Část 4: Mapování epigenomické a transkriptomické souhry během formování paměti a vzpomínání v souboru Hippocampal Engram Ensemble
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
RNA-sekv
ul vody bez nukleázy), po dobu 30 minut při 37 °C s mírným kolébáním. Augmentované fragmenty DNA byly amplifikovány a kódovány pomocí PCR reakce (1 cyklus; 5 min – 72c, 30sec – 98c, 10 cyklů; 15sec – 98c, 30sec – 60c, 3min – 72c). Podle protokolu výrobce byla amplifikovaná DNA vyčištěna a purifikována pomocí kuliček 1,8x AMPure (AmpureXP beads, Beckman Coulter, A63880). Po bioanalyzátoru QC pro velikost a distribuci knihovny byly knihovny sekvenovány na platformě Illumina Nextseq 550 v MIT BioMicro Center.
Cistanche a Cistanches pro zlepšení paměti
Analýza ATAC-seq – Nezpracovaná data fastq 40-odečtů párového sekvenování bp byla porovnána s referenčním genomem myši mm9 pomocí Bowtie 2.0 v režimu párového konce50. Kolekce Samtools51 byla použita k třídění, odstraňování duplikátů PCR (rmdup), indexování souborů BAM (index) a výpočtu statistik knihovny (flagstat, viz doplňková tabulka 13). Soubory BAM byly převzorkovány ze správně zarovnaných, spárovaných a jedinečných čtení na 50 milionů. Otevřené chromatinové píky byly analyzovány pomocí softwaru MACS252 Diferenciálně dostupné oblasti (DAR) byly identifikovány pomocí Diffbind v1.16.353 s výchozími parametry a nastaveními pro použití DESeq2 (mezní hodnota; FDR < 0,01;="" násobné="" změny=""> 1,5). Úplná matice normalizovaných počtů (RPKM54) byla získána pomocí balíčku DiffBind. Pro generaci bigwigových stop byly soubory se signálem pileup (pileup fragmentů na milion přečtení) v biografickém formátu konstruovány pomocí funkce špičky volání MACS2 s příznaky -B –SPMR. Poté bylo pomocí funkce bdgcmp MACS2 generováno normalizované násobné obohacení (FE) na vstupních lambda stopách s nastavením - m FE. Poté byly soubory bedGraph převedeny do formátu bigwig.
Pro vizualizaci velkých souborů byly použity nástroje IGV55. ChromHMM56 byl použit k vytvoření modelu stavu chromatinu ze dvou nezávislých studií, které využívaly objem tkáně hippocampu před a po šoku do nohy21,22 a ke stanovení násobku obohacení DAR oproti modelu stavu. Analýza obohacení motivu57,58 a anotace píku byly provedeny nástroji HOMER59. Všechny kódy jsou k dispozici v doplňkovém softwarovém souboru pro extrakci RNA a přípravu knihovny – Okamžitě následujte fixaci a třídění (viz příprava tkáně), 4 ul proteázy byly přidány do štěpícího pufru (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit pro FFPE, Life Technologies, AM1975) . Vzorky byly inkubovány v tepelných blocích po dobu 15 minut při 50 stupních, poté 15 minut při 80 stupních. Dále bylo ke každému vzorku přidáno 0,75 ml Trizol LS (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) a 0,2 ml roztoku fenol:chloroform (fenol:chloroform: isoamylalkohol, 1 fáze, VWR International, K169) a následně intenzivním třepáním po dobu 5 minut při teplotě místnosti (RT). Suspenze byla umístěna do těžkých zkumavek Phase lock gel (PLG, 5 Prime, 2302830) a odstřeďována při 13,000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Vodní fáze s nukleovými kyselinami byla extrahována ze zkumavek do čerstvé Eppendorfovy zkumavky se stejným množstvím 100% ethanolu. Purifikace RNA byla provedena pomocí sady Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) pro čištění RNA podle pokynů výrobce. RNA byla eluována (10 ul, DEPC) a poté skladována při -80 stupních. Pro přípravu a amplifikaci knihovny byl použit SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006). Pro přípravu knihovny byly použity 3 biologické replikáty (N=3). Knihovny byly připraveny podle pokynů výrobce bez dalšího fragmentačního kroku (FFPE, volba 2, viz manuál), s deplecí ribozomální cDNA a konečnou PCR amplifikací (15 cyklů). Knihovny byly sekvenovány na platformě Illumina HiSeq 2000 v MIT BioMicro Center.
Analýza RNA-seq – nezpracovaná data fastq byla porovnána s myší mm9 reference
genom pomocí motýlka 2.0. Mapovaná čtení z genových těl (včetně čtení exonů a intronů) byla zpracována pomocí Cufflinks 2.260 a DEseq261 s anotací referenčního genu UCSC mm9 k odhadu množství transkriptů. Diferenciální genová exprese a následné analýzy byly provedeny pomocí DEseq2 a vlastních R skriptů. Relativní množství transkriptů bylo měřeno pomocí fragmentů na kilobázi exonu na milion mapovaných fragmentů (FPKM).
Pro analýzu transkripčních programů byla exprese každého genu hodnocena jinakPaměťfáze (Aktivováno - brzy, Aktivováno - pozdě, Reaktivováno) jejich log2násobnou změnou (log2FC) od bazálního stavu. 1095 odlišně exprimovaných genů (DEGs) prošlo mezními kritérii, ve kterých jsme pozorovali alespoň v jednom srovnání P-hodnoty< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Cistanche může zlepšit paměť
Zachycení konformace chromozomů (Hi-C)
Jádra z fixovaných buněk (viz tkáňový preparát) byla roztříděna do 1,5ml Eppendorfových zkumavek obsahujících 500 ul čerstvého ledově studeného lyzačního pufru (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA{{ 9}}, Pi a voda v kvalitě PCR) a zmraženy na suchém ledu a skladovány při -80 °C, dokud nebyly použity. Hi-C knihovny byly připraveny ze 100000 buněk/na skupinu (shromážděných od dvou zvířat) ve dvou biologických replikátech za použití Dovetail™ Hi-C kit manual (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Šest Hi-C knihoven bylo sekvenováno (párový konec) na platformě Illumina Nextseq 500. Potrubí HOMER Hi-C bylo použito k filtrování experimentálních artefaktů, jako je cirkularizace, samoligace a duplikáty PCR. Filtrované údaje byly porovnány s referenčním myším genomem (mm9) a dále zpracovány pomocí potrubí HOMER HI-C.
Nástroje Hi-C společnosti HOMER byly použity k provedení analýzy hlavních komponent (PCA) na datech Hi-C k identifikaci subjaderných kompartmentů (A a B) v rozlišení 50 kb (viz doplňkový software). Pro analýzu přepínání kompartmentů jsme nejprve odečetli hodnoty PC1 mezi skupinami. Dále jsme identifikovali horní přechody BtoA jako oblasti se změnou PC1 nad 90. percentilem a horní přechody AtoB jako oblasti se změnou PC1 pod 10. percentilem. Protože subjaderné kompartmenty jsou regulovány jako jednotky o několika stovkách kilobází, konsolidovali jsme po sobě jdoucí 50 Kb AtoB nebo BtoA segmenty, které byly ve vzdálenosti 100 Kb od sebe. Konsolidované domény, které měly celkovou velikost menší než 200 kb, jsme vyřadili. Přepnutí oddělení bylo uvažováno pouze v případě, že byla záporná hodnota transformována na kladnou hodnotu (a naopak). Nakonec byly porovnány pozitivní a negativní hodnoty první složky mezi všemi třemi populacemi neuronů (Basal, Activated – early a Activated – late).
Promotor zachycení Hi-C
Po fixaci a třídění (viz příprava tkáně) byly buňky roztříděny do 1,5ml Eppendorfových zkumavek obsahujících 500 ul čerstvého ledově studeného lyzačního pufru (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA{ {9}}, Pi a voda kvality PCR), zmrazené na suchém ledu a skladované při teplotě -80 °C, dokud nebyly použity. Hi-C knihovny byly připraveny z 10,000 buněk/na skupinu (N=3–4), jak bylo popsáno dříve62, s určitou úpravou. Vzorky byly odstředěny (4 stupně, 1 600 g po dobu 20 minut) a peleta byla resuspendována ve 400 ul 1,2x Cutsmart pufru (New England Biolabs,
USA). První restrikční štěpení bylo provedeno tak, jak je popsáno v původním protokolu s 1500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, USA), jako 6-základní řezač (namísto BglII v původním protokolu). Po značení biotinem a ligaci přes noc (podrobnosti viz původní protokol) byly vzorky odstředěny (4 stupně, 1600 x g po dobu 15 minut) a peleta byla resuspendována ve 25 ul PBS. Suspenze byla inkubována v 65c se 3 ul proteinázy K po dobu 12–16 hodin. Purifikace Hi-C DNA byla provedena tak, jak je popsáno v původním protokolu se 100 ul streptavidinových kuliček (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Pro druhý restrikční enzym jsme použili 4-základní řezač Hpych4V (10 U /na vzorek, R0620S, New England Biolabs, USA). Po reakci A-tailing (podrobnosti viz původní protokol) byly vzorky amplifikovány pomocí PCR (17 cyklů) a purifikovány pomocí kuliček AMPure XP. Hi-C knihovny byly eluovány ve 20 ul 10 mM Tris-HCl (pH 8,5). Návrh systému zachycení návnady pro Promoter Capture Hi-C – Seznam 5000 promotorů myších genů byl získán z dříve publikovaného protokolu v Schoenfelder. Et al.29. Seznam obsahuje pouze transkripty s biotypem oblastí kódujících protein s místy pro restrikční fragmenty HindIII. Byly navrženy dvě 120 bp zachytávací sondy, jedna na každý konec fragmentu. Sondy byly syntetizovány společností Agilent Technologies podle systému SureSelect target obohacení (Agilent Technologies).
Příprava a sekvenování Hi-C knihovny pro zachycení promotoru – K zachycení produktů ligace Hi-C obsahujících promotorové sekvence jsme použili dříve publikovaný protokol29. Krátce, do Hi-C DNA knihoven byly přidány hybridizační blokátory (Agilent Technologies). Hybridizační pufr a RNA záchytné návnady byly připraveny podle pokynů výrobce (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Dále byly blokátory DNA/hybridizace z Hi-C knihovny zahřívány po dobu 5 minut na 95 stupňů, než byla teplota snížena na 65 stupňů. DNA knihovny Hi-C byla smíchána s hybridizačním pufrem (předehřátým po dobu 5 minut na 65 stupňů) a následně s na míru navrženým záchytným návnadovým systémem (předehřátým po dobu 3 minut na 65 stupňů), skládajícím se z 10,000 biotinylovaných RNA zacílené na konce restrikčních fragmentů HindIII 5000 promotorů myších genů (Agilent Technologies, viz doplňkový materiál pro návrh záchytné návnady). Po 24 hodinách při 65 stupních v PCR přístroji bylo provedeno stažení biotinu (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) a promytí podle protokolu obohacení SureSelect Target (Agilent Technologies). Po posledním promytí byly kuličky resuspendovány ve 30 μl NEBufferu 2 bez předchozí eluce DNA a byla provedena post-capture PCR (čtyři amplifikační cykly s použitím illuminových univerzálních primerů) na DNA navázané na kuličky prostřednictvím biotinylované RNA. Knihovny Capture Hi-C byly sekvenovány na konci párů (Nextseq 500, Illumina).
Analýza Hi-C zachycení promotoru – ke zpracování nezpracovaných čtení rychlého sekvenování bylo použito potrubí HiCUP63. Toto potrubí bylo použito k mapování čtených párů proti myšímu (mm9) genomu, k filtrování experimentálních artefaktů (jako jsou cirkularizovaná čtení a re-ligace) a k odstranění duplicitních čtení. Pro data pc-HiC byly výsledné soubory BAM převzorkovány a zpracovány pomocí CHiCAGO verze 1.2.064 podle výchozího nastavení pro volání významných interakcí. Úplné podrobnosti o tomto potrubí jsou k dispozici od Babraham Bioinformatics
Cistanche může zlepšit paměť
Stereotaxický adeno-asociovaný virus injekce
Myši ArcCreERT2 byly anestetizovány avertinem a infuzí viru AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (sérotyp 5, získaný z jádra viru UNC). Nejprve byla v lebce nad dorzálním hipokampem (vzhledem k Bregmě: anterior-posterior −2.0 a mediolaterální ± 1,5) vytvořena malá díra a byla spuštěna Hamiltonova stříkačka s 33-gauge jehlou do -1,8 DV a 500 ηl viru bylo infundováno rychlostí 50 ηl za minutu do obou hipokampů. Po 10 minutách po injekci byla jehla vytažena a myši byly ponechány zotavit se po dobu 4 dnů.
