Část Ⅱ Vývoj imunoanalýzy s laterálním průtokem nanočástic europia pro detekci NGAL v moči a diagnostiku akutního poškození ledvin

Výsledek

1. Exprese a purifikace rekombinantního proteinu NGAL

Rekombinantní plazmid pSecTag2A-NGAL byl transfekován do buněk CHO. Protein NGAL-6×His je exprimován hlavně v buněčném supernatantu a následně purifikován Ni Sepharosou. Purifikovaný rekombinantní protein NGAL byl získán v přibližně 95% čistotě a analyzován pomocí SDS-PAGE s přibližnou molekulovou hmotností 23,7 kDa (obr. 1A). Western blot také potvrdil expresi a purifikaci rekombinantního proteinu NGAL (obr. 1B).

2. Generování MAbs

Nejprve jsme porovnali účinky stejnosměrného napětí na perforaci buněčné membrány při různých intenzitách elektrického pole a amplituda pulzu byla 400 V, 450 V, 500 a 550 V, v tomto pořadí, abychom optimalizovali schéma elektrické fúze. Podle předchozích zpráv má koncentrace buněk významný vliv na účinnost fúze[16]. Smíšená suspenze izolovaných slezinných buněk a SP2/0 myelomových buněk byla přenesena do fúzní komory v různých koncentracích přibližně 2 x 106, 2 x 107 a 2 x 108 buněk/ml. Účinnost fúze byla nejvyšší při 450 V DC a optimální koncentrace buněk byla 2 × 107 buněk/ml (obr. 2).

3. Charakterizace MAbs

MAb byly purifikovány na Protein A koloně. Purifikované MAb byly odděleny 12% SDS-PAGE a za redukčních podmínek byly pozorovány dva pásy s molekulovou hmotností 55 kDa a 25 kDa. Za neredukujících podmínek byly zaznamenány čiré pásy 170 kDa, což je intaktní protein 2F4 a 1G1 (obr. 3 A). Western blot ukázal, že všechny MAb se specificky vážou na lidský NGAL protein (obr. 3B). Po elektrofúzi buněk a subklonování byly supernatanty hybridomů detekovány nepřímým testem ELISA s NGAL-6×His a PCT- 6×His, aby se zajistila specifická vazba protilátek na NGAL. Dva vysoce pozitivní hybridomy (1G1, 2F4) se specifickou vazbou NGAL bez zkřížené reakce s PCT-6×His byly úspěšně vybrány pro produkci a purifikaci MAb (obr. 3 C). Pro detekci afinity dvou MAb byla pomocí systému BIAcore T200 analyzována interakce mezi protilátkami s různými koncentracemi a proteinem NGAL. Kinetický diagram ukázal, že afinita 2F4 a 1G1 byla 4,5 × 10-7 a 6,0 × 10-7 (obr. 3D). Izotypy těchto dvou MAb, které byly detekovány komerčními soupravami, byly IgG1. Míra blokování párování 2F4 a 1G1-HRP byla 63 procent podle detekce cELISA, což ukazuje, že rozpoznávaly různé epitopy.

4. Postupy EU-NPS-LFIA

Na základě značek EU-NPS as a sendvičového imunotestu byla pro detekci NGAL vytvořena LFIA. MAb 2F4 byla potažena na nitrocelulózovou membránu a spárována s EU-NPS-1G1 na základě párování protilátek na platformě pro imunochromatografii s laterálním průtokem. Jak je schematicky znázorněno (obr. 4), TL a CL nitrocelulózové membrány byly potaženy MAbs 2F4 a kozím anti-myším IgG. EU-NPS-1G1 byla označena na podložce konjugátu. Vzorek obsahující antigen NGAL migroval směrem k podložce konjugátu, aby se spojil s EU-NPS-1G1 a vytvořil komplexy antigen-protilátka. Následně byly komplexy zachyceny mAb 2F4 v T-linii, zatímco migrovaly za vzniku sendvičových komplexů. Přebytek komplexu byl spojen s kozím anti-myším IgG. Testovací proužky byly měřeny fluorescenčním detektorem po 15 minutách.

5. Hodnocení výkonu

Páry protilátek (2F4- značené1G1) jako detektorové a záchytné protilátky byly použity k vytvoření fluorescenční imunochromatografie a analytické výkony EU-NPS-LFIA byly hodnoceny vytvořením standardní křivky. Poměr relativní intenzity fluorescence (HT/HC) byl zvýšen s koncentrací NGAL. EU-NPS-1G1 vykazovala reakci na mAb 2F4 (obr. 5 A). Vliv vysoké dávky háku nebyl detekován, když koncentrace antigenu dosáhla 3000 ng/mL. Regresní rovnice byla znázorněna následovně: y=0,0012 x plus 0,0059 (R2=0,99), kde y představuje poměr HT/HC a x představuje koncentrace NGAL (obr. 5B). Detekční limit (LOD) byl 0,36 ng/ml (3násobek směrodatné odchylky slepého pokusu, n=20), vypočtený podle pokynů EP17-A2 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), koncentrace NGAL měl lineární vztah v rozsahu 1-1500 ng/ml[17].

6. Přesnost

Pro vyhodnocení přesnosti a reprodukovatelnosti imunologické metody byly provedeny experimenty obnovy intra-testu a inter-testu. Různé koncentrace (50, 200 a 800 ng/ml) standardní látky NGAL byly přidány k negativním vzorkům moči. Přesnost v rámci testu byla vypočítána se třemi replikáty pro každou zvýšenou koncentraci za 1 den a přesnost mezi testy byla vypočítána se třemi replikáty pro každou zvýšenou koncentraci každé tři dny nepřetržitě po patnáct dní[18]. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1, vypočítaný variační koeficient (CV) uvnitř testu se pohyboval od 2,57 do 4,98 procent (n=10), nižší než 10 procent. CV mezi testy se pohybovalo od 4,11 do 7,83 procent (n=15), což je také méně než 10 procent.

Přesnost v rámci testu a mezi testy byla ověřena dvěma vyhodnocovacími zařízeními (Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd a Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd) a výsledek je nakonec konzistentní. Tyto výsledky vysvětlily, že přesnost vyvinutého LFIA byla na vysoké úrovni a reprodukovatelnost byla na přijatelné úrovni.

Pro nákup klikněte zdeDoplňky Cistanche

7. Specifičnost

Specifičnost testovacích proužků byla hodnocena přidáním endogenních látek v normálních a různých koncentracích vzorků moči, včetně kreatininu, glukózy a močovinového dusíku. Jak je ukázáno v tabulce 2, výsledky ukázaly, že všechny relativní odchylky (RD) byly v rozmezí ± 10 procent, což naznačuje, že interakce antigen-protilátka byla stabilní a ilustrující specifičnost testovacích proužků byla přijatelná vůči NGAL.

8. Testy klinických vzorků

Pro posouzení aplikační způsobilosti NGAL na základě EU-NPS-LFIA pro stanovení klinických vzorků bylo celkem 83 vzorků moči obsahujících 26 vzorků s nízkou hodnotou (11–70 ng/ml), medián 19 hodnotných vzorků (110–800 ng/mL), 38 vzorků s vysokou hodnotou (800–1740 ng/ml), bylo naměřeno pomocí ARCHITECT moči NGAL. Výsledky korelačního koeficientu (R2 ) regresní křivky byly 0,9829 (p < 0,01), což ukazuje, že obě detekční metody měly významný lineární vztah (kde x představuje koncentrace NGAL získané analyzátorem ARCHITECT, y představuje hodnoty naměřené vyvinuté testovací proužky) (obr. 6). Vyvinutý EU-NPS-LFIA pro stanovení NGAL byl tedy v klinickém testování velmi přesný.

Diskuse

V naší studii byl vyvinut EU-NPS-LFIA pro detekci NGAL v lidské moči a diagnostiku AKI. Současnou diagnózu AKI potvrzuje koncentrace sérového kreatininu (sCr), která je stabilní, pokud není alespoň 50 procent poškozena funkce ledvin [19]. AKI se vyvinul u 89 procent těžkých pacientů s COVID{5}} a většina pacientů měla převážně oligurii, když se objevila dříve než plazmatický kreatinin[20]. Biomarkery zvýšily zvýšené hladiny při přijetí, což je spojeno se zvýšenou mortalitou. NGAL je jedním z těchto biomarkerů, jejichž hladiny mohou pozitivně korelovat s rizikem úmrtnosti u pacientů hospitalizovaných na COVID-19[21]. V AKI několik studií zjistilo, že koncentrace NGAL v moči významně souvisí s koncentrací sCr[22]. V posledních letech byly vyvinuty různé elektrochemické a imunologické metody pro detekci NGAL, příklady elektrochemického stanovení, proximitní ligační test na pevné fázi a elektrochemický imunotest bez enzymů [23, 24]. Tyto techniky však vyžadují přesné vybavení, specializovaný personál a profesionální interpretaci výsledků. Proto je pro sledování této poruchy kritický vývoj účinného a pohodlného detekčního testu pro koncentraci NGAL v moči. Nízká účinnost fúze polyethylenglykolu (PEG) v konvenčních metodách způsobuje potíže při získávání funkčních protilátek, optimalizovali jsme parametry elektrické fúze, které umožnily zvýšení účinnosti fúze pro přípravu životaschopných hybridomů, a získali jsme dvě anti-NGAL MAb. MAb jsou nejen vysoce afinitní, ale také zaměřené na různé epitopy, používané k vytvoření vysoce kvalitního diagnostického testu.

Herba Cistanche

V posledních letech bylo publikováno mnoho studií, které vyvíjely několik rychlých diagnostických imunotestů NGAL, včetně fotoelektrochemického imunosenzoru a tří elektrochemických imunosenzorů, test proximitní ligace na pevné fázi a test laterálního průtoku [25]. V jedné studii byl imunosenzor vyroben záchytnými protilátkami NGAL imobilizovanými na sítotiskem modifikované uhlíkové elektrodě a značeným přidáním sekundární protilátky proti NGA k nanovrstvám g-C3N4 zdobeným PB-NP, které tvoří sendvič na SPCE[24]. Druhá studie vyvinula protilátku proti NGAL, která byla imobilizována na sítotiskové elektrodě (SPCE) modifikované elektropolymerizovaným anilinem naneseným na elektrosprejový grafen/polyanilin (G/PANI)[25]. Dvě zprávy ukázaly, že LOD se značně lišila od 0,6 pg/ml do 21,1 ng/ml, v závislosti na nanovrstvách g-C3N4 s N elementem zvýšenou elektrokatalytickou účinností nanohybridů než nanovrstvy grafenu, a LOD NGAL test se liší v závislosti na imunosenzoru, konjugovaném komplexu a protilátkách[26]. Podle těchto studií jsme objasnili, že citlivost LFIA by mohla být zlepšena na základě různých fluorescenčních nanočástic zmíněných v části preambule. Vysoce citlivé nanočástice označené v LFIA jako fluorescenční sondy byly v posledních desetiletích neustále zkoumány, nejpoužívanější jsou zlaté nanočástice, ale použití testů laterálního toku na základě tradičních značek je omezeno na jejich špatnou identifikaci a slabší signál[ 27]. V současné době jsou k dispozici protilátky pro vývoj NGAL, které byly aplikovány na různé platformy pro detekci NGAL, ale nejsou dostupné v LFIA založené na značkách EU-NPS experimentovaných na detekci NGAL navíc k testu laterálního průtoku založenému na technologii UCP [28 , 29].

Fluorescenční imunotesty mají výhodu v různých oblastech detekce, zejména ve zralých kvantových tečkách, jejich citlivost byla ovlivněna MAbs a fluorescenčními materiály a mohla by se výrazně zlepšit EU-NPS a specifickými MAb pro použití fluorescenčních sond[30 ]. EU-NPS byly aplikovány na fluorescenční proužky LFIA, které dozrály v detekčním poli, a zvýšily několik výhod LFIA pro citlivost, specificitu a stabilitu testu[31]. Vzhledem k vynikajícím vlastnostem EU-NPS byl limit detekce NGAL v této metodě 0,36 ng/ml, zatímco průměrné hladiny NGAL v moči byly u zdravých jedinců asi 7,0 ng/ml[32]. . Vývoj a aplikace EU-NPS-LFIA NGAL jsou stále v počáteční fázi, tento test potřebuje otestovat NGAL vzorků séra a moči u pacientů s COVID-19, u kterých zlepšení léčby v budoucnu funguje .

Závěry

Ve studii jsme úspěšně získali dvě myší anti-NGAL MAb (2F4, 1G1) a byly označeny EU-NPS, aby se vytvořila technika laterálního průtoku. Bylo zjištěno, že EU-NPSLFIA detekuje NGAL v širokém rozmezí 1- 3000 ng/ml během 15 minut, citlivost detekce dosáhla 0,36 ng/mL. Tyto anti-NGAL MAb by mohly být spolehlivě využity při fluorescenční LFIA detekce NGAL ve vzorcích moči, takže by měly být použitelné v diagnostice AKI.

Cistanche tubulosa

Účinnost extraktu z cistanche na akutní poškození ledvin

Akutní poškození ledvin (AKI), také známé jako akutní selhání ledvin, je běžný zdravotní stav spojený s náhlým poklesem funkce ledvin. AKI může způsobit významnou morbiditu a mortalitu, zvláště pokud není léčena. Včasná diagnostika a rychlá léčba jsou proto zásadní pro zlepšení výsledků pacientů.

Extrakt z cistanche, získaný z rostliny Cistanche deserticola, se používá v tradiční čínské medicíně k léčbě různých zdravotních stavů. Nedávný výzkum ukázal, že extrakt z Cistanche může být slibný při léčbě AKI.

Studie identifikovaly potenciální mechanismy, kterými extrakt Cistanche uplatňuje své terapeutické účinky na AKI. Patří mezi ně potlačení zánětu, snížení oxidačního stresu, downregulace apoptotických drah a podpora regenerace tkání. Navíc bylo prokázáno, že extrakt z Cistanche zabraňuje progresi renální fibrózy, která se může objevit v důsledku AKI.

Studie na zvířatech naznačují, že podávání extraktu Cistanche má ochranný účinek na funkci ledvin u modelů AKI, což vede ke zlepšení rychlosti glomerulární filtrace, snížení poškození tubulárních buněk a snížení hladiny dusíku močoviny v krvi a sérového kreatininu. Další studie v klinické praxi na lidských subjektech naznačují zvýšení výdeje moči a rychlosti glomerulární filtrace (GFR) a zároveň zabraňují dalšímu zvýšení hladin močovinového dusíku a kreatinu v séru u pacientů s AKI spojenou s kardiochirurgickou operací.

Zůstává však několik otázek týkajících se ideálního dávkování, dlouhodobých bezpečnostních profilů a standardizace přípravků. K vyhodnocení optimální dávky a režimu podávání extrakce Cistanche jsou zapotřebí další vysoce kvalitní randomizované kontrolované studie.

Celkově lze říci, že důkazy naznačují, že extrakt z Cistanche může být účinnou terapií pro AKI, i když pro definitivní doporučení je zapotřebí další rozsáhlý výzkum a testování. Závěrem lze říci, že navzdory určitým omezením extrakt z Cistanche ukazuje potenciál při snižování závažnosti AKI. Včasná detekce a včasná léčba může zlepšit výsledky pacientů a kvalitu života. Pacienti musí před zahájením alternativních terapií absolvovat konzultaci s poskytovateli zdravotní péče, aby byla zajištěna bezpečnost a aby se zabránilo jakýmkoli nežádoucím účinkům.

Účinky Cistanche

Reference

15. Huang X, Aguilar Z, Xu H, Lai W, Xiong Y: Membránový laterální průtokový imunochromatografický proužek s nanočásticemi jako reportéry pro detekci: Přehled. Biosensors bioelectronics 2016, 75:166–180.

16. Weeratna R, Comanita L, Davis H: CPG ODN umožňuje nižší dávku antigenu proti povrchovému antigenu hepatitidy B u myší BALB/c. Imunologická buněčná biologie 2003, 81 (1): 59–62.

17. Tong Q, Chen B, Zhang R, Zuo C: Standardizace klinické enzymatické analýzy s použitím směsí zmrazeného lidského séra s hodnotami přidělenými Mezinárodní federací klinické chemie a laboratorní medicíny referenčními postupy měření. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Research 2018, 78:74–80.

18. Huang D, Ying H, Jiang D, Liu F, Tian Y, Du C, Zhang L, Pu X: Rychlá a citlivá detekce interleukinu-6 v séru pomocí časově rozlišené imunoanalýzy laterálního průtoku. Analytická biochemie 2020, 588:113468.

19. Shapiro N, Trzeciak S, Hollander J, Birkhahn R, Otero R, Osborn T, Moretti E, Nguyen H, Gunnerson K, Milzman D et al: Diagnostická přesnost lipokalinu asociovaného s plazmatickou neutrofilní gelatinázou v predikci akutní ledviny poranění u pacientů na pohotovosti s podezřením na sepsi. Annals of urgentní medicína 2010, 56(1):52–59.e51.

20. Luther T, Bülow-Anderberg S, Larsson A, Rubertsson S, Lipcsey M, Frithiof R, Hultström M: U pacientů s COVID-19 na jednotce intenzivní péče se rozvine převážně oligurické akutní poškození ledvin. Acta anesteziolog Scandinavica 2021, 65(3): 364–372.

21. Abers M, Delmonte O, Ricotta E, Fintzi J, Fink D, de Jesus A, Zarember K, Alehashemi S, Oikonomou V, Desai J: Imunitní biomarkerový podpis je spojen s úmrtností u COVID-19 pacientů. JCI insight 2021, 6(1).

22. Wagener G, Jan M, Kim M, Mori K, Barasch J, Sladen R, Lee H: Asociace mezi zvýšením lipokalinu spojeného s močovou neutrofilní gelatinázou a akutní renální dysfunkcí po kardiochirurgickém výkonu u dospělých. Anesteziologie 2006, 105 (3): 485–491.

23. Kannan P, Tiong H, Kim D: Vysoce citlivé elektrochemické stanovení lipokalinu spojeného s neutrofilní gelatinázou pro akutní poškození ledvin. Biosensors bioelectronics 2012, 31 (1): 32–36.

24. Zhang F, Zhong H, Lin Y, Chen M, Wang Q, Lin Y, Huang: Nanohybrid složený z pruské modři a grafitických CN nanolistů jako značka generující signál v bezenzymovém elektrochemickém imunotestu na neutrofilní gelatinázu- související lipokalin. Mikrochimica acta 2018, 185(7):327.

25. Yukird J, Wongtangprasert T, Rangkupan R, Chailapakul O, Pisitkun T, Rodthongkum N: Imunosenzor bez označení založený na nanokompozitu grafen/polyanilin pro detekci lipokalinu asociovaného s neutrofilní gelatinázou. Biosensors bioelektronika 2017, 87:249–255.

26. Gong Y, Li M, Wang Y: Nitrid uhlíku v přeměně a skladování energie: nedávné pokroky a vyhlídky. ChemSusChem 2015, 8(6):931–946.

27. Chen A, Yang S: Nahrazení protilátek aptamery v imunotestu s laterálním průtokem. Biosensors bioelektronika 2015, 71:230–242.

28. Li H, Mu Y, Yan J, Cui D, Ou W, Wan Y, Liu S: Fotoelektrochemický imunosenzor bez označení pro lipokalin spojený s neutrofilní gelatinázou založený na použití nanoprotilátek. Analytická chemie 2015, 87(3): 2007–2015.

29. Lei L, Zhu J, Xia G, Feng H, Zhang H, Han Y: Rychlý a uživatelsky přívětivý test pro detekci lipokalinu asociovaného s neutrofilní gelatinázou (NGAL) pomocí upkonvertujících nanočástic. Talanta 2017, 162: 339–344.

30. Yeo S, Bao D, Seo G, Bui C, Kim D, Anh N, Tien T, Linh N, Sohn H, Chong C et al: Zlepšení rychlé diagnostické aplikace monoklonálních protilátek proti viru podtypu ptačí chřipky H7 pomocí Nanočástice europia. Vědecké zprávy 2017, 7(1):7933.

31. Chen E, Xu Y, Ma B, Cui H, Sun C, Zhang M: Monascus karboxylfunkcionalizovaný, fluorescenční imunochromatografický test na bázi nanočástic europia pro citlivou detekci citrininu ve fermentovaných potravinách. Toxiny 2019, 11(10).

32. Bolignano D, Coppolino G, Campo S, Aloisi C, Nicocia G, Frisina N, Buemi M: Neutrofilní gelatináza-asociovaný lipokalin u pacientů s autosomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin. American Journal of Nephrology 2007, 27 (4): 373–378.

Moli Yin 1 , Yuanwang Nie 2 , Hao Liu 2 , Lei Liu 1 , Lu Tang 1 , Yuan Dong 2 , Chuanmin Hu 1 a Huiyan Wang 1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Čína.

2 Akademie laboratoří, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Čína.