ČÁST PRVNÍ Fenylethanolové glykosidy chrání hypertrofii myokardu indukovanou konstrikcí břišní aorty prostřednictvím inhibice demetylace ECE-1 a zlepšení dráhy PI3K/PKB/eNOS

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Qiong-Ling Fan, 1 Jia-Wei Wang, 1 Shi-Lei Zhang a kol.

Fenylethanolové glykosidy (CPhG)jsou základním materiálním základem farmakologické aktivity vCistanche tubulosaa mají různé farmakologické účinky. Není však jasné, zda CPhG(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) mají zmírňující účinek na hypertrofii myokardu vyvolanou tlakovým přetížením. V této studii byli samci potkanů ​​SD vážící (200 ± 20) g vytvořeni jako modely srdeční hypertrofie pomocí koarktace abdominální aorty (AAC). Po operaci byly potkanům podávány sondou odpovídající léky po dobu 6 týdnů (CPhGs(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) 125, 250 a 500 mg/kg/den a valsartan 8,3 mg/kg/den). Byla detekována echokardiografie, srdeční hmotnostní index (HWI), průřezová plocha kardiomyocytů (CSCA), plocha fibrózy, plazmatický endotelin 1 (ET-1) a hladiny prozánětlivých faktorů. Naše výsledky ukázaly, že různé CPhG(Fenylethanolové glykosidy) dávkování snížená tloušťka zadní stěny levé komory (LVPWT), enddiastolický průměr levé komory (LVED), HWI, CSCA, oblast fibrózy, ET-1, prozánětlivé faktory, arteriální natriuretický peptid (ANP), mozkový natriuretický peptid (BNP ), hladiny mRNA enzymu konvertujícího endotelin 1 (ECE-1), hladiny proteinu cyklooxygenázy 2 (COX-2), skupiny 1 s vysokou mobilitou (HMGB{7}}) a ECE{{8} } úroveň demetylace při zvýšení ejekční frakce levé komory (LVEF), frakční zkrácení levé komory (LVFS), fosforylovanou fosfatidylinositol 3-kinázu (p-PI3K), fosforylovanou proteinkinázu B (p-PKB) a fosforylovaný endoteliální oxid dusnatý syntetáza (p-eNOS). -e indexy CPhG(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) skupina 250 a 500 mg/kg se významně lišila od skupiny AAC; ve srovnání s valsartanovou skupinou (AV) se indexy CPhG 500 mg/kg významně nelišily. Na závěr CPhGs(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) zlepšila hypertrofii myokardu u potkanů ​​pomocí AAC, což může souviset s inhibicí demetylace ECE- 1 a zesílením PI3K/PKB/eNOS.

2. Materiály a metody

2.1.Zvířata.

70 samců potkanů ​​SPF SD o hmotnosti 200 ± 20 g (10 na skupinu) bylo poskytnuto Experimentálním zvířecím centrem lékařské univerzity Xinjiang (Urumqi, Čína). Číslo licence živočišné výroby bylo SYXK(XIN)2016-0003 a číslo certifikátu bylo SCXK(XIN)2016-002. - Studie byla schválena Výborem pro etiku zvířat První přidružené nemocnice lékařské univerzity Xinjiang (číslo schválení 20180223-183). -ey byly chovány s volným přístupem k vodě a potravě v plastových klecích a chovány ve 12h cyklu světlo/tma při teplotě 22 ± 2 stupně a vlhkosti 45–55 procent v našem Centru pro experimentální zvířata.

2.2. Materiály.

CPhGs(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) , jehož obsah echinacey byl více než 40 procenta a akteosidu více než 16 procent, byl zakoupen od společnosti Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartan byl zakoupen od společnosti Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Sodná sůl karboxymethylcelulózy (CMC-Na) poskytla společnost Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. A CPhG byly rozpuštěny v 0,5 procentech CMC-Na.

Fenyletanoild glykosidy z cistanche

2.3. Koarktace břišní aorty (AAC).

Po anestetizaci 2,5 procenta pentobarbitalu sodného (2,5 ml/kg) (Merck, Darmstadt City, Hessen, Německo) byly krysy oholeny a udržovány v teple na vyhřívaných podložkách. břišní dutina potkana byla otevřena na 2 cm uprostřed břicha ve sterilním prostředí, břišní vnitřnosti byly vytlačeny na pravou stranu a břišní aorta byla plně obnažena v 0,5 cm nad pravou renální tepnou. Jehla číslo 8 byla podvázána drátem číslo 2 paralelně s břišní dutinou, která byla sešita [18]. Abdominální aorty krys ve skupině s falešnou léčbou byly odděleny bez podvázání a pro operaci nebyla žádná kontrolní skupina. - den po operaci byly CPhG krmeny AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg a AC 500 mg/kg(Fenyletanoild glykosidy z cistanche)žaludeční sondou; AV skupina byla krmena valsartanem žaludeční sondou; a kontrolní skupina, AAC skupina a falešná skupina nebyly krmeny CPhG nebo valsartanem jednou denně po dobu 42 po sobě jdoucích dnů. Dávka léčiva byla stanovena na základě předchozích odkazů a předběžných experimentů [8].

2.4. Echokardiografie.

Šest týdnů po AAC byly krysy anestetizovány 2,5 procenty pentobarbitalu sodného a byla provedena echokardiografie (Philips HD11 XE, Amsterdam, Nizozemsko). LVPWT, LVED, LVEF a LVFS byly měřeny čtyřikrát pro výpočet průměrů jako konečných ukazatelů.

2.5. Index srdeční hmotnosti (HWI).

Po echokardiografii byly krysy popraveny odběrem krve z břišní aorty. Srdce krys byla vyjmuta z hrudníku a zvážena poté, co byla třikrát promyta normálním fyziologickým roztokem (4 stupně) a vysušena čistým filtračním papírem. -e HWI byla vypočtena pomocí následujícího vzorce: HWI � hmotnost srdce tělesná hmotnost. (1)

2.6. Hematoxylin-eosin a Massonovo barvení.

-e myokard z levé komory byl fixován 4% paraformaldehydem uloženým v parafinu, příčný řez s tloušťkou řezu 4 μm, sušen v sušárně při 60 stupních po dobu 2 hodin a poté obarven hematoxylinem-eosinem nebo Massonem (Solaibio, Peking, Čína). Struktura myokardu byla pozorována mikroskopem s inverzním fázovým kontrastem (Leica, Frankfurt, Německo). Software Image J byl použit k výpočtu CSAC a oblasti fibrózy.

2.7. Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay (ELISA).

Krev z břišní aorty byla extrahována z krys a umístěna do antikoagulační zkumavky na 2 hodiny při teplotě místnosti a poté centrifugována při rychlosti 3000 ot./min. -e supernatant byl absorbován pipetami (Eppendorf, Hamburg, Německo) a skladován při 80 stupních pro testování. Plazma ET-1, interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), tumor nekrotizující faktor Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine

Hladiny (TNF-) (Bioss, Peking, Čína) a cyklooxygenázy 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, Čína) u potkanů ​​byly detekovány podle instrukcí soupravy ELISA.

2.8. Methylačně-specifická PCR.

DNA byla extrahována z tkáně myokardu levé komory krys pomocí soupravy pro extrakci DNA (Tiangen Biotech, Peking, Čína). -e hodnota absorpce (hodnota A) byla rovna OD260/OD280 (1,8-1,9). 20 ul genomové DNA (500 pg-1 ug) byly modifikovány kyselinou sírovou pomocí Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, USA). -e MSP reakční systém byl 25 μl, včetně 3,0 μl sulfitem modifikovaného templátu DNA, 2,5 μl 10× pufru, 2,5 μl 2,5 mm dNTP, 1,0 μl 10 μm primeru, 0,1 μl Hotstar Taq DNA polymerázy (TAKARA) a 14,9 ul ddH20. Bylo celkem 45 cyklů: denaturace při 95 stupních, žíhání při 55 stupních a extenze při 72 stupních po dobu 30 sekund. Po PCR bylo 5 ul produktu separováno elektroforézou na 2% agarózovém gelu. -e DNA byla ošetřena M. Sssl metyltransferázou (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) byla použita jako pozitivní kontrola methylace a DNA normální kontrolní skupiny byla použita jako pozitivní kontrola demethylace. Nakonec byl agarózový gel vyfotografován a analyzován zobrazovacím systémem gelu Bio-Rad. Úroveň demethylace byla vypočtena pomocí následujícího vzorce:

Všechny primery navržené v Methprimer (Applied Biosystems, MA, USA) a syntetizované Sangon Biotech (Shanghai, Čína) jsou uvedeny v tabulce 1.

2.10. Western Blot.

Proteiny byly extrahovány z myokardu levé komory pomocí Ripa Buffffer (Scientific) a byl přidán inhibitor proteázy. Koncentrace proteinu byla stanovena metodou BCA (Solarbio, Peking, Čína). Proteiny byly odebrány při 50 ug a denaturovány při 100 °C po dobu 5 minut. Proteiny byly separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE, Beyotime, Shanghai, Čína) a poté přeneseny na polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu elektroforetickým zařízením (Bio-Rad, CA, USA). Po blokování 3% BSA po dobu 2 hodin při pokojové teplotě byly membrány inkubovány s anti-PI3K protilátkou, antifosfo-PI3K protilátkou, anti eNOS protilátkou, anti-fosfo-eNOS (1:1000, Bioss, Peking, Čína), anti-COX-2 protilátka, anti-HMGB-1 protilátka (1:1000, Proteintech, Chicago, IL, USA) a anti-ECE-1 protilátka (1:2000, Signalway Antibody , College Park, MD, USA), primární protilátky přes noc při 4 stupních. Následující den, po 3x promytí TBST, byly membrány inkubovány s HRP-značeným kozím anti-králičím IgG (1:25000, 1 h, Zhongshanjinqiao, Shanghai, Čína) při teplotě místnosti. Po trojnásobném promytí TBST byly membrány vizualizovány pomocí Pierce™ ECL Western blotting Substrate a zobrazeny pomocí FluorChem E Imaging System (Protein Simple, USA), které byly normalizovány na -aktin jako vnitřní kontrola.

Přínos glykosidů Phenylethanoild z cistanche

cistanche prospěch

3. Výsledky

3.1. CPhGs(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) Zlepšená srdeční funkce u potkanů ​​po AAC.

-e potkani dostali žaludeční sondu ode dne po AAC. Pozitivní kontrolní skupině (AV) byla podávána žaludeční sondou valsartan 8,3 mg/kg/den a skupině CPhGs (AC) byla podávána žaludeční sondou CPhGs 125, 250 a 500 mg/kg/den, v daném pořadí. Po šesti týdnech nepřetržitého dávkování provedli potkani echokardiografii pod anestezií 2,5 procenta pentobarbitalu sodného. Dva potkani zemřeli po AAC: jeden v modelové skupině zemřel třetí den po AAC na plicní edém; další v AC 500 mg/kg zemřel den po operaci s podezřením na chirurgický stres. Jak je znázorněno na obrázku 2, ve srovnání se simulovanou skupinou byly LVED, LVEF a LVFS ve skupině AAC významně sníženy, ale LVPWT ve skupině AAC byla významně zvýšena. Ve srovnání se skupinou AAC byly LVED, LVEF a LVFS zvýšeny a LVPWT byla v různé míře snížena v každé skupině s dávkou AC; pro LVPWT nebyla signifikantní změna nalezena ve skupině AC 125 mg/kg, ale byla nalezena ve skupinách AC 250 a 500 mg/kg. Ve srovnání s AV skupinou byly LVPWT a LVED ve skupině AC 125 mg/kg pozorovány jako významný rozdíl, zatímco LVPWT, LVED, LVFS a LVFS ve skupinách AC 250 a 500 mg/kg nebyly.

3.2. CPhGs(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) Snížení HWI, CSAC a oblasti fibrózy u potkanů ​​po AAC.

-cs jsme zvážili srdce každé krysy, abychom vypočítali HWI a odebrali tkáň myokardu pro HE a Massonovo barvení, abychom pozorovali změny plochy průřezu (CSAC) a plochy fibrózy v kardiomyocytech. Jak je znázorněno na obrázcích 3(a), 3(d) a 3(e), ve srovnání s kontrolní skupinou byly hmotnost srdce (HW) a HWI ve skupině AAC významně sníženy; ve srovnání se skupinou AAC byly HW a HWI ve skupinách AC250 a 500 mg/kg významně sníženy; ve srovnání s AV skupinou byly HW a HWI významně zvýšeny ve skupině AC 125 mg/kg, ale nebyly ve skupinách AC 250 a 500 mg/kg. Na obrázcích 3(b) a 3(f) ve srovnání se simulovanou skupinou výsledky barvení podle Massona ukázaly, že oblast fibrózy ve skupině AAC byla významně zvýšena. Pro oblast fibrózy byl zjištěn významný pokles ve skupinách AC 125, 250 a 500 mg/kg ve srovnání se skupinou AAC, zatímco významný nárůst ve skupinách AC 125 a 250 mg/kg a významný pokles ve skupinách AC 500 mg/ kg skupiny byly nalezeny ve srovnání s AV skupinou. Na obrázcích 3(c) a 3(g) výsledky barvení HE ukázaly, že CSAC ve skupině AAC byl významně zvýšen ve srovnání s CSAC ve skupině s falešnou analýzou; ve srovnání se skupinou AAC bylo CSAC ve skupinách AC 250 a 500 mg/kg významně sníženo; ve srovnání s AV skupinou se však CSAC významně zvýšil ve skupinách AC 125 a 250 mg/kg a nebyl nalezen žádný významný rozdíl ve skupině AC 500 mg/kg

3.3. CPhGs(Fenyletanoild glykosidy z cistanche) Snížené hladiny mRNA genů pro hypertrofii myokardu v myokardiální tkáni potkanů ​​po AAC.

ANP, BNP a těžký řetězec myosinu (-MHC) jsou důležitými faktory srdeční hypertrofie [19, 20]. Zjistili jsme relativní hladiny exprese těchto tří genů pro srdeční hypertrofii v tkáních myokardu. Jak je znázorněno na obrázku 4, ve srovnání s falešnou skupinou byly relativní hladiny exprese ANP, BNP a -MHC mRNA ve skupině AAC významně zvýšeny; ve srovnání se skupinou AAC však relativní úrovně exprese tří genů pro hypertrofii myokardu v AC 250 Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 5.

Přínos glykosidů Phenylethanoild z cistanche