. Kromě toho existuje významný soubor NHE-3 jako multimerní komplex s megalinem v kartáčovém lemu proximálního tubulu [94]. Existuje několik mechanismů regulace endocytózy. Nicméně, v případěalbuminreabsorpce, jsou špatně pochopeny.

Ionty vápníku tento proces přímo neovlivňují. Změna cytoplazmatické koncentrace Ca2iontů ovlivňuje pouze mírněalbuminpříjem. Jejich úplné odstranění z extracelulárního prostoru však vede k výraznému snížení schopnosti absorpce proteinů (Km vzroste z 0,1.10-6na 2,5.10-6M), aniž by došlo k nárůstu vliv na maximální rychlost absorpce. Přítomnost iontů vápníku pravděpodobně určuje účinnost prvního stadia endocytózy, tj. vazby ligandů na receptory [95]. Je známo, že stimulace proteinkinázy A(PKA) cyklickým adenosinmonofosfátem (cAMP), forskolinem nebo parathormonem vede ke snížení celkovýchalbuminschopnost zpětného vychytávání, ale nemění afinitu proteinu k receptoru. Tento základní mechanismus související s alkalizací časných endozomů závisí na přítomnosti cAMP. Účinek fosfatidylinositol 3-kinázy (PI-3K) naalbuminbyla také popsána endocytóza [92,96]. Inhibice jeho aktivity použitím wortmanninu výrazně oslabuje účinnost tohoto procesu. Aktivita fosfatidylinositol3-kinázy souvisí s fází internalizace ligandů. Proteiny G se také účastní signální kaskády spojené salbumininternalizace. Příjem zalbuminje zvýšena v epiteliálních buňkách ledvin vačice (OK buňky) transfekovaných genem podjednotky G. i3. Tento účinek byl potlačován pertusovým toxinem, jak se koncentrace a inkubační doba prodlužovaly. Zdá se tedy, že úloha G proteinů úzce souvisí s regulací procesů vezikulárního transportu [56,97,98].

cistanche mužské výhody

4.2. Lysozomální degradace

Lysozomální hydrolýza proteinů probíhá za účasti souboru lysozomálních proteáz, souhrnně označovaných jako katepsiny. Nejdůležitější role při degradaci proteinů je přisuzována katepsinu B, H a L. Tyto hydrolázy jsou transportovány ve formě proenzymů do časných endocytárních vezikul zahrnujících mannoso{0}}fosfátový receptor a jsou aktivovány, když dozrávají. K částečné hydrolýze proteinů dochází již v endozomech, avšak masivní degradace probíhá pouze v lysozomech. Imunocytochemické studie ukazují, že v epiteliálních buňkách proximálního tubulu lze rozlišit alespoň několik různých populací endozomů a lysozomů, pokud jde o složení katepsinu [99]. Nedávné studie ukazují, že fúzealbumin-obsahující endozomy s lysozomy závisí na membránových receptorech těchto organel. Proteinurie se vyskytuje u myší s lysozomálním knockoutem SCARB2/Limp{2}}, které patří do rodiny vychytávacích receptorů třídy B, navzdory správné expresi a internalizacialbuminreceptory. U těchto myší byla nalezena fluorescenčně značenáalbuminbyl účinně absorbován po intravenózním podání, ale nekolokoval s lysozomálním katepsinem B a nebyl degradován. Podobný účinek byl také pozorován u myší divokého typu s masivní albuminurií vyvolanou ipalbuminpodání, což ukazuje, že na úrovni proximálního tubulu hraje omezená kapacita lysozomální degradace ve vzniku albuminurie důležitější roli než schopnost jeho reabsorpce [100,101]. Nicméně studie Nielsena et al. [102] odhalili, že lysozomální kapacita je zvýšena při proteinurii v myším modelu fokální segmentální glomerulosklerózy (FSGS), což podporuje předchozí zjištění, že kapacita lysozomálního trávení může být zvýšena při proteinurii [99].

Velká část experimentálních dat naznačuje, že proteiny – včetněalbumin— jsou zcela degradovány v lysozomech na volné aminokyseliny, které jsou pak transportovány přes lysozomální a bazolaterální membránu do krevního řečiště. V experimentech s použitím izolovaných, perfundovaných proximálních tubulů králičích a 125I značených proteinů je téměř veškerá radioaktivita perfuzátu spojena s jejich katabolitem2I-mono tyrosinem. Podobné výsledky byly získány při měření efluxu radioaktivity z řezů ledvin perfundovaných radioaktivně značenými proteinovými přípravky [26,47].

Výsledky studií v tomto ohledu však nejsou konzistentní. Někteří autoři naznačují, že lysozomální degradacealbuminnení kompletní a jeho produkty jsou převážně polypeptidové řetězce různé délky, které se vracejí do lumen tubulu a vylučují se močí. Osicka et al [103,104] prokázali, že významná množství peptidů odvozených od degradovalaalbuminse nacházejí v moči po intravenózním podání 3H-albuminna krysy. Velikost pozorovaných fragmentů však ve své studii neupřesnili.

Podobné výsledky získali Gudehithlu et al. [105] intravenózním podáním 125I-značenéhoalbuminna krysy. Močové proteiny byly vysráženy kyselinou trichloroctovou a podrobeny gelové filtraci umožňující stanovení jak fragmentů, tak celku.albuminmolekul. Malé množství nativníalbumin(2 procenta) a významné množství jeho fragmentů (98 procent) s molekulovou hmotností 5-14 kDa bylo nalezeno v moči. Tyto výsledky také potvrdily experimenty in vitro na buňkách lidského proximálního tubulu HK-2 a ex vivo s použitím perfundovaných ledvin potkana. Množstvíalbuminvyloučený ve formě celých molekul a polypeptidů byl asi 70-krát vyšší než dosud stanovené hodnoty: Nízkomolekulární fragmentyalbuminv moči byly také nalezeny ve studiích u potkanů ​​s diabetem způsobeným podáváním streptozotocinu [35].

Tyto nesrovnalosti mohou souviset s použitím radioimunologických metod v předchozích studiích, které nedetekují polypeptidové fragmenty postrádající specifické epitopy k aplikovaným protilátkám, což by se mohlo stát v případěalbumindegradační produkty. Stojí za zmínku, že takové částkyalbuminvyloučených močí by odpovídalo množství filtrovanéhoalbumins předpokladem relativně velkého GSC, jak bylo diskutováno výše.

Nedávné studie naznačují, žealbuminfragmenty pozorované v moči nejsouledvinovékatabolity, ale jsou účinkem volné glomerulární filtrace, unikající tubulární resorpci způsobem, který dosud nebyl rozpoznán. Jak u kontrolních myší, tak i u myší s cubilin nebo megalin knockout, hlavně nízkomolekulárníalbuminmetabolity byly nalezeny v moči po 125Ialbuminspráva. Inhibice tubulární endocytózy neovlivnila formualbuminpřítomný v moči. Generování nízkomolekulárníchalbuminfragmenty byly také pozorovány v plazmě [106].

4.3. Transcytóza

Úloha transcytózy jako alternativního způsobu internalizacealbumincílení navrhl Russo et al. v roce 2009[33]. Ve své studii pomocí elektronové mikroskopie a koloidního zlata značenéhoalbumin, autoři pozorovali přítomnostalbuminnejen v lysozomech, ale i ve velkých vezikulách o průměru kolem 500 nm. Tyto struktury se vyskytovaly v celé buňce a byly často fúzovány s invaginací bazolaterální membrány a uvolňovaly její obsah do peritubulární sítě kapilárních cév. Integrita molekul byla kontrolována pomocí protilátek namířených proti různýmalbuminfragmenty. Autoři předpokládají koexistenci dvou intracelulárních mechanismůalbumintřídění v závislosti na integritě molekul. Intaktní molekuly bílkovin se vrací do oběhu rychlou a účinnou transcytózou, zatímco malá část molekul vykazujících strukturální změny je transportována do lysozomů, kde se podle klasického modelu rozloží na aminokyselinové zbytky a v této formě se vrátí zpět do oběhu [33,38]. Model vzbudil četné kontroverze. Odpůrci této teorie s přihlédnutím k mnohaletému mikroskopickému zkoumání buněk proximálního tubulu podkopávají existenci těchto typů vezikul a možnost jejich fúze s bazolaterální membránou. Naznačují, že pozorované struktury jsou výsledkem artefaktů souvisejících s fixací tkáně ponořením. Dosud byly používány metody založené na perfuzi, považované za optimální [41 107l. Na druhou stranu nedávné studie na nefrotických myších s knockoutem podocin, megalin a cubilin ukazují, že endocytóza, závislá na těchto receptorech, není významná pro udrženíalbuminhomeostáze. Přes totální inhibici reabsorpce v závislosti na těchto receptorech plazmaalbuminúrovně zůstaly stejné [108].

cistanche mužské výhody

5. Závěry

Ledviny jsou zodpovědné za asi 10 procentalbuminbazén katabolizován denně. Tato frakce je významná pro homeostázu. Případné abnormality funkce ledvin, zpočátku způsobené probíhajícím poškozením glomerulů, mohou nakonec vést k těžkému selhání tohoto orgánu a následně k nevratnému tubulárnímu poškození. Sekundární toxicita je připisována dysregulaci funkcí epiteliálních buněk v důsledku přetížení proteiny za podmínek nadměrné endocytózy v proximálních tubulech [10].Renálníkatabolismus proteinů zahrnuje filtraci v glomerulu, adsorpci a endocytózu v proximálních tubulech a intracelulární hydrolýzu nebo transcytózu absorbovaných molekul.

Běžně přijímaný model předpokládá relativně nízkou úroveň glomerulárníalbuminfiltrace díky své relativně velké velikosti a nízkému izoelektrickému bodu, účinná reabsorpce endocytózou, zahrnující megalinové a cubilinové receptory, vezikulární transport do lysozomů a hydrolýza na jednotlivé aminokyselinové zbytky. V tomto modelu jen zanedbatelné množstvíalbuminse vylučuje močí a produkty rozkladu se většinou vracejí do oběhu.

Studie, které byly provedeny v posledním desetiletí, přinesly mnoho neočekávaných pozorování, která mohou dramaticky změnit pohled na toto téma.ledvinovéalbuminkatabolismus. Vznikají z nich alternativní mechanismy, které ovlivňují jak kvantitativní, tak kvalitativní obraz tohoto procesu. Nové studie mimo jiné naznačují, žealbumink permeaci může dojít s {{0}}krát vyšším výtěžkem, než naznačovaly předchozí studie. Navrhovaná hodnota GSC by pak byla 0,04, ne nižší než 0,001 jako v aktuálně přijímaném modelu [33]. Další kontroverze se týkají stupně lysozomální degradacealbumina směr vylučování metabolitů. Některá pozorování podporují názor, že lysozomální proteolýzaalbuminprodukuje hlavně polypeptidy s molekulovou hmotností 5-14 kDa, které jsou z velké části recyklovány do lumen tubulu a vylučovány močí. Zprávy o fenoménualbumintranscytóza je také překvapivá. Tento mechanismus by vysvětloval účinnou absorpci a transport většího množství filtrované látkyalbumin. Tyto zprávy současně naznačují, že dysfunkce proximálních tubulů přispívají hlavně k albuminurii v průběhu různých onemocnění, a nikoli, jak se dříve myslelo, glomerulopatií. Současné koncepce a nové poznatky týkající se ledvinalbuminmanipulace jsou shrnuty na obrázku 2.

Nové zprávy vyvolaly bouřlivou diskusi ve světě vědy. Pokud se potvrdí v dalších studiích, mohou změnit názory na mechanismusalbuminhomeostáza a patomechanismy onemocnění spojených s albuminurií, jako je nefrotický syndrom,ledvinovéselhání proti hypertenzi, diabetické nefropatii a kardiovaskulárním chorobám.

Stojí za zmínku, že během základních studií struktury ledvinových epiteliálních buněk byla shromážděna celá řada dat v oblasti proximální tubulární reabsorpce, lysozomálního metabolismu a intracelulárního zpracování. Úspěchy byly shrnuty v několika vynikajících recenzích [109-112].

cistanche mužské výhody

6. Perspektivy

S přihlédnutím k dostupným datům se domníváme, že alternativní modely nejsou dosud dostatečně zdokumentovány a vývoj nových terapeutických strategií by měl vycházet z aktuálně přijímané koncepce.

Aby bylo možné ověřit význam v současnosti přijímaných a alternativních koncepcí, jsou zapotřebí další výzkumy. Je zaručen vývoj nových zvířecích modelů a podrobnější klinické studie zahrnující relevantní molekuly, jako jsou glomerulární proteiny, endocytární receptory, vezikulární transportéry a další endozomální/lysozomální proteiny.

Reference

1. Evans, TWRecenze článku:albuminjako drogově-biologický účinekalbuminnesouvisející s onkotickým tlakem. Aliment.Pharmacol. Ther. 2002, 16 (Suppl.5), 6-11. [CrossRef] [PubMed]

2. Vincent, JL Relevancealbuminv moderní medicíně intenzivní péče. Nejlepší. Praxe. Res. Clin.Anaesthesiol.2009, 23,183-191. [CrossRef] [PubMed]

3. Miller,A.;Jedrzejczak, WWalbumina—Funkcje biologiczne i znaczenie kliniczne. Postepy Hig. Med. Dosw. 2001,55,17-36.

4. Peters, JTAAll Aboutalbumin: Biochemie, genetika a lékařské aplikace; Academic Press: San Diego, CA, USA, 1996.

5. Artali, R.; Bombieri, G; Calabi, L.; Del Pra, A. Studie molekulární dynamiky lidského séraalbuminvazebná místa. Farmaco 2005, 60, 485-495.[Crossref]

6. Quinlan, GJMartin, GS; Evans, TWalbumin: Biochemické vlastnosti a terapeutický potenciál.Hepatologie 2005,41,1211-1219. [CrossRef]

7. Nicholson,JP;Wolmarans,MR;Park,GRRolealbuminv kritické nemoci.Br.J.Anaest.2000,85,599-610.[CrossRef] [PubMed]

8. Powers, KA;Kapus, A.;Khadaroo, RG;He,R.; Marshall, JC; Lindsay, TF; Rotstein, ODT dvacet pět procentalbuminzabraňuje poranění plic po šoku/resuscitaci. Crit. Care Med.2003,31,2355-2363.[CrossRef][PubMed]