Část 2: Integrovaná síť farmakologie a model zebřičky pro zkoumání složek Cistanche Tubulosa s dvojím účinkem pro léčbu osteoporózy i Alzheimerovy choroby
Mar 30, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
KLIKNĚTE ZDE PRO ČÁST 1
3. Výsledky
3.1 Kandidátské sloučeniny a Popotenciální cíle
Při výzkumu chemických složek CT bylo z TCMSP získáno celkem 75 přísad. Poté byla provedena PCA pro vizualizaci chemické distribuce CT. Jak ukazuje obrázek 1, složky CT byly v chemickém prostoru rozmanité a 28 z nich splňovalo Lipinského pravidlo pěti (Lipinski, 2003). Zajímavé je, že mezi složkami CT a schválenými malomolekulárními léky pro OP/AD bylo mnoho překrývajících se částí. Ukázalo se, že mnoho sloučenin v CT mělo potenciální lékovou účinnost na OP/AD. K dalšímu hodnocení jejich léčivosti bylo 43 sloučenin testováno pomocí DL. Po predikci cílů bylo vybráno 26 kandidátních sloučenin pro následnou analýzu. A mohou být doplněny celkem 847 cílovými proteiny.
cistamchemá účinek proti Alzheimerově chorobě.
Genové záznamy související s OP nebo AD byly shromážděny z databází DisGeNET a GeneCards. Výsledkem bylo, že bylo shromážděno 3052 a 8042 genových záznamů. Převzali jsme dvě skóre z databází DisGeNET a GeneCards jako hodnotící skóre, která prověřují horní pětinu cílů. O pětinovém poměru rozhodly předexperimenty. Poté bylo zachováno 211 společných cílů OP-ED, aby odpovídaly cílům 26 kandidátních sloučenin. Nakonec bylo vybráno celkem 81 proteinových cílů (doplňková tabulka S2) spojených s 22 kandidátními sloučeninami (doplňková tabulka S3) pro analýzu molekulárních mechanismů účinku, čímž se vytvořila síť interakce protein-protein (PPI) zobrazená na obrázku 2.
22 sloučenin bylo rozděleno do 11 kategorií: 5 fenylethanoidových glykosidů (PhGs) (Decaffeoylacteosid, Cistanoside E atd.), 3 fenylakrylové oligosacharidy (Cistanoside H, Cistanoside F atd.), 3 iridoidy a iridoidní leurisidové glykosidy, Genposidové kyseliny atd.), 3 lignany a lignanové glykosidy (Yangambin, ( plus )-Pinoresinol-O- -D-glukopyranosid atd.), 2 flavonoidy (kvercetin, genistein), 1 alkaloid, 1 terpen, 1 sterol, 1 mastný alkohol, 1 mastná kyselina a další. Podle předchozích zpráv jsou tyto sloučeniny hlavními složkami nebo aktivními funkčními složkami CT (Fu et al., 2018).
Na obrázku 2 bylo zjištěno, že celkem 81 společných cílů má korelace s OP a AD. Stupeň PPI byl přijat jako charakteristický parametr pro definování významnosti potenciálních cílů. Top 5 předpokládaných cílových proteinů spojených s OP a AD byly albumin (ALB), inzulín (INS), interleukin 6 (IL6), TNF-alfa (TNF) a epidermální růstový faktor (EGF).
Obrázek 1.Chemická distribuce založená na analýze hlavních složek (PCA).
3.2 Integrovaná a klasifikovaná síťová analýza
81 domnělých cílových proteinů v tabulce S2 bylo vybráno pro zahájení analýzy obohacení GO a KEGG dráhy. Po filtrování podle hodnoty p (mezní hodnota GO menší nebo rovno 0.05, hranice dráhy KEGG menší nebo rovno 0,01), 15 výrazů GO a 66 KEGG termíny dráhy byly vráceny, jak je znázorněno na obrázcích 3 a 4. Celkem je zahrnuto 16 termínů GO: 5 pro molekulární funkci, 5 pro biologické procesy a 6 pro buněčné složky. Protože tato studie byla zaměřena na odhalení potenciální společné patogeneze OP a AD, odstranili jsme termíny dráhy přímo související s jinými chorobami a zbytek jsme zařadili do různých funkčních kategorií. Naznačuje, že 22 aktivních složek CT může regulovat celkem 66 drah, které hlavně korelují s transdukcí signálu, endokrinním systémem, imunitním systémem, buněčným růstem a smrtí, aby hrály konfrontační roli proti OP a AD.
Pro odhalení rozdílů v působení různých typů sloučenin byla analyzována síť PPI vytvořená na obrázku 2 podle jejich kategorií v tabulce S3. Obrázek 5 ukazuje, že 5 PhG, 2 flavonoidy, 1 terpen a 1 sterol, zejména flavonoidy, mohou být důležitější než jiné složky CT proti OP a AD. Poté byly tyto 4 série aktivních sloučenin vybrány k odhalení jejich komprimovaných cest. Jak je vidět z obrázku 6, PhG, flavonoidy, terpeny a sterol pracovaly společně nebo samostatně na 27 drahách, které obsahují 11 modulů: buněčný růst a smrt, endokrinní systém, imunitní systém, přenos signálu, vývoj a další. Výsledky naznačují, že tyto sloučeniny mohou hrát synergickou roli v pozitivních účincích CT na OP a AD. Stojí za zmínku, že ochranné účinky PhGs by mohly být pozoruhodnější než flavonoidy u neurodegenerativních onemocnění, protože PhG měly přímé interakce s dráhou Alzheimerovy choroby, zatímco flavonoidy souvisely se signálními molekulami a interakcí. Pouze sterol a terpen souvisely s metabolismem lipidů a vylučovacím systémem. PhGs, terpeny a flavonoidy navíc ukázaly potenciální vztah k endokrinním a metabolickým onemocněním.
Podle ilustrace PPI byly 2 flavonoidy (GE, QU), 1 terpen (AA) a 1 sterol (BSS) přijaty jako cenné sloučeniny pro další výzkum molekulárních mechanismů. Je zajímavé, že jsme zjistili, že všechny jsou vzájemně propojeny se signální dráhou MAPK a signální dráhou TGF-beta. A p-hodnota těchto dvou cest byla také mnohem vyšší. Předpokládané cíle 4 cenných sloučenin a distribuce jejich ovlivněných proteinů ve dvou drahách byly demonstrovány na obrázku 7.
3.3 Validace účinnosti cenných sloučenin
V této síťové analýze stanovené v 3.2 jsme zachytili 4 cenné sloučeniny pro ověření farmakologické aktivity. Metodou topologicky strukturní analýzy v této studii jsme zjistili, že genistein (GE, C9, DL=0.21), kvercetin (QU, C11, DL=0.28), kyselina abietová (AA, C19, DL=0.28) a -sitosterol (BSS, C20, DL=0.21) ukázaly proveditelnou souhru proti OP a AD. V této části byly vytvořeny modely larev zebřičky in vivo indukované Pre nebo AlCl3 pro hodnocení ochranných účinků 4 sloučenin proti OP a AD.
3.3.1. Vliv 4 sloučenin na OP
Pro zjištění, zda 4 sloučeniny mají ochranné účinky proti OP, byl Pre vytvořen model OP zebrafish. Vývoj osteoblastů byl nejprve zkoumán barvením alizarinovou červení, aby se prozkoumaly přímé účinky 4 sloučenin na tvorbu kosti. Ve srovnání s kontrolní zebřičkou Pre zjevně vyvolal změnu morfologie kostí a hustoty kostí lebek zebřičky v modelové skupině (obrázek 8). Pokles barvicí plochy a IOD ve skupině Pre a opačný trend ve skupině Ed také vizuálně demonstrovaly úspěšnost OP modelu. A co víc, oblast barvení a 2 IOD lebek zebřičky ve skupinách BSS/GE/QU/AA byly významně zvýšeny ve srovnání s modelovou skupinou (obrázek 9). Byly testovány typické markery tvorby a resorpce kosti, jako je ALP a TRAP, aby se dále vyhodnotil antiosteoporózní účinek těchto 4 sloučenin. Jak je znázorněno na obrázku 10, Pre významně snížil aktivitu ALP a zvýšil aktivitu TRAP na rozdíl od kontrolní skupiny. Naopak sloučeniny Ed a 4 významně vykazovaly opačný trend než skupina Pre v ALP a TRAP aktivitách zebřičky. Tyto výsledky společně potvrdily, že BSS, QU, GE a AA mohou hrát pozitivní roli při tvorbě kostí u předem indukovaných OP zebrafish.
3.3.2. Účinek 4 sloučenin na AD
K vyhodnocení ochranných účinků 4 sloučenin proti AD byl použit dobře známý model zebřičky AD vyvolané AlCl{2}}. Pro tento model AD dyskineze byl analyzátor chování použit ke sledování pohybu zebřiček. Jak je znázorněno na obrázku 11, AS ve skupině AlCl3 byly významně nižší než u kontrolní skupiny, zatímco pro DPZ a všechny 4 sloučeniny byly AS blízko kontrole. DRR a RE byly uvedeny v tabulce S4. Výsledky ukázaly, že různé koncentrace GE, BSS, QU a AA zvýšily DRR o 2.{8}},64 procenta, 60.18-103,92 procenta, 70.{14 }},61 procenta , 2.37-42,64 procent , respektive s částečnou signifikantní (p-hodnota < 0.001-0,01).="" ∆ss="" v="" kontrolní="" skupině,="" skupině="" alcl3="" a="" skupině="" dpz="" dále="" podpořily,="" že="" konstrukce="" modelu="" ad="" byla="" úspěšná.="" re="" pro="" ge,="" bss,="" qu="" a="" aa="" byly="" 13.{25}},45="" procent,="" 11.41-63,09="" procent,="" 1.63-66,89="" procent,="" 13.{{34}="" },09="" procenta,="" resp.="" tyto="" výsledky="" s="" významnými="" rozdíly="" prokázaly,="" že="" ge,="" bss,="" qu="" a="" aa="" mohou="" do="" určité="" míry="" zlepšit="" dyskinezi="" u="" zebřiček.="" stanovení="" aktivit="" nervových="" vodivých="" markerů="" (ache="" a="" chat)="" ve="" skupinách="" je="" znázorněno="" na="" obrázku="" 12.="" alcl3="" významně="" zvýšil="" aktivitu="" ache="" a="" snížil="" aktivitu="" chat="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou.="" ale="" dpz="" a="" 4="" sloučeniny="" ukázaly="" schopnost="" částečně="" obnovit="" změny="" způsobené="" alcl3="" v="" ache="" a="" chat="" aktivitách.="" je="" v="" souladu="" s="" výsledky="" hodnocení="" dyskineze="" rehabilitačního="" účinku.="" závěrem="" lze="" říci,="" že="" ge,="" bss,="" qu="" a="" aa="" mohou="" mít="" potenciál="" stát="" se="" významnými="" anti-ad="">
3.4 Ověření domnělých cílů
Pro ověření domnělých cílů, které byly předpovězeny v této práci, byly pro analýzu qRT-PCR vybrány cíle související se signálními dráhami MAPK a TGF-beta. Jejich relativní úrovně exprese mRNA v OP modelu jsou znázorněny na obrázku 13. Ve srovnání se skupinou Pre GE zvýšila hladiny mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 a snížila hladiny tp53, TNF-, jun, tgfbr1 a c-fos . QU zvýšila hladiny mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 a snížila hladiny tp53, jun a il1b. BSS vykazoval pouze redukční účinky na tp53, TNF- a mapk3. Jak je znázorněno na obrázku 14, v modelu AD GE, QU, BSS a AA snižovaly hladinu exprese mRNA tp53. GE a QU snížily hladiny TNF-, bmp2, tgfbr1, sp1, tgfb2 a ifn a zvýšily hladiny jun, zatímco GE a AA zvýšily hladiny mapk3. Zdálo se, že pouze GE zvrátil vzestup mapk14a, fgfr1b, fgfr1a a igf1ra. Kromě toho QU snížila vysoké hladiny il1b a EGF. Relativní hladiny exprese mRNA genů včetně tp53, TNF-, mapk14a, mapk3, fgfrlb, bmp2, jun, il1b a tgfbr1 se významně změnily na rozdíl od kontrolní skupiny v každém modelu. Tyto výsledky naznačují, že mohou sloužit jako spojení mezi těmito dvěma nemocemi. Kromě toho tyto výsledky také naznačovaly možnost synergických účinků 4 sloučenin.
4. Diskuze
OP a AD jsou nejčastější klinická onemocnění spojená se stárnutím. Jejich složité patofyziologické mechanismy omezovaly po léta účinnou léčbu dvou onemocnění. Rizikové faktory OP a AD prokázaly, že vnímavá skupina obou onemocnění je částečně podobná, jako jsou starší ženy (Abraham et al., 2013; Patel, 2017), diabetici (Vieira et al., 2018; Xia et al., 2012), dlouhodobí kuřáci (Franic a Verdenik, 2018; Zhong et al., 2015) a neaktivní jedinci (Koedijk et al., 2017; Sofi et al., 2011). Současné studie navíc zjistily, že některé klíčové proteiny v AD měly také funkce v kostním metabolismu (Li et al., 2016; Pan et al., 2018). Existují důvody se domnívat, že OP a AD nejsou zcela nezávislé, dokonce mají určité potenciální souvislosti. To naznačuje potenciální homoterapii pro heteropatii, což znamená léčbu OP a AD stejnou terapií.
Na základě terapeutických cílů a principů TČM lze maladjustaci u nemoci rozdělit do několika „vzorců“. Takže více nemocí, jako je OP a AD, může sdílet jeden „vzorec“ a být léčeno stejnými TCM (Jiang, 2005). Jako bylina s ledvinovým tonikem se CT široce používá při léčbě OP a AD. Moderní studie poskytly určitý kompaktní důkaz, že CT má pozitivní farmakologické účinky na kostru a nervový systém. K odhalení mechanismů CT však ještě potřebuje podrobnější studie.
cistanche a tongkat alimítpozitivní farmakologické účinkynakostra a nervový systém.
V této studii byl pro jasné pochopení účinků CT na OP a AD nastaven síťový farmakologický přístup k predikci možných účinných látek a analýze souvisejících cest. Liší se od předchozích síťových farmakologických studií na CT (Liu et al., 2017). Poprvé byla provedena molekulární síť „jeden lék – dvě nemoci“, místo aby se zaměřila pouze na jednu nemoc. Na jedné straně integrovaná síťová analýza objevila celkem 22 aktivních sloučenin CT s dvojím účinkem pro léčbu OP i AD. Na druhou stranu, vzorce těchto dvou nemocí poskytovaly podporu pro odhalení jejich vazeb. Klasifikovaná analýza ukázala, že tyto aktivní sloučeniny mohou mít synergické účinky na mnoho biologických funkčních modulů a PhG, flavonoidy, terpeny a sterol prokázaly lepší účinnost. Aby se ověřila proveditelnost a vhodnost této vedené sítě, byly použity zebrafish ke konstrukci OP a AD modelů in vivo a vyhodnotila se účinnost čtyř sloučenin. A bylo použito ověření domnělých cílů, aby se odhalily jejich potenciální synergie. Tyto kombinované studie in silico a in vivo poskytly nový výchozí bod pro odhalení ochranného účinku CT na dvě onemocnění. Může poskytnout nová vodítka ke korelaci mezi patogenezí OP a AD a také pomoci pro budoucí vývoj terapeutických strategií pro dvě onemocnění. Metoda však stále potřebuje zlepšení a zdokonalování, aby bylo možné zcela prozkoumat synergické mechanismy CT pro léčbu OP a AD. V této studii byly pro validaci vybrány pouze určité sloučeniny. Dalších 18 aktivních složek se základními cíli a cestami je nutné dále ověřit pomocí experimentů. A společné rysy mezi OP a AD je stále třeba dále zkoumat a objevovat, zejména z pohledu léčby.
kde koupit cistanche
V naší studii bylo prokázáno, že BSS, GE, AA a QU mají ochranné účinky na OP a AD u zebřiček. Ještě krásnější je, že tyto cenné složky byly také experimentálně ověřeny v jiné literatuře a vykazovaly farmakologické aktivity konzistentní s aktivitami v tomto článku (Ayaz a kol., 2017; Chauhan a kol., 2018; King a kol., 2015; Ramnath a kol. , 2018; Thummuri a kol., 2018; Vargas-Restrepo a kol., 2018; Wang a kol., 2019; Yuan a kol., 2018). Dále prokázala účinnost a racionalitu této sítě a naznačila dvojí účinky zbývajících 18 sloučenin. Pokud jde o validaci domnělých cílů, 9 účinných cílů sestávajících z TP53, JUN, TNF, IL1B, MAPK14, MAPK3, FGFR1, BMP2 a TGFBR1 bylo nakonec vyšetřeno jako společné cíle OP a AD. TP53 je klíčový nádorový supresor a jeho aktivace by mohla vyvolat neuronální apoptózu (Xiao et al., 2019). TP 53, JUN a SP1 jsou aktivní transkripční faktory v primární OP (Xie et al., 2015). TNF a IL1B jsou běžné zánětlivé cytokiny s funkcí podpory osteoklastogeneze (Geissler et al., 2018) a úbytku kostní hmoty (Sang et al., 2017). Kromě toho jsou oba terapeutickými cíli pro AD prostřednictvím inhibice neurozánětu k ochraně neuronů (Liu et al., 2017). TGFB1, TGFB2, TGFBR1 a TGFBR1 mají komplexní účinky na zánět neuronů (Lippa et al., 1998) a osteolýzu (Quinn et al., 2001). Kostní morfogenetické proteiny (BMP) jsou jedním z faktorů podílejících se na gliální diferenciaci nervových progenitorových buněk (Kwak et al., 2014). Bylo prokázáno, že upregulovaná exprese BMP2 slouží zásadní roli v diferenciaci osteoblastů (Li et al., 2017). Kromě těchto experimentálně ověřených cílů se očekávalo, že 81 společných cílů uvedených v tabulce S2 bude také terapeutickými cíli, ale nebyly zkoumány nebo byly provedeny předběžné studie v jiném výzkumu.
Je zvláště pozoruhodné, že všechny tyto cenné cíle souvisí se signálními cestami MAPK a TGF-beta na základě analýzy obohacení KEGG. Signální dráha MAPK reguluje buněčnou proliferaci, diferenciaci, přežití nebo apoptózu, zánět a vrozenou imunitu. Bylo hlášeno, že kompromitovaná signální dráha MAPK přispěla k patologii neurodegenerace, jako je AD (Kim a Choi, 2015), a také k přímé inhibici osteoblastů (Xiao et al., 2019). Pokud jde o členy rodiny TGF, hráli různé role v kostře s přímými účinky na poškození kostí (Sun et al., 2016), zatímco aktivace neuronální signalizace TGF-beta zvyšuje neurodegenerativní poruchy a onemocnění podobné AD (Tesseur et al. ., 2006). Lze tedy očekávat, že signální dráhy MAPK a TGF-beta se stanou sdílenými mechanismy pro odhalení patogeneze OP a AD nebo zpomalení progrese. Kromě dvou drah regulovalo 22 aktivních látek celkem 66 drah, zejména dráhy s nejvyšší p-hodnotou, jako je signální dráha prolaktinu, signální dráha FoxO a diferenciace buněk Th17, si také zaslouží pozornost a výzkum. jako klíč k odhalení korelace mezi OP a AD. Konečně, shrnuté objevy mohou naznačovat souvislost mezi těmito dvěma nemocemi v imunitním systému a endokrinním systému.
5. Závěr
V této práci jsme navrhli síťový farmakologický přístup, který kombinuje PCA analýzu, DL screening, sběr a predikci více cílů, konstrukci sítě PPI, stejně jako analýzu GO a KEGG dráhy, abychom prozkoumali účinnost CT pro léčbu OP a AD. Naše výsledky naznačují, že 22 aktivních složek CT může hlavně regulovat přenos signálu, endokrinní systém, imunitní systém, buněčný růst a smrt, aby hrály důležitou roli v léčbě OP a AD. Pro lepší pochopení mechanismů CT byla tato síť hluboce vykopána a analyzována v závislosti na typu sloučenin. Nakonec jsme aplikovali samostatně modely OP a AD zebrafish k identifikaci 4 cenných sloučenin a souvisejících cílů, což poskytlo proveditelnou metodu pro spojení genomu s farmakodynamikou a nalezení sloučenin s dvojím účinkem.
