ČÁST Ⅰ: Účinky podmínek prostředí na počet nefronů
Mar 20, 2022
další informace:ali.ma@wecistanche.com
ČÁST Ⅰ: Účinky podmínek prostředí na počet nefronů: Modelování onemocnění matek a epigenetická regulace ve vývoji ledvin
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse a kol.
1. Úvod
Vývoj plodu je ovlivněn prostředím in utero a nepříznivé prostředí může v pozdějším věku predisponovat k onemocněním, jako je hypertenze, kardiovaskulární onemocnění a chronické onemocnění ledvin [1-4]. Řada intrauterinních poruch může mít za následek snížení zásobení nefrony a zhoršenou funkci ledvin u potomků. U hlodavců mezi stavy vedoucí ke snížení počtu nefronů při narození patří omezení intrauterinního růstu (IUGR), nízkoproteinová dieta matky, léky (včetně kortikosteroidů nebo nesteroidních protizánětlivých léků), monogenetické mutace a nízké hladiny vitaminu A, stejně jako cukrovka matky. a nedostatek železa [5-10]. U lidí v současné době neexistuje žádná neinvazivní metoda měření počtu nefronů. Postmortální studie však prokázaly negativní korelaci mezi počtem nefronů a krevním tlakem [4,11]. Navíc je známo, že intrauterinní stavy spojené se sníženým počtem nefronů, jako je IUGR, jsou spojeny se zvýšeným výskytem hypertenze a CKD [12].
Pokusy in vivo, kdy jsou nepříznivé nitroděložní stavy uměle indukovány u březích zvířat, se ukázaly jako neocenitelné pro detekci a popis renálních změn vyvolaných u potomků. Jakýkoli experimentální zásah během těhotenství však vede ke komplexním změnám ve fyziologii matky, placenty a plodu, které samy mohou ovlivnit prostředí vyvíjející se metanefroi. Techniky ex vivo modelování toto obcházejí tím, že umožňují zkoumat vývoj ledvin zcela oddělený od vlivu matky zvířete, placenty nebo jiných orgánů plodu. Izolované kultury metanefroi na rozhraní médium-vzduch původně provedl Trowell v roce 1950 [13] a následně byly zušlechtěny kultivací ledvin na filtračních membránách [14], což poskytlo základ pro kultivační podmínky s jednou proměnnou.
Stručně řečeno, existuje stále více důkazů naznačujících, že prenatální inzulty spojené s nízkým počtem nefronů jsou relevantní pro rizikové faktory hypertenze a CKD. Aby bylo možné vyvinout preventivní strategie k zajištění adekvátního vybavení nefrony při narození, je nezbytné mechanické pochopení faktorů ovlivňujících vývoj ledvin a nefrogenezi. V této práci byla metanefrická orgánová kultura použita k modelování různých aspektů regulace prostředí ke studiu jejich účinků na růst ledvin a možných důsledků pro dlouhodobou funkci ledvin a použita ke screeningu epigenetických regulátorů pomocí malých sloučenin schválených FDA.
Klikněte na produkty Cistanche herba pro funkci ledvin
2. Výsledky
2.1. Využití kultur metanefrických orgánů ke studiu vlivu podmínek prostředí na vývoj ledvin
Pro modelování nepříznivých podmínek prostředí byly ledviny z embryí embryonálního dne (E) 12,5 kultivovány na rozhraní médium-vzduch (obrázek 1A). Pro usnadnění sledování vývoje nefronu a glomerulu, Six2. Cre a Pod. Byly použity Cre duální fluorescenční reportérové myši (obrázek 1B, C). Častým stavem během těhotenství je horečka, která postihuje více než 10 procent těhotenství během prvních 16 týdnů těhotenství [15]Teplo je dobře charakterizovaný teratogen a bylo prokázáno, že hypertermie během těhotenství vede k potratu plodu, zpomalení růstu, a vývojové vady, jako je ageneze ledvin, hypoplazie a nízká porodní hmotnost u několika druhů [16-21]. Pro posouzení dopadu prodloužených hypertermických stavů v rozsahu horečky na růst ledvin a tvorbu nefronů byly ledviny izolovány a udržovány buď na 37 nebo 40 stupních (obrázek 1D). Po 7 dnech kultivace byly ledviny kultivované při 40 °C v průměru o 18,36 procent menší než jejich protějšky kultivované za fyziologických podmínek (obrázek 1E). Mezi skupinami však nebyl nalezen žádný významný rozdíl v počtu glomerulů na ledvinu (obrázek 1F). Nicméně snížený celkový růst ledvin ukazuje negativní vliv zvýšené teploty na metanefrický růst.
Vzhledem k tomu, že 19 procent těhotných žen trpí anémií z nedostatku železa [22], je nedostatek železa jedním z nejrozšířenějších stavů s potenciálem narušit vývoj ledvin [23]. Údaje in vivo ukázaly, že renální růst, glomerulární počty a renální vychytávání železa jsou sníženy během těhotenství postižených nedostatkem železa u matky [24]. Aby bylo možné posoudit dopad snížené dodávky železa vázaného na transferin na růst ledvin a nefrogenezi, byly explantáty kultivovány v médiu obsahujícím 50 ug/ml železem nasyceného holo-transferinu nebo 50 ug/ml apo-transferinu ochuzeného o železo, respektive. Ledviny s omezeným množstvím železa zůstaly mnohem menší než jejich protějšky s dostatkem železa a vykazovaly zvýšenou apoptózu v ureterických pupenech a snížené větvení a proliferaci ureterických pupenů (obrázek 1G, doplňkový obrázek S1A-F). Zatímco populace nefronů byla morfologicky nedotčena, bylo možné pozorovat pokles vyvíjející se distální části nefronu a také distálních tubulů (obrázek 1H,I, doplňkový obrázek S1G-J). Ledviny s nedostatkem železa byly v průměru o 47,9 procenta velikosti jejich protějšků kultivovaných holo-transferinem (obrázek 1) a vykázaly snížení celkového počtu glomerulů na ledvinu o 69,9 procenta po 7 dnech v kultuře (obrázek 1K). . Deplece železa apo-transferinem tedy vykazovala závažné účinky na růst ledvin s fenotypem all-proximální nefrogeneze.
Obrázek 1. Použití metanefrických orgánových kultur ke studiu vlivu podmínek prostředí na vývoj ledvin.(A) Urogenitální hřeben z myších embryí E12.5 (levý panel) byl mikrochirurgicky extrahován (druhý panel) a ledviny byly izolovány (třetí panel) a umístěny na vložky Transwell (pravý panel). Měřítko∶ 1 mm （levý panel）, 500 μm（třetí panel）. (B) Transgenní myši s duální expresí Tomato/EGFP byly použity pro podmíněné značení Six2-pozitivních buněk a jejich potomků pomocí Six2. Cre nebo (C) podocin-pozitivní buňky pomocí Pod. Myši Cre. (D) Explantáty ze stejného embrya byly kultivovány po dobu 7 dnů při 37 nebo 40 stupních. Měřítko∶ 500 μm. （E） Povrchové plochy explantátů pěstovaných 7 dní při 37 nebo 40 stupních .n=40 párů, párový t-test, průměr±SD.(F) Počet glomerulů ve skupinách explantátů po 7 dnech.n{{ 17}} párů, párový t-test, průměr ±SD. (G) Explantáty ze stejného embrya byly kultivovány po dobu 7 dnů v médiu obsahujícím holo-Tf nebo apo-Tf. Měřítko∶ 500 μm. (H) Širokoúhlé snímky holo-Tf a apo-Tf kultivovaných explantátů barvených proti SIX2 a E-cadherinu po 48 hodinách kultivace ukazují normální pool progenitorových buněk a defekty v časné morfologii nefronů. Měřítko∶100 μm.（I） Širokoúhlé snímky holo-Tf a apo-Tf kultivovaných explantátů obarvených proti WT1 a JAG1. Měřítko∶100 μm. （） Povrchové plochy holo-Tf a apo-Tf kultivovaných explantátů po 7 dnech.n=30 párů, párový t-test, průměr ± SD.(K) Počet glomerulů ve skupinách explantátů po 7 dnech.n =17 párů, párový t-test, průměr ± SD.
2.2. Ex Vio vysoká expozice glukózy vede ke změnám souvisejícím s diabetickou nefropatií ve vyvíjející se ledvině
Diabetes matek je dalším běžným stavem během těhotenství, s celosvětovou prevalencí hyperglykémie v těhotenství ~ 17 procent a více než 20 milionů živě narozených dětí každý rok [25]. Ukázalo se, že diabetes indukovaný v myších a potkaních modelech vede k potomkům s nižším počtem nefronů [10,26,27]. Metanefrická orgánová kultura byla již dříve použita ke studiu vlivu vysoké hladiny glukózy na vývoj ledvin [27-29]. Dříve jsme uváděli snížení velikosti, počtu nefronů a metylaci DNA za podmínek vysoké hladiny glukózy 55 mM[30]. Na rozdíl od publikovaných údajů [28] nebyl v našich vzorcích pozorován žádný účinek na velikost explantátu nebo glomerulární počet při kultivaci v různých 30 mM glukózových médiích ve srovnání s 5 mM kontrolními podmínkami po 7 dnech (doplňkový obrázek S2A, B). Kromě toho nebylo možné detekovat žádné snížení methylace DNA na LINE-1 a hlavních satelitních místech (doplňkový obrázek S2C, D). Účinek 55 mM vysoké glukózy na vývoj ledvin po 7-denní kultivaci byl dále analyzován, což ukazuje snížení rychlosti růstu počínaje dnem 3 v kultuře (obrázek 2A, B). Imunofluorescenční barvení neukázalo žádné morfologické defekty skupiny SIX2-pozitivních progenitorových buněk (obrázek 2C), ale ukázalo snížené barvení podocytárního markeru podokalyxinu (PODXL, obrázek 2D). Bylo zjištěno, že glomeruly obsahují zesílenou glomerulární bazální matrici viditelnou při histologickém barvení (obrázek 2E). Podobné nálezy byly učiněny v elektronové mikroskopii, ukazující zvýšení tloušťky glomerulární bazální membrány (obrázek 2F), jednoho z prvních markerů prediabetu a diabetické nefropatie (DN) [31,32], u pěti ze šesti ledvin a u žádné ze sedmi kontrolních ledvin ze stejného vrhu. K dalšímu odhalení změn v transkriptomu byla provedena analýza párové diferenciální genové exprese (DGE) ledvinových kultur ze tří vrhů, přičemž jedna ledvina z každého embrya byla kultivována s vysokým obsahem glukózy a druhá s kontrolním médiem a ledviny se spojily pro analýzu ( n=3).DGE potvrdila upregulaci složek extracelulární matrice jako primární upregulovaný biologický proces (doplňková tabulka S1). Downregulované geny se podílely hlavně na aktivaci (imunitních) buněk a exocytóze/sekreci (doplňková tabulka S1). Ontologie fenotypu savců indikovala abnormální morfologii kůry ledvin a renálního tělíska v důsledku downregulovaných genů, jako jsou Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb a Vegfa (doplňková tabulka S1). Renální exprese několika genů, jako je Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa a Txnip, u kterých bylo prokázáno, že jsou upregulovány u diabetické nefropatie [33-36], byla za hyperglykemických podmínek zvýšena. Aby bylo možné porovnat profil exprese genu v kultuře ledvin s vysokým obsahem glukózy s lidskou DN, byla data DGE porovnána s lidskými daty z mikrodisekovaných glomerulů a tubulů z biopsií pacientů s diabetickou nefropatií z European Renal cDNA Bank (ERCB). Z 216 odlišně regulovaných genů shodných po dávkové analýze bylo 94 genů odpovídajícím způsobem rozdílně regulováno v glomerulárních a/nebo tubulárních frakcích (obrázek 2G). Překrytí našeho modelu a lidských DNgenů ukázalo 40 z 95 genů upregulovaných v glomerulech a 34 genů v tubulech (25 společných genů) (obrázek 2H). Tyto geny se většinou podílely na organizaci extracelulární matrix (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) a buněčné adhezi (ITGBL1, CLDN15). Navíc byly upregulovány geny spojené s diabetem, jako je TXNIP, SPON2 a PAPPA. Ze 120 downregulovaných genů z ledvinových kultur bylo 22 downregulováno také v glomerulech a 39 bylo downregulováno také v tubulech (16 běžně (obrázek 2I). Tyto geny se podílely na reakci na endogenní stimul (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), vývoj nefronového epitelu (PTPRO, PODXL, VEGFA) a pozitivní regulace chemotaxe endoteliálních buněk (LGMN, P2RX4, VEGFA). 37-39]. Diferenciálně regulované geny, které se nepřekrývají s údaji ERCB, také odrážely změny související s diabetem, jako je extracelulární matrix (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) nebo gestační diabetes (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1. Vývoj ledvin za podmínek vysoké hladiny glukózy tedy vykazoval pozoruhodné podobnosti s diabetickou nefropatií dospělých lidí.
Obrázek 2. Ex vivo vysoká expozice glukózy vede ke změnám souvisejícím s diabetickou nefropatií ve vyvíjející se ledvině.(A) Embryonální ledviny z Pod.Cre; Zvířata z rajčat/EGFP se kultivovala po dobu 7 dnů v podmínkách s nízkým obsahem glukózy (LG, 5,5 mM -D-glukóza, 55 mM mannitol) nebo s vysokým obsahem glukózy (HG, 55 mM -D-glukóza). Měřítko: 500 um.(B) Plocha povrchu ledvin pro stavy HG a LG.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex vivo vysoká expozice glukózy má vliv na tvorbu dlouhodobé paměti prostřednictvím methylace DNA
Pro další pochopení molekulárních změn zprostředkovaných hyperglykemickým prostředím byly kultury ledvin pěstovány za podmínek vysoké glukózy po dobu 3,5 dne a poté změněny na podmínky nízké glukózy po stejnou dobu (obrázek 3A). Pozoruhodné je, že inkubace za fyziologických podmínek po kratší inkubační době v médiu s vysokým obsahem glukózy nezvrátila snížení růstu po 7 dnech v kultuře s kulturami rostoucími stejnou rychlostí jako při kontinuálním ošetření vysokým obsahem glukózy (obrázek 3B). Kromě toho methylace DNA ukázala hypomethylaci prvku LINE-1 a hlavních satelitních lokusů (obrázek 2C, D), stejně jako trvalou hypermethylaci DNA promotoru Ppargcla, jak za podmínek vysoké glukózy, tak za reverzních podmínek (obrázek 3E), což ukazuje na tvorba metabolické paměti prostřednictvím metylace DNA v důsledku dřívějších nepříznivých podmínek prostředí jako prostředek programování plodu.
Obrázek 3. Ex vivo expozice vysoké glukóze ovlivňuje tvorbu dlouhodobé paměti prostřednictvím metylace DNA.(A)Zobrazování E12.5embryonálních ledvin ode dne 0 do dne 7 v médiu s nízkým obsahem glukózy (5,5 mM), médiu s vysokým obsahem glukózy (55 mM) nebo médiu s vysokým obsahem glukózy po dobu 3,5 dne a přepnutí na médium s nízkým obsahem glukózy pro zbývající dny. Měřítko: 500 um. (B) Plocha povrchu ledvin za 7 dní. Průměr ± SD. n=36 ledvin. LG, léčba nízkou hladinou glukózy; HG, léčba vysokými hladinami glukózy; HG na LG, 3,5 dne vysoká a 3,5 dne nízká léčba glukózy.***,LG-HG (nepárový t-test):p=0.0004;**,LG-HG na LG (párový t-test ):p<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ex Vivo Small Compound Screen identifikuje epigenetické regulátory vývoje ledvin
Výsledky této práce i předchozích prací naznačují, že epigenetické mechanismy hrají roli ve vývoji ledvin [30, A40-45]. Proto jsme chtěli systematicky hodnotit účinek epigenetických modulátorů různých tříd enzymů na vývoj ledvin. Za tímto účelem jsme vybrali knihovnu 22 malých sloučenin schválených FDA s prokázanou inhibiční aktivitou [46-56] (obrázek 4A). Za použití Six2.Cre-reporter myší k vyhodnocení vývoje nefronu byly renální struktury kultivovány po dobu 3 dnů s inhibitory v médiu. Velikost se zvyšovala v průběhu času ve srovnání s kontrolními orgány ze stejného vrhu a morfologie byla kontrolována na abnormality ve vývoji (obrázek 4B). Bylo prokázáno, že několik inhibitorů interferuje s normálním ex vivo renálním vývojem. Inhibitor HDAC entinostat, inhibitor benzamid histondeacetylázy s vysokou afinitou k HDAC1,2 a 3 [57], vykazoval konzistentní redukci růstu a nedostatek diferenciace a proliferace po 3 dnech (obrázek 4C). TH39 se vyvinul jako selektivní inhibitor HDAC8 (IC50 HDAC8 88 nM, 26-násobně selektivní vůči HDAC1,28-násobně selektivní vůči HDAC6[56]), vykazoval podobně závažnou inhibici růstu ve srovnání s kontrolními orgány ze stejného vrhu. Kromě toho chelátory železa a inhibitory JmJC deferasirox a deferoxamin vykazovaly redukci růstu analogickou k médiu s nedostatkem železa. Kromě toho inhibitor SET7/9 cyproheptadin [58,59] vykázal snížení růstu a nedostatek diferenciace a proliferace ve srovnání s kontrolními ledvinami (obrázek 4D), ale také se zdálo, že interferuje se signalizací Wnt (doplňkový obrázek S3). Jiné inhibitory HDAC, HAT, HDM a HMT a inhibitor DNMT 5-azacytidin nevykazovaly v měřeném časovém rámci snížení růstu nebo vývojové anomálie (obrázek 4A).
Obrázek 4. Ex vivo screening malých sloučenin identifikuje modulátory vývoje ledvin.(A) Seznam malých sloučenin, jejich epigenetických cílů a použitých koncentrací ukazuje snížení růstu ledvin pomocí entinostatu, TH39, deferasiroxu, deferoxaminu a cyproheptadinu ve 3 nezávislých experimentech větších nebo rovných po 3 dnech v kultuře. Kontrolní kultury byly ošetřeny DMSO. ***, p-hodnota<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
