Část první Rozdíly v močovém proteomu u psího diabetu s a bez přítomnosti mikroalbuminurie

Jednoduché shrnutí

Cukrovka psů je závažné onemocnění, které může vést k řadě komplikací. K dispozici jsou omezené údaje o proteomice moči u psů a žádný vliv diabetes mellitus na proteom moči. V této studii jsme se zaměřili na analýzu proteinového složení moči odebrané od zdravých zvířat a porovnání se dvěma skupinami diabetiků (normoalbuminurické a mikroalbuminurické). Mezi těmito třemi skupinami jsou významné rozdíly a domníváme se, že identifikované proteiny jsou slibné jako potenciální diagnostický nástroj, který lze později využít v klinické praxi a pro lepší pochopení onemocnění.

Abstraktní

V této studii jsme se zaměřili na analýzu proteinového složení moči odebrané od zdravých zvířat a porovnání se dvěma diabetickými skupinami (DM I normoalbuminuričtí diabetici psi; DM II diabetici psi s mikroalbuminurií). Pokusili jsme se identifikovat potenciální proteiny v moči, které by mohly být up nebo downregulovány u diabetických pacientů ještě před objevením se mikroalbuminurie. Metody: Po získání moči jsme provedli dvourozměrnou elektroforézu a následně softwarovou analýzu Delta2D, která umožnila selekci a identifikaci statisticky významně odlišně exprimovaných proteinů pomocí MALDI-TOF spektrometrie. Naše studie odhalila 286 běžných proteinových skvrn na 2D gelech od diabetiků a kontrolní skupiny. Z těchto proteinů bylo pět pozitivně identifikováno pomocí MALDI-TOF MS. K dalšímu hodnocení pěti diferencujících proteinů byl použit program Panther k jejich přiřazení k příslušným biologickým procesům. Závěr: Významný počet identifikovaných proteinů hraje roli v intracelulární signalizaci – tvorbě vezikul, vazeb a transportu přes membrány. To může naznačovat, že první známky diabetického buněčného poškození ledvin mohou být pozorovány ve složení moči dříve, než se objeví jakékoli klinické příznaky.

Klíčová slova

poškození ledvin; diabetická nefropatie; psí diabetes mellitus; markery moči; proteomický.

Kliknutím sem získáte výhody Cistanche

Úvod

Diabetes mellitus (DM) je poměrně častá endokrinopatie vyskytující se převážně u psů středního a vyššího věku [1,2]. Může vést k řadě komplikací, jako je vaskulopatie, systémová hypertenze a nefropatie [1]. Vzhledem ke krátké délce života se tyto komplikace u malých zvířat vyskytují zřídka, ale mohou způsobit významné onemocnění [3,4]. Existuje také nedostatek informací o koncentraci albuminu v moči u psů se spontánním DM. V předchozí studii bylo zjištěno, že 20 procent psů s diabetem trpí proteinurií na základě poměru proteinů ke kreatininu v moči (UPC) > 1 a 46 procent bylo hypertenzních [5]. Mazzi a kol. zaznamenali zvýšenou koncentraci albuminu u 55 procent diabetických psů, přičemž více než polovina z nich měla současně zvýšení poměru proteinů v moči ke kreatininu (UPC) [6]. V jiné studii byla prevalence mikroalbuminurie u diabetických pacientů na stejné úrovni, navíc se u dvou ze tří psů s mikroalbuminurií a normálním UPC při počátečním hodnocení vyvinul zvýšený UPC během longitudinální studie [4].

Urinary proteins are a promising target for detecting kidney injury. Only a minimal amount of proteins is present in normal urine, due to the mechanical barrier of the glomerulus, and the reabsorption in the proximal tubules. Urinary total protein (UTP) contains proteins originating from filtered plasma, lower urinary tract, and kidney-derived proteins. High urinary protein concentration can be a result of nephron dysfunction, as a healthy glomerular filtration barrier excludes proteins larger than 69 kDa, the molecular weight of albumin. Also, it is worth noticing that positively charged proteins pass the glomerular barrier easier than negatively charged ones. In conditions of disease, the glomerular barrier gradually collapses, allowing large amounts of proteins of high, or intermediate weight to pass into the ultrafiltrate. Proteins of small molecular weight (>69 kDa) jsou volně filtrovány v glomerulu, ale později jsou reabsorbovány proximálními tubuly ledvin, proto primární i sekundární tubulární dysfunkce může vést k proteinurii [7].

Pokroky v proteomické a metabolomické studii zvýšily naši schopnost identifikovat tisíce proteinů a peptidů v moči v jediné analýze – z nichž některé mohou sloužit jako nové markery. Tato rozsáhlá studie proteinů se nazývá proteomika, zatímco studium přirozeně se vyskytujících peptidů generovaných endogenní proteázovou aktivitou se nazývá peptidomika. Proteomická analýza se stala také důležitým nástrojem ve veterinárním výzkumu [8–12]. Charakterizace psího močového proteomu u zdravých psů již byla zkoumána [13]. Proteomika moči a peptidomika přidávají různé dimenze ke zkoumání základní biologie [14]. Jejich aplikace v moči má důležité klinické důsledky pro diabetické onemocnění ledvin, vzhledem k tomu, že moč lze relativně snadno sbírat neinvazivně a je přímo produkována ledvinami. Změny v relativním množství proteinů a peptidů v moči jako takové mohou odrážet změny v expresi, ukládání nebo obratu proteinů v diabetické ledvině [15]. Navzdory dobře rozvinutému veterinárnímu výzkumu týkajícímu se psů s diabetem zůstávají zprávy o molekulárních studiích moči řídké [11,13,14,16,17].

Cílem této studie bylo identifikovat proteiny v moči zdravých zvířat a porovnat ji se dvěma diabetickými skupinami (normoalbuminuričtí psi a psi s mikroalbuminurií). Pokusili jsme se identifikovat potenciální proteiny v moči, které by mohly být up nebo downregulovány u diabetických pacientů ještě před objevením se mikroalbuminurie.

Doplňky Cistanche a extrakt Cistanche

Materiály a metody

Všichni psi z ambulantní populace byli postupně zapsáni v průběhu dvou let 2018–2020 v Inovativním centru pro zvířecí patologii a terapii Fakulty veterinárního lékařství v Lublinu. Všechny vzorky byly získány během standardních veterinárních diagnostických postupů; podle polského práva tedy nebylo vyžadováno schválení Místní komisí pro etiku při pokusech na zvířatech, protože neexistovala žádná léčba, včetně lékařské, invazivní diagnostiky nebo postupů způsobujících účastníkům psychické nebo sociální nepohodlí. Experimenty byly provedeny na základě legislativní směrnice Evropské unie 2010/63/EU. Studie byla provedena v souladu s pokyny ARRIVE. Majitelé psů byli informováni o metodách a účelu studie a dali svůj písemný informovaný souhlas. Studie byla provedena na třech skupinách psů: DM I skupina sestávající ze 7 normoalbuminurických diabetických psů (4 samci, 3 feny, průměrný věk: 7); skupina DM II sestávající ze 7 diabetických psů s mikroalbuminurií (3 samci, 4 feny, průměrný věk: 8); H skupina se skládá ze 7 zdravých psů (4 psi, 3 feny, průměrný věk: 7).

DM byl diagnostikován nálezem přetrvávající výrazné hyperglykémie (glukóza v plazmě > 200 mg/dl; 11 mmol/l) a glukosurie u psů s klinickými příznaky odpovídajícími onemocnění (polyurie, polydipsie, úbytek hmotnosti).

Kromě toho majitelé vyplnili standardizovaný dotazník, aby dokumentovali změny ve spotřebě vody a potravy, frekvenci močení a aktivitě v poměru k normálu u jejich mazlíčků.

Jako studijní skupina bylo 14 z celkového počtu 30 psů diabetických smíšených plemen předložených majitelem způsobilých k zařazení. Požadavky na zařazení byly: (1) předchozí diagnóza diabetes mellitus; (2) léčba inzulínem po dobu alespoň tří měsíců; (3) klinicky stabilní diabetes. Kritéria pro vyloučení byla: proteinurie (poměr proteinů v moči ke kreatininu > 0,5), aktivní močový sediment, pankreatitida, hyperaktivita nadledvin, hnisavý zánět dělohy a bakteriální záněty ledvin nebo močového měchýře. Jako kontrolní skupina bylo zahrnuto 7 zdravých psů různých plemen. Byli považováni za zdravé na základě fyzikálního vyšetření, kompletního krevního obrazu, profilu biochemie plazmy a analýzy moči. Kontrolní skupina byla vybrána tak, aby byla věkově shodná se studijní skupinou.

U každého psa bylo provedeno klinické vyšetření s měřením krevního tlaku, rutinní biochemické a hematologické krevní testy a analýza moči. Každý vzorek krve byl odebrán pomocí uzavřeného vakuového systému do zkumavky obsahující EDTA a podroben hematologické analýze v analyzátoru Exigo Vet (Boule, Spånga, Švédsko). Plazma získaná po centrifugaci při 3000 ot./min po dobu 15 minut při 4 °C byla analyzována v automatickém biochemickém analyzátoru BS-130 (Mindray, Shenzhen, Čína). Chemický panel zahrnoval alanin transferázu, aspartátaminotransferázu, celkový bilirubin, močovinu, kreatinin, alkalickou fosfatázu, glukózu, albumin, celkový protein, amylázu, -glutamyltransferázu. Byla také stanovena koncentrace sérového kortizolu pomocí enzymaticky amplifikovaného chemiluminiscenčního testu (analyzátor Immulite 1000). U diabetických psů byla glykemická kontrola odhadnuta pomocí koncentrace fruktosaminu v séru. Vzorky vyprázdněné střední moči byly odebírány ráno a každý vzorek byl centrifugován v den odběru při 500 x g po dobu 10 minut při 4 °C. Supernatanty byly odstraněny a byly přidány inhibitory proteázy (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, P8340, Spruce Street, Saint Louis, MO, USA.) Celkové proteiny v moči a kreatinin byly stanoveny pomocí komerčních souprav na automatickém chemickém analyzátoru (Mindray BS{11 }}). UPC bylo vypočteno pomocí následujícího vzorce: UPC=protein v moči (mg/dl)/kreatinin v moči (mg/dl). Základní analýza moči s mikroskopickou analýzou sedimentu byla provedena na čerstvých vzorcích moči. Specifická hmotnost moči (USG) byla měřena pomocí refraktometru. Mikroalbuminurie byla měřena pomocí komerčně dostupné testovací soupravy ELISA (Canine Microalbuminuria Elisa Kit, My Biosource, San Diego, CA, USA). Test mikroalbuminurie byl proveden podle pokynů výrobce. Albuminurie byla hodnocena poměrem albuminu ke kreatininu v moči (UACR) v čerstvém vzorku moči. Zbývající moč byla zmražena na -80 ◦C pro další analýzu.

Standardizované Cistanche

Proteomická analýza moči

Pro proteomickou analýzu bylo odebráno 7 jednotlivých vzorků moči ze skupiny I (DM I), 7 jednotlivých vzorků moči ze skupiny II (DM II) a 7 jednotlivých vzorků moči ze zdravé skupiny (H).

Každý vzorek moči byl purifikován, odsolen a koncentrován pomocí odstředivých filtračních jednotek Amicon Ultra-0.5 3 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Koncentrace proteinů byly měřeny mikroobjemovým spektrofotometrem (MaestroNano, Maestrogen, Xinzhu, Taiwan) a vzorky moči byly poté připraveny a podrobeny 2D elektroforéze. Po grafické a statistické analýze byly sledované proteiny vyříznuty z gelu pro další identifikaci pomocí hmotnostní spektrometrie pomocí techniky MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry).

1. 2D elektroforéza

Dvourozměrná elektroforéza byla první fází výzkumu, který vedl k separaci bílkovin v moči. Stručně řečeno, 200 µg proteinu na 17 cm proužek bylo přijato pomocí srážecí sady (Ready-Prep™ 2-D Cleanup Kit, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) . Proteinové pelety byly rozpuštěny v rehydratačním pufru (ReadyPrep 2-D Rehydratation/Sample Buffer 1, BioRad, Hercules, CA, USA) a výsledné roztoky byly naneseny na rehydratační destičku pokrytou 17 cm imobilizovaným pH gradientem (IPG ) lineární proužky pro izoelektrickou fokusaci (ReadyStrip IPG Strips, pH 3–10, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a minerální olej (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Po 12 hodinách rehydratace byly proužky s nasáklými proteiny přeneseny do IEF-100 Hoeferova zařízení (Hoefer IEF100, Hoefer, Inc., Holliston, MA, USA), aby se provedla elektroforéza v prvním rozměru (podmínky procesu: 250 V /30 min; 10,000 V/3 h; 60 kV/h, s proudovým limitem 50 µA/pásek). Dále byly proužky postupně ekvilibrovány v roztocích 1,4-dithiothreitolu a jodacetamid močoviny/TRIS/SDS. Každý ekvilibrační krok trval 15 minut. Ekvilibrované proužky byly poté podrobeny druhé dimenzi elektroforézy, aby se oddělily proteiny podle jejich molekulových hmotností ve 12,5% polyakrylamidových gelech s následujícími aktuálními parametry: 600 V/30 mA/100 W v elektroforetické komoře (PROTEAN® II xi, Bio-Rad , Hercules, CA, USA). Získané gely byly podrobeny standardnímu postupu barvení stříbrem dusičnanem stříbrným v přítomnosti formaldehydu. Po obarvení byly gely naskenovány pomocí Image Scanner III (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) a zpracovány softwarem Delta2D (verze 4.7, DECODON, Greifswald, Německo). Statistická analýza byla provedena po manuálním vyloučení falešně pozitivních a falešně negativních skvrn. Naskenované obrázky byly deformovány technologií SmartVectors v softwaru Delta2D, což znamená, že skvrny stejného proteinu měly stejnou polohu ve všech gelech v projektu. Použití deformace gelového obrazu umožnilo eliminaci rozdílů mezi gelovými obrazy a jejich zarovnání. Dále byly k vytvoření sloučených obrázků použity zdeformované obrázky. Fúzovaný obraz odpovídá mapě proteomu obsahující každou proteinovou skvrnu získanou v celém experimentu. Byly vytvořeny expresní poměry a byly provedeny statistiky pro normalizované objemy pomocí jednocestné ANOVA (p-hodnota menší než nebo rovna 0,05) a post hoc Tukeyho srovnávacího testu. Označené proteinové skvrny byly vyříznuty z gelů, odbarveny, redukovány a alkylovány pomocí roztoků dithiothreitolu a jodacetamidu. Kousky gelu obsahující proteiny byly podrobeny tryptickému štěpení za účelem získání peptidových fragmentů. Štěpení trypsinem probíhalo v 50 mM pufru hydrogenuhličitanu amonného při 37 °C po dobu 12 hodin (Promega, Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Technical Bulletin). Peptidy byly následně eluovány z kousků gelu roztokem voda/acetonitril/TFA (objemově 45:50:5) trojitou extrakcí a získané extrakty byly zakoncentrovány ve vakuu (Labconco, Kansas City, MO, USA). Získané peptidové pelety byly rozpuštěny v 0,1% kyselině trifluoroctové a vyčištěny pomocí špiček pipet C18 Zip-TIP podle pokynů výrobce (Merck Chemicals, Billerica, MA, USA, PR 02358, technická poznámka) a připraveny k analýze hmotnostní spektrometrií.

Cistanche pilulky

2. Hmotnostní spektrometrie

Jeden ul připravených peptidových roztoků byl nanesen na destičku Anchor Chip MALDI (Bruker, Brémy, Německo). Když byly vzorky proteinů vysušeny, jejich povrchy byly pokryty 1 ul matrice kyseliny -kyano-4-hydroxyskořicové (HCCA, Bruker, Brémy, Německo). Standardní roztok peptidu (Peptide Calibration Standard II, Bruker, Bremen, Německo) byl také nanesen a pokryt matricí na kalibračních místech. Hmotnostní spektra byla zaznamenána v režimu aktivního pozitivního reflektoru v rozsahu 700–4{20}}00 m/z pomocí spektrometru Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker, Brémy, Německo) a software flexControl 3.3 (Bruker, Brémy, Německo). Shromážděná spektra byla vyhlazena a korigována na základní linii. Seznam vrcholů pro poměr signál/šum > 3, vytvořený v softwaru flexAnalysis 3.0 (Bruker, Brémy, Německo), byl přenesen do BioTools 3.2 (Bruker, Brémy, Německo) a porovnán se softwarem Mascot 2.2 (Matrix Science, Boston, MA, USA) pomocí databáze Swiss-Prot omezené na taxonomii „savců“ s maximální chybou 0,3 Da a karbamidomethylací cysteinu jako povinnou modifikací. Výsledky se skóre maskota nad 61 byly považovány za statisticky významné (p menší nebo rovno 0,05); jinak byla fragmentová iontová spektra vybraných peptidů získána pomocí LIFT módu a kombinována s cílem identifikace MALDI TOF/TOF.

Reference

1. Hoenig, M. Srovnávací aspekty diabetu melitus u psů a koček. Mol. Buňka. Endocrinol. 2002, 197, 221–229.

2. Davison, LJ; Herrtage, ME; Catchpole, B. Studie 253 psů ve Spojeném království s Diabetes Mellitus. Vet. Rec. 2005, 156, 467–471.

3. sledě, IP; Panciera, DL; Werre, SR Longitudinální prevalence hypertenze, proteinurie a retinopatie u psů se spontánním diabetem mellitus. J. Vet. Internovat. Med. 2014, 28, 488–495.

4. Muñana, KR Dlouhodobé komplikace diabetu melitus, část I: Retinopatie, nefropatie, neuropatie. Vet. Clin. N. Am. Malé zvíře. Praxe. 1995, 25, 715–730.

5. Struble, AL; Feldman, EC; Nelson, RW; Kass, PH Systémová hypertenze a proteinurie u psů s diabetem mellitus. J. Am. Vet. Med. Doc. 1998, 213, 822–825.

6. Mazzi, A.; Fracassi, F.; Dondi, F.; Gentilini, F.; Famigli Bergamini, P. Poměr bílkovin v moči ke kreatininu a albuminu ke kreatininu u psů s diabetem mellitus a hyperadrenokorticismem. Vet. Res. Commun. 2008, 32 (Suppl. S1), S299–S301.

7. D'Amico, G.; Bazzi, C. Patofyziologie proteinurie. Kidney Int. 2003, 63, 809-825.

8. Banach, T.; Adaszek, Ł.; Wyłupek, D.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S. Použitelnost 2D gelové elektroforézy a kapalinové chromatografie v proteomické analýze moči pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Pol. J. Vet. Sci. 2013, 16, 587–592.

9. de Freitas Campos, C.; Cole, N.; Dyk, DV; Walsh, BJ; Diakos, P.; Almeida, D.; Torrecilhas, A.; Laus, JL; Willcox, MDP Proteomická analýza psích slz pro potenciální markery rakoviny. Res. Vet. Sci. 2008, 85, 349–352.

10. Winiarczyk, D.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S.; Michalák, K.; Adaszek, Ł. Proteomická analýza slzného filmu získaného od diabetických psů. Zvířata 2020, 10, 2416.

11. Winiarczyk, D.; Michalák, K.; Adaszek, L.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S. Močový proteom psů s poškozením ledvin během babeziózy. BMC Vet. Res. 2019, 15, 439.

12. Franco-Martínez, L.; Gelemanovič, A.; Horvatič, A.; Contreras-Aguilar, MD; Mrljak, V.; Cerón, JJ; Martínez-Subiela, S.; Tvarijonaviciute, A. Proteom séra a slin psů s diabetem mellitus. Anim. Open Access J. MDPI 2020, 10, 2261.

13. Brandt, LE; Ehrhart, EJ; Scherman, H.; Olver, CS; Bohn, AA; Prenni, JE Charakterizace psího močového proteomu. Vet. Clin. Pathol. 2014, 43, 193–205. [CrossRef] [PubMed]

14. Ferlizza, E.; Isani, G.; Dondi, F.; Andreani, G.; Vasylyeva, K.; Bellei, E.; Almeida, AM; Matzapetakis, M. Močový proteom a metabolom u psů (Canis Lupus Familiaris): Účinek chronického onemocnění ledvin. J. Proteom. 2020, 222, 103795.

15. Van, JAD; Scholey, JW; Konvalinka, A. Pohledy do diabetického onemocnění ledvin pomocí močové proteomiky a bioinformatiky. J. Am. Soc. Nephrol. 2017, 28, 1050–1061.

16. Nabity, MB; Lees, GE; Dangott, LJ; Cianciolo, R.; Suchodolski, JS; Steiner, JM Proteomická analýza moči od samců psů během časných stadií tubulointersticiálního poranění u psího modelu progresivního glomerulárního onemocnění. Vet. Clin. Pathol. 2011, 40, 222–236.

17. Pelander, L.; Brunchault, V.; Buffin-Meyer, B.; Klein, J.; Breuil, B.; Zürbig, P.; Magalhães, P.; Mullen, W.; Elliott, J.; Syme, H.; a kol. Peptidomové analýzy moči pro diagnostiku chronického onemocnění ledvin u psů. Vet. J. 2019, 249, 73–79.

Dagmara Winiarczyk 1, Mateusz Winiarczyk 2 , Katarzyna Michalak 3 , Stanisław Winiarczyk 3 a Łukasz Adaszek 3

1 Klinika vnitřních chorob malých zvířat, University of Life Sciences of Lublin, 20-400 Lublin, Polsko

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 Katedra epizootologie, University of Life Sciences of Lublin, 20-400 Lublin, Polsko; artica@wp.pl (KM); genp53@interia.pl (SW); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)