Studie části 3 ukázaly, že autofagie hraje důležitou roli v regulaci buněčné depozice LD

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

ABSTRAKTNÍ

Objevující se důkazy naznačují, že neočekávané ukládání a peroxidace lipidových kapiček (LD) může urychlit stres organel a hraje klíčovou roli v patogenezi neurodegenerativních onemocnění (NDD). V naší předchozí studii jsme potvrdili, že kaempferol (Ka), přírodní malá molekula flavonoidu, vykazoval neuroprotektivní účinky na myši s LPS-indukovanou Parkinsonovou nemocí (PD). Předchozí studie navíc ukázaly, že autofagie hraje důležitou roli v regulaci buněčného ukládání LD. V současné studii jsme ukázali, že Ka chránila před TH plus ztrátou neuronů a behaviorálními deficity u MPTP/p-indukovaných PD myší, doprovázených sníženým lipidovým oxidačním stresem v substantia nigra pars compacta (SNpc). V kultivovaných neuronových buňkách Ka vykazoval relativně bezpečný rozsah koncentrací a významně potlačoval akumulaci LD a buněčnou apoptózu indukovanou MPP plus. Další studie ukázala, že ochranný účinek Ka byl závislý na autofagii, konkrétně lipofagii. Kriticky, Ka podporoval autofagii, aby zprostředkovával degradaci LD v lysozomech, což pak zmírnilo ukládání lipidů a peroxidaci a výsledné mitochondriální poškození, v důsledku čehož se snížila smrt neuronů. Kromě toho knockdown Atg5 zprostředkovaný AAV-shAtg{3}} zrušil neuroprotektivní účinky Ka proti oxidaci lipidů u PD myší.Cistanche pro zlepšení pamětiTato práce ukazuje, že Ka zabraňuje dopaminergní neuronální degeneraci u PD prostřednictvím inhibice mitochondriálního poškození zprostředkovaného peroxidací lipidů podporou autofagie rtů a poskytuje potenciální novou terapeutickou strategii pro PD a související NDD.

Kliknutím sem se dozvíte více

Úvod

Parkinsonova nemoc (PD) je běžné neurodegenerativní onemocnění (NDD), které je patologicky charakterizováno progresivní ztrátou dopaminergních (DA) neuronů v substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Přestože přesná etiologie a přirozený průběh této nemoci musí být dosud plně objasněny, v patogenezi PD se podílí četné procesy a dysfunkce na systémové úrovni, včetně mitochondriálních funkcí, homeostázy dopaminu, neurozánětu a autofagie [1, 2]. Nedávné zprávy odhalily, že lipotoxicita související s lipidovými kapkami (LD) se může podílet na patologii PD [3,4]. Nedávno se ukázalo, že LD hrají mnohem širší roli než ukládání mastných kyselin (FA) a účastní se mnoha onemocnění. (cistanche para que serve) Například myeloidní buňky, včetně makrofágů, leukocytů a eozinofilů, tvoří LD jako odpověď na zánět a stres,cistanche v čínštiněa LD jsou místa produkce a ukládání zánětlivých cytokinů a dále se podílejí na prezentaci antigenu a clearance patogenů [6]. Důležité je, že u aterosklerózy bylo prokázáno, že pěnové buňky bohaté na LD jsou škodlivé ve všech stádiích onemocnění [7].

Cistanche může zlepšit imunitu

LD však nebyly rozsáhle studovány v centrálním nervovém systému (CNS), jen málo prací uvádí histologickou přítomnost LD v lidské mozkové tkáni [8,9]. I tak mohou mít LD důležité funkce v mozku, protože nedávné studie potvrdily, že agregované LD v glii urychlovaly neurodegeneraci v modelu Drosophila [10]. Nedávno bylo hlášeno, že u myší byly buňky nasycené lipidy obsahující olejovou červenou O-pozitivní, včetně neuronů, gliálních fibrilárních kyselých proteinů (GFAP)t astrocytů a ionizované molekuly adaptéru vázajícího vápník-1 (IBA{{7} })t mikroglie, jsou přítomny v mnoha oblastech mozku a bylo prokázáno, že se účastní procesů souvisejících s věkem [11]. Naše předchozí práce také prokázala zvýšenou akumulaci LD v mozku na modelu PD myší [12]. Celkově vzato tyto studie naznačují, že LD se mohou podílet na patogenezi PD, stejně jako jiných NDD.

Normálně jsou intracelulární LD degradovány v lysozomech a dodávají FA do mitochondrií pro jejich spotřebu jako alternativního zdroje energie během období vyčerpání živin [13]. Neurony však mají nízkou kapacitu pro spotřebu mitochondriálních FA pro produkci energie [14]. Tato vlastnost činí neurony zvláště citlivé na akumulaci LD a peroxidaci. Kromě toho akumulace LD zvyšuje rychlost oxidace FA a vytváří trvalý tlak na mitochondriální elektronový transportní řetězec, což zvyšuje produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) komplexy elektronových transportních řetězců I a III [15] za účelem zesílení oxidačního stresu. Přetížení lipidů také vede k produkci ROS extramitochondriálními zdroji, jako jsou nikotinamid adenindinukleotid fosfát (NADPH) oxidázy a další oxidační enzymy. V kombinaci se sníženou expresí antioxidačních enzymů a nízkou kapacitou spotřeby FA v neuronech zprostředkovává akumulace LD oxidační stres a může dále vést k poškození mitochondrií, lysozomální dysfunkci, defektní autofagii a aktivaci zánětlivých odpovědí [16,17]. Pokud nemohou být nahromaděné LD inhibovány nebo odstraněny, vysoce aktivní neurony podléhají patofyziologii, což vede k neurodegeneraci [17]. (cistanche penis) Důkazy naznačují, že lysozomy zprostředkovaný katabolický proces zvaný autofagie hraje klíčovou roli při udržování buněčné homeostázy LD ve více tkáních [17,18]. Podrobně,cistanche růst penisuLD mohou být selektivně sekvestrovány v autofagosomech a dopraveny do lysozomů k degradaci lysozomálními kyselými lipázami, což je proces specificky známý jako lipofagie [19]. Cílení na LD a jejich autofagickou cestu odstranění by proto mohlo představovat nový přístup ke zvládání neurodegenerace.

Studium přírodních produktů a dietních látek jako zdrojů pro potenciální léčbu a strategie NDD si v posledních letech získalo obrovský zájem [20]. Kaempferol (Ka) je přírodní polyfenolická malá molekula, kterou lze nalézt v řadě čínských léčivých bylin a potravinových zdrojích [21]. Bylo popsáno, že Ka má antibakteriální, anti-aging a imunomodulační účinky, stejně jako antioxidační a neuroprotektivní aktivity [20,22,23]. Dříve bylo popsáno, že Ka inhibuje zánět v mikrogliálních buňkách BV2 in vitro [24] a zvyšuje odolnost DA neuronů vůči neurozánětům in vivo [25]. Účinek Kaon LD u PD však dosud nebyl zkoumán.

Vzhledem k důležitosti LD a úzkému spojení mezi LD, mitochondriemi a autofagií [16], které jsou všechny zapojeny do PD, předpokládáme, že Ka inhibuje peroxidaci LD a zabraňuje neurodegeneraci DA u PD. V této studii jsme prokázali, že Ka významně chrání před neurodegenerací v myším PD modelu inhibicí akumulace LD. (cistanche powder) Další studie odhalila, že Ka spustil autofagii a snížil akumulaci oxidovaných LD, aby zmírnil mitochondriální dysfunkci a produkci mitochondriálních ROS (mtROS), čímž zabránil apoptotické smrti neuronů.cistanche propiedadesPoznatky získané v této studii mohou pomoci řídit klinická rozhodnutí týkající se použití přirozené molekuly Ka u NDD, jako je PD.

2. Materiály a metody

2.1. Pokusná zvířata

Myši C57BL/6J (samci, 4-měsíc staré) byly získány z Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosMyši byly udržovány a chovány v Centru živočišných zdrojů Lékařské fakulty Nanjingské lékařské univerzity a ve zvířecím zařízení v nemocnici Nanjing Drum Tower Hospital. Myši mají volný přístup k potravě a vodě v místnosti s okolní teplotou 22 stupňů ± 2 stupně a cyklem světlo/tma 12:12 h. Všechny postupy na zvířatech byly prováděny v přísném souladu s pokyny National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

2.2. Činidla

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 procent ,96,353) pro experimenty in vitro bylo získáno od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) a DHE (D11347) byly zakoupeny od Thermo Fisher Scientific. Pro pokusy na zvířatech byl Ka rozpuštěn v roztoku 10% DMSO v 16% SBE- -CD ve sterilním fyziologickém roztoku. Pro buněčné experimenty byl Ka připraven v DMSO (Sigma-Aldrich) a PBS (konečná koncentrace DMSO je 0,01 procenta), pH 7,4.

2.3. Indukce a léčba methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinu (MPTP)-indukovaného myšího modelu PD

Pro vyhodnocení účinků Ka v PD modelu MPTP/p-toxicity byly myši (samci, ve věku 4-5 měsíců) náhodně rozděleni do skupiny léčené fyziologickým roztokem, skupiny léčené MPTP, skupiny léčené MPTP plus Ka a skupina léčená samotným Ka. Ve skupině léčené MPTP myši dostávaly chronické podávání MPTP s protokolem podobným tomu, který byl popsán dříve [26]: MPTP byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku a injikován subkutánně v dávce 25 mg/kg a následně 250 mg/kg probenecidu (rozpuštěného v dimethylsulfoxidu). intraperitoneální (ip) injekce v intervalech 1 h každé 3,5 dne po dobu 5 týdnů. (kořen cistanche) Kontrolní myši dostaly injekci fyziologického roztoku a probenecidu. Ve skupině léčené MPTP plus Ka myši dostávaly Ka (50 mg/kg, jedna injekce/den během experimentů, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Čína) intraperitoneálně (ip) denně 3 dny před léčbou MPTP a po dobu 5 MPTP injekční týdny. Jeden týden po poslední injekci MPTP byly myši podrobeny behaviorálnímu testování zaslepeně vůči skupinám. Poté byly všechny myši anestetizovány 40 mg/kg pentobarbitalu sodného a usmrceny pro detekci mozkových proteinů a imunohistochemii nebo analýzu qPCR.

2.4. Stereotaxická chirurgie in vivo a experimentální léčba

Stereotaxická operace v anestezii pentobarbitalem sodným (40 mg/kg, ip) byla provedena, jak je popsáno [25]. Myší Atg5 a kontrolní shRNA byly transfekovány balicími vektory (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP), aby se vytvořil AAV. Pro mikroinjekci se anestetizované myši umístí do stereotaxického zařízení. Byl jim vstříknut 1 μl AV skleněnou elektrodou mířící na DG (AP:-0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV:-0,45 mm） rychlostí 0,25 ul/min. Potom byla jehla ponechána další 2-min. 2 týdny po mikroinjekci viru byly myši podrobeny MPTP-indukovanému PD modelovému vedení a (nebo) léčbě Ka.

Atg5 shRNA byla získána od Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Pro umlčení Atg5 byly primery uvedeny v doplňkové tabulce 1.

2.5. Behaviorální analýza

Týden po poslední injekci MPTP nebo fyziologického roztoku byly provedeny rotační a tyčový test, jak bylo popsáno výše [27]. Pro test na rotarodu byly myši aklimatizovány na rotarod ve dvou pokusech (6 minut se zrychlenou rychlostí 12-20 ot./min) denně po 2 po sobě jdoucí dny před začátkem experimentu. Poté byly myši testovány při 20 otáčkách za minutu po dobu 300 s po další 3 po sobě jdoucí dny. Latence do poklesu byla zaznamenána pomocí systému Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Čína). Pro test tyče byly myši umístěny hlavou nahoru na vrchol svislé dřevěné tyče (drsný povrch, výška 50 cm, průměr 1 cm). Všechny myši byly na zařízení zvyklé 2 dny před testováním a poté byly testovány třikrát třetí den. Zaznamenával se celkový čas (T-total, dokud myš nedosáhla na podlahu svými čtyřmi tlapkami) a doba otočení (T-turn, aby se myš úplně otočila hlavou dolů). Experiment byl zaslepen na myších skupinách pro každý behaviorální test a test byl proveden třikrát.

2.6. Sbírka vzorků mozku

Po závěrečných behaviorálních testech byly myši anestetizovány pentobarbitalem sodným (40 mg/kg, ip). Pro qPCR, western blotting a analýzu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) byly ze zvířat rychle extrahovány celé mozky, poté byly rychle vypreparovány tkáně středního mozku a striatum, předem zmrazené kapalným dusíkem. Všechny vzorky byly skladovány při -80 stupních až do analýzy.

Pro imunohistochemickou analýzu byly myši perfundovány transkardiálně 4% paraformaldehydem (PFA). Mozky byly extrahovány, dodatečně fixovány, dehydratovány, vloženy do OCT (Tissue-Tek) a sériové řezy mozků byly kryosekci (30 μm na řez) přes každou celou vrstvu a střední mozek pomocí mrazícího mikrotomu (Leica CM1950, Nussloch, Německo ). Všechny řezy byly shromážděny v šesti samostatných sériích a mozkové řezy byly uloženy v 50% glycerinu a zmraženy na -20 stupeň až do analýzy.

Pro TEM byly myši perfundovány 2,5 procenty glutaraldehydu a 2 procenty paraformaldehydu, jak je popsáno 【12】. Malá porce (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Imunohistochemická analýza

Mozkové řezy byly opláchnuty v PBS a následně 3% H2O2 po dobu 10 min, poté inkubovány s 0,3% Tritonem X-100 v PBS doplněném 5% BSA po dobu 1 hodiny. Poté byla sklíčka inkubována s primárními protilátkami při 4 stupních přes noc v PBS obsahujícím 5 procent BSA při 4 stupních přes noc, poté promyta a inkubována v sekundárních protilátkách po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, následovala inkubace s diaminobenzidinem (DAB) nebo montáž do DAPI (Life Technologies, Cat P36931) jako imunofluorescenční barvení po dobu 5 min. Pro barvení Nissl byla sklíčka sloučena v roztoku kresylové violeti (CV) (0,1 g kresylové violeti, 99 ml H20 a 1% kyseliny octové 1 ml) po dobu 30 minut při teplotě místnosti a poté dehydratována alkoholem a xylenem. Snímky byly pozorovány a fotografie byly zachyceny pod mikroskopem Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Spojené státy americké). Celkový počet TH-pozitivních a Nissl's-pozitivních neuronů v SNpc byl získán sérologicky pomocí metody optického frakcionátoru se softwarem MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7Analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Vzorky striatálního pruhu myší byly homogenizovány {{0}},1 M kyselinou chloristou （1 mg tkání v 100μL kyseliny chloristé） a 0,1 mM EDTA, ošetřeny ultrazvukem a centrifugováno při 20, 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut, jak je uvedeno [27]. Poté byly supernatanty shromážděny pro měření. Mobilní fáze je směsný roztok sestávající z 90 mM dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​1,7 mM kyseliny 1-oktansulfonové, 50 mM citrátu, 50 uM EDTA, 10 procent acetonitrilu s průtokem 0,2 ml/min. Paralelně se pro výpočet kvantitativní standardní křivky připravil zásobní standardní roztok pro dopamin a kyselinu dihydroxyfenyloctovou (DOPAC) (Sigma-Aldrich, USA）) v 0,1 M HC104. Bylo injikováno množství 10 ul připraveného supernatantu nebo standardního roztoku. do mobilní fáze a testovány elektrochemickým detektorem ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Vzorky byly měřeny a kvantifikovány píky. Koncentrace monoaminů byly kvantifikovány porovnáním se standardem pomocí softwaru ClarityChrom (Knauer, Německo) a poté obsahy ve vrstvě byly převedeny podle poměru ředění Standardní křivka DA a DOPAC byla znázorněna na doplňkovém obrázku 1a a b.

2.8. Buněčné kultury a ošetření

Kultury mezencefalických primárních neuronů byly prováděny tak, jak bylo popsáno dříve [12]. Stručně řečeno, mezencefalické tkáně myší C57BL/6 v embryonální den 14/15 (E14/15) byly opatrně odstraněny, mechanicky disociovány, aby se odstranily membrány a velké krevní cévy, a pak pitvány. Dále byly štěpeny trypsinem-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) a poté filtrovány přes 100-um filtr, aby se získala jednobuněčná suspenze. Následně byly buňky naneseny na poly-L-lysinem předem potažené 12-/24-jamkové destičky v hustotě 2,5 × 10 stupně buněk/ml obsahující Neurobasal médium (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) doplněný o B27 (2 procenta v:v, Cat 1750404, GibcoTM) a penicilin/streptomycin (0,5 procent v:v). Kultury byly udržovány ve zvlhčené komoře (37 stupňů, 5 procent CO2 inkubátor). Kultivační médium bylo měněno každé 3 dny a buňky lze používat po 7-10 dnech.

Buněčné linie: Buněčné linie SH-SY5Y byly kultivovány v 10 procentech FBS a 1 procentech penicilin/streptomycin ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních a 5 procentech CO2. V experimentech byly buňky SH-SY5Y ošetřeny MPP plus （200 μM） nebo různými dávkami Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) po dobu 24 hodin. Buňky SY5Y byly stimulovány MPPt（400 μM） po dobu 24 h. Ka（30μM, 3h）s (nebo bez)3-MA（3mM,1h）nebo -tokoferol） (50μM,1 h, Sigma-Aldrich, 477-Aldri ）primované-SH-SH5Y buňky byly stimulovány MPPT（200μM） po dobu 24 hodin.

2.9. Test životaschopnosti buněk CCK8

Změněná životaschopnost buněk při léčbě Ka byla detekována pomocí sady Cell Counting Kit-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Stručně řečeno, buňky SHSY5Y byly nasazeny do 96- a poté ošetřeny různými koncentracemi Ka（3, 30, 60, 100, 300, 600, 600 uM） po dobu 24 hodin. Poté bylo do každé jamky na 4 hodiny přidáno 10 ul činidla CCK{13}}. Nakonec byla absorbance detekována pomocí Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) při 450 nm.

2.10. Test ATP

Buněčné hladiny ATP byly detekovány pomocí ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Čína) podle pokynů výrobce. Po ošetření byly buňky lyžovány a centrifugovány při 12, 000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při 4 stupních a byly odebrány supernatanty. Pracovní roztok （100μL） byl přidán k 20μL vzorku v 96-jamkové destičce a luminiscence byla okamžitě měřena na automatické čtečce mikrodestiček. Měření ze všech vzorků byla normalizována na koncentraci proteinu.

2.11. Na plus -K plus -ATPázový test

Pro měření Nat-K plus -ATPase (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Čína) byly buňky sonikovány a centrifugovány při 600 otáčkách za minutu po dobu 10 minut, aby se získal supernatant. Byly přidány reakční roztoky detekce Nat-Kt-ATPázy a inkubovány podle pokynů výrobce. Poté byla detekována absorbance při 660 nm. Měření všech vzorků byla normalizována na koncentraci proteinu.

2.12. Western blotting analýza

Buňky nebo mozkové tkáně byly lyžovány v RIPA pufru (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl, 1 procento NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5 procenta deoxycholátu sodného (D6750, Sigma), 0,1 procenta SDS (74255, Sigma) doplněné proteázou a inhibitory fosfatázy (Roche, Shanghai, Čína). Koncentrace proteinů byly stanoveny pomocí sady Micro BCA Kit (Beyotime, Shanghai, China). 30-ug proteinu každého vzorku bylo separováno pomocí SDS-PAGE pomocí polyakrylamidových TGX gelů (Bio-Rad, Hercules, Kalifornie, USA) a poté přeneseno na polyvinylidendifluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Bedford, MA). Po zablokování byly membrány PVDF inkubovány s různými specifickými primárními protilátkami v TBST při 4 stupních přes noc, poté promyty a inkubovány v odpovídajících sekundárních protilátkách konjugovaných s křenovou peroxidázou (HRP) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány a detekovány zesílenou chemiluminiscencí (ECL) plus detekčním činidlem (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) a analyzovány pomocí zobrazovacího systému ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13. Kvantitativní (Q) a reverzní transkripce (RT)-PCR v reálném čase

Celková RNA byla extrahována z mozkových tkání a kultivovaných buněk pomocí činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverzní transkripce byla provedena pomocí reagenční soupravy TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japonsko). qPCR v reálném čase byla provedena pomocí SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) v přístroji StepOnePlus (Applied Bio-systems). Roznětky byly zakoupeny a ověřeny General (Shanghai, Čína). Primery použité pro qPCR byly uvedeny v doplňkové tabulce 2.

Tento článek je převzat z Redox Biology 41 (2021) 101911