Část 2: Odtok hořčíku z buněk Drosophila Kenyon je kritický pro normální a dietou vylepšenou dlouhodobou paměť

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Prosím klikněte na ni do části 1

Prosím klikněte na ni do části 3

Klikněte naCistanche tubulosa prášek pro paměť

Role uex v tělech hub

K lokalizaci uex v mozku jsme nejprve využili transgenní mouchy VT23256-GAL4, ve kterých je GAL4 řízen sekvencí 853 bp z prvního intronu uex (Kvon et al., 2014). VT23256-řízený UAS-EGFP odhalil omezenou expresi v ab KC s obzvláště silnou značkou v ab core (abc) neuronech (obrázek 3A). Také jsme použili CRISPR k vložení C-terminální značky HA-epitopu do otevřeného čtecího rámce uex (obrázek 3 – příloha k obrázku 1A). Tyto mouchy byly životaschopné jako homozygoti, což ukazuje, že výsledný fúzní protein UEX::HA si zachovává funkci. Imunobarvící mouchy obsahující tento lokus uex::HA s protilátkou anti-HA odhalily výrazné značení všech hlavních tříd KC v MB, navíc k nižší expresi v mozku (obrázek 3B). Tento profil exprese uex je také podporován jednobuněčnými sekvenačními analýzami (obrázek 3 – příloha k obrázku 1B; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018). S ohledem na zavedenou roli ab KC v čichovém LTM (Pascual a Pre'at, 2001; Yu a kol., 2006; Krashes a kol., 2007; Krashes a Waddell, 2008), jsme usoudili, že mnemotechnická role pro UEX může zahrnovat výraz v KCs.

Dále jsme použili GAL4-řízenou expresi RNAi k testování, zda 24 hodinPaměťpožadovaný výkon uex v MB. Mouchy exprimující uexRNAi (Perkins et al., 2015) ve všech ab KC (c739-GAL4; Yang et al., 1995; Perisse et al., 2013) nebo pouze v abc KC (NP7175- GAL4; Tanaka et al., 2008) vykazovaly normální okamžitéPaměťale významně narušenou 24hodinovou paměť (obrázek 3C). Naproti tomu exprese uexRNAi v povrchu ab (abs, 0770-GAL4; Parisse et al., 2013) nebo a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes et al., 2007) významně nezměnily okamžitý výkon ani výkon LTM. Normální apetit 24 hodinPaměťvýkon je proto zvláště citlivý na expresi uex v neuronech abc. Abychom snížili pravděpodobnost, že porucha paměti spojená s uexRNAi je důsledkem vývojového důsledku, také jsme omezili expresi UAS-uexRNAi na dospělost pomocí GAL80ts-zprostředkované časové kontroly (McGuire et al., 2003). Při permisivní teplotě 18˚C se GAL80ts váže na GAL4 a potlačuje jeho funkci transkripčního aktivátoru. Při restriktivní teplotě 30 °C se GAL80ts již nemůže vázat na GAL4, což uvolňuje GAL4 pro přímou expresi UAS-uexRNAi transgenu. Mouchy byly vychovány vývojem při 18 °C a po ekloze se přesunuly na 30 °C. Omezení exprese UAS-uexRNAi na ab KCs u dospělých much pomocí c739-GAL4 s GAL80ts poskytlo podobnou 24hodinovou specificituPaměťdefekt k tomu, který byl pozorován, když byl UAS-uexRNAi exprimován bez časové kontroly (obrázek 3D–F). Hodnotili jsme účinnost knockdownu UAS-uexRNAi pomocí našeho označeného lokusu uex::HA. Mozky heterozygotních mušek uex::HA exprimujících uexRNAi v ab a g KC s MB247-GAL4 (Zars et al., 2000) byly imunobarveny pomocí anti-HA protilátky. Porovnání intenzity imunoznačení v mozcích z uex::HA; MB247-GAL4/uexRNAi letí s tím z uex::HA; MB247-GAL4/ plus mouchy ukázaly, že exprese uexRNAi významně snížila signál anti-HA v ab a g KC (obrázek 3G a H). Tento výsledek demonstruje účinnost transgenu uexRNAi a užitečnost lokusu uex::HA upraveného CRISPR/Cas9.

Dále jsme testovali, zda exprese ve specifických KC transgenu UAS-uex může obnovit 24 hodinPaměťkapacita do uexMI01943 létá.Paměťvýkonnost mušek uexMI{{10}}1943 vyjadřujících UAS-uex v ab a g KC (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) nebo pouze ab KCs (c{{5 }}GAL4) byl významně lepší než u much uexMI01943 a byl statisticky nerozeznatelný od kontroly s neporušeným lokusem uex (obrázek 4A). Naproti tomu exprese UAS-uex v a0b0, abc nebo abs KC se neobnovilaPaměťvýkonnost mouchám uexMI01943 a nadměrná exprese uex v ab KC much divokého typu nezvýšila 24hodinovou paměť (obrázek 4A a B). Normální 24 hodPaměťvýkonnost by mohla být také obnovena pro mouchy uexMI01943, pokud byla exprese UAS-uex omezena na neurony c739-GAL4 (všechny ab KC) v dospělosti pomocí GAL80ts zprostředkované časové kontroly (obrázek 4C a D). Tyto experimenty se ztrátou funkce RNAi a obnovy společně prokázaly, že UEX hraje důležitou roli u dospělých

Obrázek 3. Snížení exprese uex v buňkách ab Kenyon (KCs) narušuje LTM. (A) Fragment promotoru uex-GAL4 řídí expresi GFP v abc KC. Anti-GFP imunoznačený uex-GAL4 (VT23256); Linka UAS-EGFP. (B) Anti-HA imunobarvení mozků obsahujících CRISPR/Cas9-editovaný lokus uex::HA

vykazuje silné značení UEX ve všech hlavních pododděleních těla houby (MB). Měřítko 20 mm. (C) RNAi knockdown uex ve všech ab (c739- GAL4) nebo pouze abc (NP7175-GAL4) KC specificky narušených 24 hodinPaměť. abs ({{0}}GAL4) nebo a0 b0 (c305a-GAL4) KC výraz neměl žádný účinek (p<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 pro okamžité a n=8–14 pro 24 hodinPaměť). (D) Defektní LTM byla pozorována, pokud byla exprese uexRNAi omezena na ab KC dospělých much pomocí GAL80ts-zprostředkované časové kontroly. (E) Výkon LTM nebyl ovlivněn, pokud byla uexRNAi po celou dobu udržována potlačená a (F) Výkon LTM byl obnoven na normální úroveň, pokud byla exprese uexRNAi znovu potlačena na 3 dny (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Dodatek k obrázku 1. Konstrukční schéma pro křivku uex::HA a grafy tSNE exprese uex.

ab KCs. Zjištění, že knockdown abc RNAi uex produkuje aPaměťdefekt (obrázek 3C), ale exprese UAS-uex v abc nezachrání mutantní defekt uexMI01943 (obrázek 4A) naznačuje, že funkce UEX v abc KC je nezbytná pro apetitivní LTM, zatímco abc i abs KC musí mít funkční UEX, aby podporovaly LTM. Schopnost UAS-uex obnovit výkon na mouchy uexMI0194 navíc poskytuje další podporu, že uex je zodpovědný zaPaměťzhoršení mouchy uexMI01943.

uex výraz v MB podporuje Mg2 plus -enhancedPaměť

Dále jsme zkoumali, zda by se Mg2 plus krmení (4 dny s 80 mM MgCl2) mohlo zlepšitPaměťvýkon u mušek s narušenou funkcí uex. Mouchy nesoucí alelu uexMI01943 (obrázek 4F) nebo ty, které exprimují UAS-uexRNAi v ab KC s c739-GAL4 (obrázek 4E), nevykazovaly zvýšenouPaměťpři krmení 80 mM MgCl2 ve srovnání s mouchami krmenými 1 mM MgCl2. Kromě toho byla Mg2 plus-vylepšená paměť obnovena u mušek mutantů uexMI01943, když byla exprese uex obnovena do ab KCs (obrázek 4F). Všechny kontrolní mouchy (c739-GAL4, UAS-uexRNAi a UAS-uex) s nerušenou expresí uex vykazovaly výrazně lepšíPaměťpři podávání 80 mM ve srovnání s 1 mM MgCl2. Nadměrná exprese UAS-uex v ab KC s c739-GAL4 u much s genetickým pozadím divokého typu ani vylepšeným pravidelným 24hodinovýmPaměť(obrázek 4B), nebo u much krmených po dobu 4 dnů 40 nebo 80 mM MgCl2 (obrázek 4G). Také jsme testovali, zda 4 dny suplementace 80 mM MgCl2 zlepšily 24hodinový paměťový výkon po averzivním rozloženém tréninku. Znovu,Paměťmutantní mouchy divokého typu, ale ne uexMI01943, vykazovaly zlepšení (obrázek 4 – příloha k obrázku 1). Tyto výsledky společně ukazují, že optimálníPaměťvylepšení pomocí Mg2 plus krmení vyžaduje a může být plně podporováno funkcí UEX v ab KC.

UEX je funkčně konzervovaný transportér hořčíku

Vzhledem k silné konzervaci sekvence UEX se savčím CNNM2/4 jsme testovali, zda CNNM2 může funkčně nahradit UEX a obnovit LTM defekt mušek uexMI01943. Několik bodových mutací v CNNM2 bylo identifikováno u lidských pacientů s hypomagnezémií, která je spojena s malformací mozku a intelektuálním postižením (Arjona et al., 2014). Zavedení ekvivalentních mutací do myšího CNNM2 (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W a CNNM2E122K) ukázalo, že tyto léze odvozené od pacienta zhoršují transport hořčíku (Arjona et al., 2014). Zkonstruovali jsme mouchy nesoucí transgeny divokého typu a tuto mutantní variantu UAS-CNNM2 (obrázek 5A). Barvení na asociovaný C-terminální HA-tag odhalilo jasnou expresi všech variant UAS-CNNM2::HA v ab neuronech, když byly řízeny c739-GAL4 (obrázek 5 – příloha k obrázku 1). Avšak pouze exprese divokého typu CNNM2, a nikoli bodově mutantních forem, v ab KC uexMI01943

mutantní mouchy obnoveny 24 hodinPaměťvýkon (obrázek 5B).

Také jsme testovali, zda UEX může zprostředkovat vytlačování Mg2 plus. UEX exprimovaný v buňkách HEK293 lokalizovaných na plazmatické membráně a buňkách naložených s Mg2 plus a Mg2 plus indikátor Magnesium Green vykazoval rychlý Mg2 plus eflux (obrázek 5 – obrázek doplněk 2 a video 1), ve srovnání s buňkami transfekovanými prázdným vektorem. Extruze Mg2 plus řízená UEX byla znatelně méně účinná než v buňkách exprimujících lidský CNNM4 (obrázek 5 – doplněk k obrázku 2), o kterém je známo, že má podobnou účinnost jako CNNM2 (Hirata et al., 2014). Nevíme však, zda je výraz UEX a CNNM4 ekvivalentní. Nicméně demonstrace mezidruhové komplementace a Mg2 plus efluxní aktivity definuje UEX jako funkční homolog savčího CNNM2/4.

Obrázek 4. Záchrana defektu LTM u mušek uexMI01943. Obnovení exprese UAS-uex v ab a g (MB247-GAL4) nebo ab Kenyonových buňkách (KCs) zachráněných 24 hodinPaměťvýkon uexMI01943 létá, zatímco výraz v abc, abs nebo a0 b0 KCs nikoli (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">Paměťvýkonnost u much divokého typu (ANOVA, n=8–12). (C) Defektní LTM byl zachráněn, pokud byla exprese UAS-uex omezena na ab KC dospělých much pomocí GAL80ts zprostředkované časové kontroly (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

po dobu 24 hodPaměť), ale (D) zůstalo vadné, pokud nebyla uvolněna exprese UAS-uex. (E)Paměťvylepšení pomocí dietního Mg2 plus je podporováno UEX v ab KC. Paměť much exprimujících UAS-uexRNAi v ab KC nemůže být vylepšena krmením Mg2 plus (t-test, n=8). (F) Paměť mutantních much uexMI01943 nelze zlepšit krmením Mg2 plus, ale vylepšení bylo obnoveno expresí UAS-uex v ab KC (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Paměťbyla zvýšena, pokud byly mouchy krmeny 80 mM MgCl2, ale ne suboptimálním 40 mM MgCl2 (p<0.05, anova,="" n="">

Online verze tohoto článku obsahuje následující dodatky k obrázku 4:

Dodatek k obrázku 1. Mg2 plus krmení vylepšené LTM po averzivním rozloženém tréninku u mutantních mušek divokého typu, ale ne uexMI01943.

Je vyžadována intaktní doména CNBHPaměť

Vzhledem k zavedené roli pro signalizaci cAMP vPaměť-příslušná plasticita u bezobratlých a savců (Kandel, 2012), testovali jsme důležitost domény CNBH v UEX. Zkonstruovali jsme mouchy nesoucí bodově mutovaný transgen CNBH UAS-uexR622K (Obrázek 6A). Ekvivalentní substituce aminokyseliny R622K ruší vazbu cAMP v regulační podjednotce cAMP-dependentní proteinkinázy, PKA (Bubis a kol., 1988). Exprese UAS-uexR622K v ab neuronech pomocí c739-GAL4 neobnovila 24hodinový výkon paměti ani nezměnila okamžitouPaměťvýkon mutantních mušek uexMI01943 (Obrázek 6B).

Také jsme použili CRISPR k pokusu zavést mutaci R622K do CNBH nativního lokusu uex (Bassett a kol., 2013; Gratz a kol., 2013; Yu a kol., 2013). Neočekávaně tento přístup nezavedl substituci R622K, ale místo toho nahradil T626 v CNBH s NRR. Naštěstí mouchy homozygotní pro tuto alelu uexT626NRR byly životaschopné jako dospělí, na rozdíl od těch homozygotních pro uexD, což naznačuje, že UEX kódovaný uexT626NRR si zachovává funkci. Nicméně mouchy homozygotní pro uexT626NRR nebo heterozygotní mouchy uexT626NRR/uexMI01943 vykazovaly silné 24hPaměťdefekt (Obrázek 6C). BezprostředníPaměťbyl také narušen u homozygotních mušek uexT626NRR, na rozdíl od much nesoucích všechny ostatní kombinace alel uex. Kromě toho,Paměťmušek uexT626NRR nebylo možné vylepšit krmením Mg2 plus (Obrázek 6D). Mutace uexT626NRR tedy odděluje to podstatné

Obrázek 5. uex kóduje evolučně konzervovaný transportér Mg2 plus. (A) Model struktury proteinu CNNM2 vykazující klinicky relevantní bodové mutace.

Upraveno a upraveno podle Arjona et al., 2014. (B) Nadměrná exprese divokého typu, ale ne mutantního, CNNM2 v ab Kenyonových buňkách zachraňujePaměťdefekt mutantních mušek uexMI01943 (str<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Online verze tohoto článku obsahuje následující dodatky k obrázku 5:

Dodatek k obrázku 1. Transgenní exprese mutantních variant CNNM2.

Dodatek k obrázku 2. UEX-dependentní Mg2 plus eflux v buňkách HEK293.

role pro uex z funkce vPaměťa naznačuje, že aktivita regulovaná cyklickými nukleotidy je kritická pro UEX pro podporu normálního a Mg2 plus - zvýšenéhoPaměť. Ačkoli jsme pomocí western blotu potvrdili, že protein plné délky je exprimován v muškách uexT622NRR (obrázek 6E), naše protilátka nám neumožnila ověřit, že se protein UEXT626NRR vhodně lokalizuje v mozku. Je proto zapotřebí další práce, aby bylo možné charakterizovat buněčnou lokalizaci, vazbu cAMP a transportní funkci Mg2 plus proteinu kódovaného touto náhodnou alelou uexT626NRR.

Chronická manipulace s cAMP mění lokalizaci UEX v KC

Testovali jsme, zda cAMP může akutně změnit aktivitu UEX aplikací forskolinu na buňky HEK293 exprimující UEX. Nebyla však pozorována žádná zjevná změna v dynamice Mg2 plus eflux závislé na UEX (data nejsou uvedena). Proto jsme testovali, zda byla exprese KC UEX::HA změněna u much s chronickými změnami

metabolismus cAMP zavedením mutací relevantních pro učení v rutabaga-kódované Ca2 plus - stimulované adenylátcykláze nebo dunce-kódované cAMP-specifické fosfodiesteráze. Anti-HA imunobarvení mozků z rut2080; uex::HA a dnc1; uex::HA mouchy odhalily výraznou změnu v lokalizaci UEX (obrázek 7A a B a videa 2–4). Zatímco UEX::HA je obvykle detekován v lalocích všech KC na zhruba ekvivalentní úrovni u much divokého typu, značení bylo nižší v laloku MB g a výraznější v abc KC na pozadí mutantů rut2080 a dnc1 (obrázek 7C) i když celková MB exprese UEX::HA je podobná u much divokého typu a mutantů (obrázek 7D). Kromě toho analýzy western blotu proteinu extrahovaného z hlav těchto much neodhalily významný rozdíl v celkových hladinách exprese UEX::HA (data nejsou uvedena). Tato data jsou proto v souladu s funkcí UEX regulující cAMP a možná její buněčnou lokalizací v KC.

UEX je vyžadován k udržení kolísavého [Mg2 plus ]i v ab KC

Přestože MagFRET může hlásit [Mg2 plus ], nereaguje dostatečně rychle, aby zaznamenal signály vyvolané stimulem. Proto jsme zkonstruovali mouchy obsahující UAS-transgeny pro dva novější geneticky kódované Mg2 plus senzory, MagIC (non-FRET based; Koldenkova et al., 2015) a MARIO (FRET based; Maeshima et al., 2018). Nebyli jsme schopni detekovat expresi UAS-MARIO v mozku mouchy, a proto jsme mohli použít pouze UAS-MagIC. Bylo popsáno, že MagIC reaguje nejsilněji na Mg2 plus, ale také v menší míře na Ca2 plus (Koldenkova et al., 2015). Nejprve jsme proto ověřili specifičnost MagIC odpovědí v buněčném permeabilizovaném ex vivo preparátu mozku mouchy. Muchám exprimujícím UAS-MagIC v ab KC s c739-GAL4 (obrázek 8A) byly odebrány mozky, inkubovány v misce s fyziologickým roztokem (Barnstedt et al., 2016) a byly sledovány změny fluorescence před a po koupelové aplikaci - chemické látky. Zatímco aplikace MgCl2 vyvolala na dávce závislé zvýšení odpovědi MagIC, chelace Mg2 plus s EDTA vyvolala pokles závislý na dávce (obrázek 8B a videa 5 a 6). Pro srovnání CaCl2 zaznamenal pouze mírné zvýšení při nejvyšších koncentracích, zatímco více Ca2 plus selektivní chelátor EGTA měl malý účinek (obrázek 8B). Tyto výsledky ukazují, že UAS-MagIC může monitorovat [Mg2 plus ]i v ab KC v mozku mouchy.

Ukázalo se, že zvyšující se intracelulární cAMP vyvolává tok Mg2 plus ze savčích buněk (Romani a Scarpa, 2000; Vormann a Gunther, 1987; Jakob a kol., 1989; Romani a Scarpa, 1990b; Romani a Scarpa, 1990a; Gu¨nther, 1987; Gu¨nther a kol., 1990; Howarth a kol., 1994). Protože naše experimenty také ukázaly, že cAMP může regulovat UEX, dále jsme testovali, zda stimulace syntézy cAMP forskolinem (FSK) může změnit signály MagIC v ab.

Obrázek 6. Pro paměť je vyžadována doména cyklické nukleotidové vazby homologie (CNBH) UEX. (A) Schéma ukazující detail sekvence domény CNBH v UEX a změny aminokyselin provedené v uexR622K a uexT626NRR. (B) Exprese transgenu UAS-uexR622K v buňkách ab Kenyon nezachránila defekt LTM mutantních much uexMI01943 (str.<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Obrázek 6 pokračoval

(D) Dietní Mg2 plus nezlepšilo paměť homozygotních much uexT626NRR/uexT626NRR (p<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KCs. Pro tyto experimenty jsme opět použili ex vivo preparát mozku, ale tentokrát nebyly buňky permeabilizovány. Ukázalo se, že 30 mM FSK vyvolává maximální zvýšení cAMP v KC, které se blíží tomu, který byl pozorován po apetitivním kondicionování (Louis et al., 2018). Aplikace 30 mM FSK na c739-GAL4; Mozky UAS-MagIC vyvolaly konzistentní dynamiku fluorescence MagIC. Po prudkém počátečním vzestupu odezvy pomalu klesaly zpět k základní linii a poté opět pomalu stoupaly do bodu, kdy signál začal kolísat. (Obrázek 8C a D a Video 7). Klíčové znaky této odpovědi byly zaznamenány pouze v signálu Venuše citlivém na Mg2 plus (obrázek 8D). Naproti tomu fluorescence mCherry nekolísala, ale neustále klesala v průběhu časového průběhu záznamu (pravděpodobně v důsledku vyblednutí světlem), což dokazuje, že fluktuace signálu Venuše není pohybovým artefaktem (obrázek 8E). Důležité je, že FSK indukované MagIC reakce byly větší než ty po aplikaci fyziologického roztoku (obrázek 8 – obrázek doplněk 1A). Kolísavá odpověď se však vyvinula také po aplikacích fyziologického roztoku (obrázek 8 – příloha k obrázku 1B), což naznačuje, že rytmický signál MagIC může být obecnou odpovědí na zvýšení [Mg2 plus]i, které následuje po buněčné perturbaci.

Již dříve bylo hlášeno, že Drosophila MB vykazuje pomalou (0.004 Hz) Ca2 plus oscilaci v ex vivo mozcích, zatímco mnohem rychlejší 20 Hz oscilaci vyvolávají pachy u kobylky MB (Laurent a Naraghi, 1994; Rosay a kol., 2001). Ačkoli naše počáteční charakterizace MagIC v mozku mouchy naznačovala preferenční odpověď na Mg2 plus (obrázek 8B), přesto jsme explicitně testovali, zda FSK indukuje fluktuaci [Ca2 plus]i ab KC, pomocí exprese UAS-GCaMP6f (Chen et al., 2013). FSK vyvolal opožděné zvýšení odpovědi GCaMP, ale nebyla pozorována žádná jasná oscilační aktivita (obrázek 8 – příloha k obrázku 1C–E).

Nakonec jsme testovali, zda pozorované reakce MagIC byly citlivé na stav genu uex. Vygenerovali jsme mouchy uexMI01943, které také skrývaly c379-GAL4 a UAS-MagIC, a porovnali jsme jejich FSK a fyziologickým roztokem indukované MagIC odpovědi s odpověďmi much s lokusem uex divokého typu. Mutované mouchy uexMI01943 vykazovaly zvýšenou reakci FSK na reakci much divokého typu, zatímco reakce vyvolané fyziologickým roztokem byly nerozlišitelné (obrázek 8F a G). Odezvy vyvolané neaktivním analogem FSK, ddFSK, byly také necitlivé na stav uex (obrázek 8 – příloha k obrázku 1F). Mutace uex proto selektivně zvyšuje střední FSK-evokované MagIC odpovědi.

Také jsme si všimli, že stopy MagIC z mušek mutantů uex nevykazovaly kolísavý signál (obrázek 8H a obrázek 8 – doplněk obrázku 1G). Abychom tento rozdíl kvantifikovali, vypočítali jsme střední výkonovou spektrální hustotu (PSD) stop z uexMI01943 a much divokého typu ošetřených FSK nebo fyziologickým roztokem. V obou podmínkách byla střední hodnota PSD významně posunuta doleva směrem k nižším frekvencím u mutantů uexMI01943 ve srovnání s kontrolami divokého typu (obrázek 8I). Mozky much divokého typu měly podstatně větší oscilační aktivitu soustředěnou kolem 0,015 Hz než mozky mutantů uexMI01943. Tyto údaje proto naznačují, že UEX je vyžadován pro pomalé rytmické udržování KC [Mg2 plus ]i. Důležité je, že zjištění, že signály MagIC jsou zvýšené a změněné u mutantů uex, potvrzuje, že pozorované reakce MagIC jsou závislé na Mg2 plus. Navíc naznačují, že KC vyjadřoval limity UEX Mg2 plus akumulaci, což je v souladu s úlohou při vytlačování.

Diskuse

Pozorovali jsme zlepšení čichového výkonu LTM, když byly mouchy krmeny 4 dny před tréninkem potravou doplněnou 80 mM [Mg2 plus ]. Tento výsledek se podobá výsledku hlášenému u potkanů, i když ke zvýšení mozku [Mg2 plus ] na úrovně zlepšující paměť byly zapotřebí delší doby krmení (Slutsky et al., 2010). Rozdíl v optimální době krmení může odrážet velikost zvířete a možná větší biologickou dostupnost Mg2 plus v potravě u Drosophila. Zatímco Mg2 plus -L-threonát (MgT) byl u potkanů ​​účinnějším prostředkem pro dodávání Mg2 plus než chlorid hořečnatý (Slutsky et al., 2010), pozorovali jsme podobné zlepšení výkonnosti paměti, když byly mouchy krmeny chloridem hořečnatým. síran hořečnatý nebo MgT (data nejsou uvedena).

Obrázek 7. Exprese uex Kenyonových buněk (KC) je změněna u mušek rutabaga a dunce mutant. (A) Mozky obarvené anti-HA odhalily, že lokalizace proteinu UEX::HA je změněna v rut2080; uex::HA a dnc1; uex::HA létá, stává se výraznějším v abc KC (šipky). Měřítko 20 mm. (B) Zvětšené obrázky těl hub (MBs) zvýrazňující expresi abc KC u mušek rut2080 a dnc1 ve srovnání s mouchami uex::HA divokého typu. Měřítko 20 mm. (C) Kvantifikace intenzity fluorescence. Vlevo, mikrofotografie s čárou měření procházející špičkou laloku a obdélníkovými oblastmi zájmu pro lalok g a kontrolní oblast. Střední profily relativní intenzity fluorescence napříč špičkou laloku ukazují významně vyšší signál u mušek s mutanty rut2080 a dnc1 ve středové oblasti obsazené KCs jádra ab (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

Zvýšení [Mg2 plus ]e v mozku potkana vede ke kompenzační upregulaci exprese NR2B podjednotky NMDAR, a tedy ke zvýšení podílu postsynaptických NMDAR obsahujících NR2B. Tato třída NMDAR má delší otevírací dobu (Chen et al., 1999; Erreger et al., 2005), což naznačuje, že tento přepínač ve složení podjednotek představuje mechanismus homeostatické plasticity (Turrigiano, 2008), aby se přizpůsobil zvýšenému bloku NMDAR vyvolanému zvýšení [Mg2 plus ]e. Navíc nadměrná exprese NR2B v předním mozku myši může zlepšit synaptickou facilitaci a učení aPaměťvýkonnost (Tang et al., 1999), což podporuje zvýšení NR2B, které je důležitým faktorem pro zvýšení Mg2 plusPaměť. Avšak i v původní in vitro studii synaptické plasticity se zvýšenou Mg2 plus (Slutsky et al., 2004) bylo zaznamenáno, že proudy NMDAR nebyly dostatečné k úplnému vysvětlení pozorovaných změn.

Naše studie ztráty funkce podjednotky NMDAR u Drosophila KC nezhoršily pravidelné nebo Mg2 plus zvýšenéPaměť. Dále jsme nezjistili zjevnou změnu v hladinách exprese podjednotek glutamátového receptoru v celém mozku u much krmených Mg2 plus. Ačkoli aktivita NMDAR byla již dříve zapojena do čichu DrosophilaPaměťúčinky byly většinou připisovány funkci mimo MB (Xia et al., 2005; Wu et al., 2007). Navíc nadměrná exprese Nmdar1 ve všech neuronech, nebo konkrétně ve všech KC, nezměnila STM nebo LTM. Ektopická nadměrná exprese v MB verze NMDARN631Q, která nemůže být blokována Mg2 plus, narušila LTM (Miyashita et al., 2012). Tato mutace však umožňuje vstup Ca2 plus řízený ligandem, bez potřeby korelované neuronální depolarizace, která může narušit funkci KC neočekávaným způsobem. Asi nejpozoruhodnější je, že synaptickou depresi relevantní pro učení v MB lze řídit dopaminergními vyučovacími signály dodávanými do cholinergních výstupních synapsí z KC reagujících na zápach do specifických MBON (Claridge-Chang et al., 2009; Aso et al., 2012 Burke a kol., 2012; Liu a kol., 2012; Owald a kol., 2015; Hige a kol., 2015; Barnstedt a kol., 2016; Parisse a kol., 2016; Aso a kol., 2014; Owald a Waddell, 2015; Handler a kol., 2019). Je možné, že KC přijímají glutamát ze zdroje, který dosud nebyl identifikován, ale v současné době není v síti MB zjevné místo pro plasticitu závislou na NMDAR. Důkazy proto naznačují, že normální a Mg2 plus-enhanced Drosophila LTM je nezávislý na signalizaci NMDAR v KC. Kromě toho naše měření MagFRET ukazují, že Mg2 plus krmení také zvyšuje [Mg2 plus ]i ab KCs přibližně

přibližně 50 mM.

Identifikovali jsme roli uex, ortologu jediné mušky evolučně konzervované rodiny CNNM-typu Mg2 plus efluxních transportérů (Ishii et al., 2016). Existují čtyři odlišné geny CNNM u myší a lidí, pět u C. elegans a dva u zebřičky (Ishii et al., 2016; Arjona et al., 2013). Lokus uex produkuje čtyři alternativně sestřižené transkripty mRNA, ale všechny kódují stejný protein 834 aa. Přesná role proteinů CNNM v transportu Mg2 plus je poněkud sporná (Funato et al., 2018a; Arjona a de Baaij, 2018; Funato et al., 2018b; Gime'nez-Mascarell et al., 2019). Někteří navrhují, že proteiny CNNM jsou přímými transportéry Mg2 plus, zatímco jiní upřednostňují, aby fungovaly jako senzory intracelulární koncentrace Mg2 plus [Mg2 plus]i a/nebo regulátory jiných transportérů Mg2 plus. Zjistili jsme, že ektopická exprese Drosophila UEX zvyšuje Mg2 plus eflux v HEK293 buňkách a že endogenní UEX omezuje [Mg2 plus ]i v ab KC v mozku mouchy. Pokud tedy UEX sám není transportérem Mg2 plus, musí jím být

schopné účinně interagovat s lidskými transportéry Mg2 plus eflux a ovlivňovat extruzi Mg2 plus u Drosophila. Protože UEX je jediným proteinem CNNM v mouše, může plnit všechny role čtyř jednotlivých savců CNNM. Nicméně schopnost myši CNNM2 obnovitPaměťschopnost uex mutant mouchy naznačuje, žePaměť-příslušná funkce UEX může být nahrazena funkcí CNNM2.

Je zajímavé, že žádná z pro onemocnění relevantních variant CNNM2 nebyla schopna doplnitPaměťvada mušek mutantů uex. Varianta CNNM2 T568I substituuje jednu aminokyselinu ve druhé doméně CBS (Arjona et al., 2014). Onkogenní protein tyrosin fosfatázy z rodiny PRL (fosfatáza regenerujících jater) se váží na CBS domény CNNM2 a CNNM3 a mohou inhibovat jejich transportní funkci Mg2 plus (Hardy et al., 2015; Gime'nez-Mascarell et al., 2017 Zhang a kol., 2017). Bude proto zajímavé otestovat roli domén UEX CBS a to, zda fly PRL-1 reguluje aktivitu UEX.

Analýza RNA-seq ukazuje, že uex je silně exprimován v trávicím traktu larev a dospělých much a v nervovém systému, stejně jako ve vaječnících (Gelbart a Emmert, 2010; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018), což naznačuje, že mnoho uex mutací bude pleiotropních. Naše alela uexD, která odstraňuje 272 aminokyselin (včetně části druhé CBS a celé domény CNBH) z C-konce UEX, má za následek vývojovou letalitu, když je homozygotní, což dokazuje, že uex je esenciální gen. Savčí CNNM4 je lokalizován na bazolaterální membráně střevních epiteliálních buněk (Yamazaki et al., 2013). Tam se předpokládá, že funguje při transcelulárním transportu Mg2 plus výměnou intracelulárního Mg2 plus za extracelulární Na plus po apikálním vstupu přes kanály TRPM7. Letalita u Drosophila by proto mohla vzniknout z neschopnosti absorbovat dostatečné množství Mg2 plus přes střevo larev. Neuronově omezená exprese uexRNAi s elav-GAL4 však také vede k larvální letalitě (data nejsou uvedena), což naznačuje, že UEX má další roli v raném vývoji nervového systému, jako je CNNM2 u lidí a zebrafish (Arjona et al., 2014; Accogli a kol., 2019). Možná překvapivě, mouchy nesoucí homozygotní nebo transheterozygotní kombinace několika hypomorfních alel uex mají defektní apetitivní a averzivníPaměťvýkon, přesto se zdají jinak nedotčené.

Genetická úprava lokusu uex k přidání C-terminální značky HA k proteinu UEX nám umožnila lokalizovat jeho expresi v mozku. Označování je zvláště prominentní ve všech hlavních třídách KC. Omezení knockdown exprese uex na všechny ab KC dospělých much, nebo dokonce jen na podmnožinu abc, reprodukovalo defekt LTM. Poškození LTM bylo evidentní, pokud exprese uexRNAi v neuronech ab

Obrázek 8. UEX omezuje nárůst [Mg2 plus ]i a podporuje pomalou oscilaci v ab Kenyonových buňkách (KC). (A) Explantovaný mozek mouchy exprimující UAS-MagIC řízený c739-GAL4. Horní panel, širokoúhlý fázový kontrast; střední panely, fluorescenční pohledy na Venuši a kanály mCherry; spodní panel, konfokální řez na úrovni somat KC ukazující kanály Venuše a mCherry. Měřítko 20 mm. (B) MagIC selektivně reaguje na změny [Mg2 plus ]i v KC. Stopy poměru MagIC po aplikaci lázně 10, 20 nebo 40 mM MgCl2 nebo CaCl2; 5, 10 nebo 20 mM EDTA nebo EGTA. (C) Reprezentativní křivka z obrázku 8 pokračování na další - obrázek 8 pokračování

Poměr MagIC po aplikaci FSK ukazuje počáteční vlnu následovanou postupným vzestupem a rozvojem pomalé oscilace. (D) Primární odezvy vyplývají ze změn signálu Venuše citlivého na Mg2 plus. (E) Signál mCherry vykazuje stálý pokles. (F) FSK-evokované MagIC reakce jsou větší u mušek mutantů uex. Průměrné odezvy MagIC ukazují, že FSK indukoval významně větší nárůst mutantu uexMI01943 než u much divokého typu. (G). Průměrné reakce MagIC vyvolané fyziologickým roztokem nebyly významně změněny u mušek mutantů uex. (H) Jednotlivé stopy Venušina (zelená) a mCherry (červená) kanálů ukazují, že pomalá oscilace je patrná pouze ve Venušině kanálu u much divokého typu, ale ne uex mutantů. (I) Analýza výkonové spektrální hustoty (PSD) časových řad od 200 do 900 s všech dat ukazuje, že stopy od much divokého typu mají výrazně větší oscilační aktivitu, soustředěnou kolem 0,015 Hz, než stopy od much mutantů uex.

Online verze tohoto článku obsahuje následující dodatky k obrázku 8:

Doplněk obrázku 1. Jednotlivé stopy pro zobrazování MagIC a GCaMP.