Část 3: Echinakosid izolovaný z Cistanche Tubulosa domněle stimuluje sekreci růstového hormonu prostřednictvím aktivace receptoru ghrelinu

Echinakosid izolovaný z Cistanche tubulosa domněle stimuluje sekreci růstového hormonu prostřednictvím aktivace receptoru ghrelinu

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* a Jason TC Tzen 1,*

1 Absolvent Ústavu biotechnologie, Národní univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Tchaj-wan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Tchaj-wan; rd1@koda.com.tw

3 Ústav veterinárního lékařství, Národní univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Tchaj-wan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Korespondence: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)

Akademický redaktor: Pinarosa Avato

Přijato: 22. ledna 2019; Přijato: 14. února 2019; Zveřejněno: 17. února 2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní:Cistanchedruh, ženšen z pouště, má mnoho biologických aktivit v tradiční čínské lékopise a používá se jako lék proti stárnutí. Tři fenylethanoidové glykosidy –echinakosid, tubulosid A a akteosid – byly detekovány ve vodném extraktu zCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight a hlavní složka,echinakosid, byl dále čištěn.Echinakosido koncentraci vyšší než 10_6 M vykazovaly významnou aktivitu pro stimulaci sekrece růstového hormonu buňkami hypofýzy potkana. Podobně jako u hormonu uvolňujícího růstový hormon-6, syntetického analogu ghrelinu, byla stimulace sekrece růstového hormonu echinakosidem inhibována [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látkou P , inverzní agonista receptoru ghrelinu. Molekulární modelování ukázalo, že všechny tři fenylethanoidní glykosidy adekvátně interagovaly s vazebnou kapsou ghrelinového receptoru a echinakosid vykazoval o něco lepší interakci s receptorem než tubulosid A a akteosid. Výsledky naznačují, že fenylethanoidové glykosidy, zejména echinakosid, jsou aktivními složkami, které jsou údajně zodpovědné za účinky C. tubulosa proti stárnutí a lze je považovat za nepeptidové analogy ghrelinu.

klíčová slova: cistanchetubulosa;echinakosid; ghrelin; sekrece růstového hormonu;fenylethanoidglykosidy

echinakosidvcistanchemá mnoho účinků

Pls klikněte sem pro část 2

4. Materiály a metody

4.1. Chemikálie a rostlinné materiály

Cistanchedeserticola YC Ma byla získána z místního trhu a ověřena Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight byl zakoupen od Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Čína). Acetonitril, kyselina mravenčí a methanol čistoty pro HPLC byly zakoupeny od ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), dialyzované fetální bovinní sérum (DFBS) a Trypsin-EDTA byly zakoupeny od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DNase I byl zakoupen od Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). Hormon uvolňující růstový hormon-6 (GHRP-6) byl získán od Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). Kolagenáza typu I a [D-Argl, D-Phe5, D-Trp7,9, Leull]-látka P byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Kit ELISA pro potkaní růstový hormon byl zakoupen od Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, Čína).

4.2. HPLC/UV a LC_MSn analýzy vodní extrakce Cistanche spp.

Sušená nať (25 g).Cistanchedeserticola YC Ma neboCistanchetubulosa (Schenk) R byla třikrát extrahována 50}0 ml destilované vody po dobu 60 minut při 50 stupních ve vodní lázni. Roztok byl přefiltrován přes 13 mm syrový filtr s 0,45 um PP membránovým filtrem (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) a podroben následujícím analýzám. Byly analyzovány chemické složky v extraktech

za použití kolony Syncronis C18 (vnitřní průměr 4,6 × 250 mm, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) v systému HPLC spojené s detektorem fotodiodového pole model 600E (Waters Corporation,

Milford, MA, USA). Mobilní fáze sestávala z (A) vody obsahující {{0}},1 procenta kyseliny mravenčí a (B) acetonitrilu. Eluční gradient byl následující: 0-60 min, lineární gradient od 14 procent B; 0–3 min, 14 procent až 17 procent B; 3–4 min, 17 procent B; 4–15 min, 17 procent až 20 procent B; 15–20 min, 20 procent B; 20–50 min, 20 procent až 14 procent B; 50–60

min, 14 procent B. Vlnová délka detekce absorbance ultrafialového záření (UV) byla nastavena na 330 nm. Tandemový hmotnostní spektrometr s lineární pastí quadrupole (LTQ) (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) vybavený rozhraním elektrosprejové ionizace (ESI) byl připojen k systému Surveyor LC (Thermo Electron)

s 5 ul vzorkovací smyčkou. Eluční gradient byl následující: 0–90 min, lineární gradient od 14 procent B; 0–24 min, 14 procent až 17 procent B; 24–25 min, 17 procent B; 25–36 min, 17 procent až 20 procent B; 36–37 min, 20 procent B; 37–80 minut,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 procenta) jako srážkový plyn.

4.3. Izolace Echinakosidu

Vodný extrakt ze sušeného stonku (25 g) C. tubulosa byl zahuštěn za sníženého tlaku za vzniku tmavě hnědého sirupu. Surová extrakce byla suspendována v destilované vodě a lyofilizována lyofilizačním zařízením. Prášek 100 mg byl rozpuštěn v destilované vodě o objemu 5 ml a podroben purifikaci pomocí kolony Sephadex LH-20 (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Švédsko) eluované 10% vodným roztokem methanolu a monitorován pomocí HPLC . Frakce obsahující echinakosid byly detekovány odečtením absorbance při 245 nm a sklizeny pomocí autosampleru.

4.4. Zvířata

Experimenty byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee of the National Chung_Hsing University s číslem schválení IACUC 106-079. Samci krys Sprague_Dawley o hmotnosti 250_300 g byli zakoupeni od BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Dvě zvířata v kleci byla chována v kontrolovaném prostředí 23 o2, 60 až 10 procent vlhkosti a 12hodinovém cyklu světlo/tma. Krysy byly krmeny standardní stravou (kalorie).

28,7 % bílkovin, 13,4 % tuku a 57,9 % sacharidů, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) a destilované vody ad libitum.

4.5. Primární buněčná kultura hypofýzy

Buňky hypofýzy byly izolovány podle modifikované enzymatické disperzní metody vyvinuté Yamazaki et al. [29]. Stručně řečeno, samci potkanů ​​Sprague Dawley byli anestetizováni Zoletilem 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Francie) a přední hypofýzy byly odstraněny a dispergovány do kultivace hypofýzových buněk v suspenzi, jak bylo popsáno dříve [30].

4.6. Test sekrece růstového hormonu

Primární buňky předního laloku hypofýzy 4 × 104 buněk/jamka byly kultivovány při 37 stupních pod 5 procenty CO2 po dobu 2 dnů před testem sekrece růstového hormonu podle protokolu popsaného dříve [30].

Po odstranění kultivačního média byly buňky vyhladověny v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) bez séra po dobu 90 minut, aby se stabilizovala bazální sekrece hormonů. Hladovějící médium bylo nahrazeno čerstvým DMEM obsahujícím echinakosid (od 10_8 do 10_5 M) nebo GHRP-6 (agonista lidského receptoru ghrelinu, GHSR, 10_7 M) jako pozitivní kontrola a buňky byly inkubovány po dobu 15 a 30 minut při 37 stupních pod 5 procenty CO2. Pro detekci antagonistického účinku byly buňky inkubovány s GHSR

inverzní agonista, [D-Argl, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látka P (0,5 uM), a poté ošetřena DMEM obsahujícím echinakosid (10_5 M) nebo GHRP-6 (10_7 M) po dobu 30 min. Médium bylo shromážděno pro

stanovení sekrece růstového hormonu pomocí soupravy ELISA pro potkaní růstový hormon (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Statistická analýza

Data byla prezentována jako průměrné hodnoty o SD. Rozdíly byly analyzovány T-testem. Statistické výpočty byly provedeny pomocí GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Hladina p < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">

4.8. Homologické modelování a dokování

Homologické modelování a dokování k lidskému receptoru ghrelinu, receptoru sekretagogu růstového hormonu (GHSR, přístupové číslo AAI13548), bylo založeno na základě naší předchozí konstrukce [21,24]. Stručně řečeno, krystalové struktury 1 a 2 adrenergních receptorů (PDB 2YCY a 3PDS) s navázanými ligandy, kyanopindololem a FAUC50 byly použity jako templáty pro konstrukci struktury GHSR [31,32]. Struktura GHSR s nejnižší celkovou energií PDF byla vybrána pro další dokování s GHRP-6, echinakosidem, tubulosidem A a akteosidem. Všechny procesy modelování byly provedeny pomocí platformy Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).

3D struktura GHRP-6 byla stažena z databáze sloučenin Pub-Chem na webu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3D struktury echinakosidu, tubulosidu A a akteosidu byly vytvořeny pomocí programu Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). Ligand-vazebné místo GHSR bylo definováno jako sférický prostor s poloměrem 14 Á od středu vazebné kapsy v simulaci dokování. Ukotvení GHRP-6, echinakosidu, tubulosidu A nebo akteosidu na vazebné místo GHSR bylo provedeno in silico použitím modulu LibDock v balíčku Discover Studio 2.1 a dále minimalizováno algoritmem chytré minimalizace pomocí silového pole CHARMm v Objevte balíček Studio 2.1 [33]. Pro porovnání relativních vazebných afinit echinakosidu, tubulosidu A a akteosidu v GHSR byla pro dokování použita aktivní středová oblast zkonstruovaná pomocí GHRP-6 v GHSR a vazebná energie byla vypočtena GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , Národní univerzita Chiao Tung, Tchaj-wan).

Autorské příspěvky: Animal experiments, C.-JW, Y.-CL a W.-YC; Identifikace a čištění: MY.C., N.-HL a C.-HC; Molekulární modelování: C.-JW, Y.-CL a JTCT; Návrh a psaní projektu: C.-HC a JTCT

Financování: Práce byla částečně podpořena grantem pro Jasona TC Tzena z National Chung-Hsing University (NCHU-102D604).

Poděkování: Autoři děkují Tian-Shun Wengovi za sdílení jeho profesionálních zkušeností s používáním druhů Cistanche.

Střet zájmů: Všichni autoři prohlašují, že nedošlo ke střetu zájmů.

Reference

1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Pouštní ženšen": Recenze. Dopoledne. J. Chin. Med. 2012,40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]

2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Etanolový extrakt Cistanche tubulosa zprostředkovává hladiny pohlavních hormonů u potkanů ​​indukcí testikulárních steroidogenních enzymů. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]

3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Molekulární dráhy související s podporou dlouhověkosti a kognitivním zlepšením Cistanche tubulosa u Drosophila. Fytomedicína 2017, 26, 37–44. [CrossRef]

4. Wu, ČR; Lin, HC; Su, MH Reverze pomocí vodných extraktů z Cistanche tubulosa z behaviorálních deficitů v modelu potkanů ​​podobných Alzheimerově chorobě: Relevance pro ukládání amyloidu a funkci centrálního neurotransmiteru. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

5. Xuan, GD; Liu, CQ Výzkum účinku fenylethanoidních glykosidů (PEG) z Cistanche deserticola na anti-aging u starých myší vyvolaný D-galaktózou. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]

6. Jiang, Y.; Tu, PF Analýza chemických složek u druhů Cistanche. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche celkové glykosidy na vliv vaskulární demence potkanů ​​na učení a paměť a výzkum mechanismů. Brada. Bylina. Med. 2005, 36, 1852–1855.

8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinakosid podporuje regeneraci kostí zvýšením poměru OPG/RANKL v buňkách MC3T3-E1. Fitoterapie 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]

9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Hypocholesterolemické účinky extraktu Cistanche tubulosa, čínské tradiční surové medicíny, u myší. Dopoledne. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]

10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Účinek echinakosidu na fibrózu ledvin inhibicí signální dráhy TGF- 1/Smads v modelu diabetické nefropatie u myší DB/DB. Drug Des. Devel. Ther. 2017, 11,2813–2826. [CrossRef]

11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Slunce, HX; Liu, X. Antihyperglykemické a hypolipidemické účinky Cistanche tubulosa u diabetických DB/DB myší typu 2. J. Ethnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]

12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Předběžná optimalizace vzorce čínské bylinné medicíny založené na neuroprotektivních účincích u potkaního modelu Parkinsonovy choroby vyvolané rotenonem. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]

13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Datum, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin je acylovaný peptid uvolňující růstový hormon ze žaludku. Příroda 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]

14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Exprese mRNA receptoru ghrelinu v mozku potkanů ​​a myší. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]

15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin v regulaci tělesné hmotnosti a metabolismu. Přední. Neuroendokrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]

16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagraj, HS; Němci, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Účinky lidského růstového hormonu u mužů starších 60 let. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Systematický přehled: Bezpečnost a účinnost růstového hormonu u zdravých starších osob. Ann. Internovat. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]

18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Léčba růstovým hormonem v lidském stárnutí: Výhody a rizika. Hormony 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]

19. Sattler, FR Růstový hormon u stárnoucího muže. Nejlepší praxe. Res. Clin. Endocrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]

20. Lo, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, jedinečné acylované flavonoidní tetraglykosidy v čaji Chin-shin oolong, jsou domnělými perorálními agonisty receptoru ghrelinu.

J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]

21. Hsieh, SK; Lo, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identifikace biosyntetických meziproduktů teagrelinů a sloučenin podobných teaghrelinu v čajích oolong a jejich molekulární připojení ke ghrelinovému receptoru.

J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]

22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Lo, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgogreliny, unikátní acylované flavonoidní glykosidy v Folium Ginkgo, stimulují sekreci růstového hormonu aktivací receptoru ghrelinu. J. Ethnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]

23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Píseň, X.; Fu, F.; Gao, X. Strukturní charakterizace a identifikace fenylethanoidních glykosidů z Cistanches deserticola YC Ma pomocí UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem. Anální. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]

24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Kvantitativní analýza Cistanches Herba pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojené s detekcí diodového pole a hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením v kombinaci s chemometrickými metodami. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]

25. Měsíc, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Oh, MS; a kol. Neuroprotektivní účinek ghrelinu v 1-methyl-4-fenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridinovém myším modelu Parkinsonovy choroby blokováním mikrogliální aktivace. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]

26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Beyond the stress concept: Allostatická zátěž-Vývojová biologická a kognitivní perspektiva. In Developmental Psychopathology: Volume Two: Developmental Neuroscience; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; s. 578–628.

27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovič, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Michailidis, DP; Isenovic, ER Přehled kardiovaskulárních a antiaterogenních účinků ghrelinu. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]

28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW inverzní agonisté ghrelinového receptoru: Identifikace aktivního peptidového jádra a jeho interakčních epitopů na receptoru. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]

29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Regulační účinek ghrelinu na sekreci růstového hormonu z perfundovaných buněk přední hypofýzy potkana. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]

30. Lo, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, jedinečný derivát emodinu v Heshouwu, stimuluje sekreci růstového hormonu prostřednictvím aktivace receptoru ghrelinu. J. Ethnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]

31. Mouchametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Dvě odlišné konformace helixu 6 pozorované ve strukturách beta1-adrenergního receptoru vázaných na antagonisty. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]

32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; a kol. Struktura a funkce ireverzibilního komplexu agonista-beta(2) adrenoceptor. Příroda 2011, 469, 236–240. [CrossRef]

33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; Státy, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM – Program pro výpočty makromolekulární energie, minimalizace a dynamiky. J. Computing. Chem. 1983, 4, 187–217. [CrossRef]