Část 2: Epigenetická regulace cirkadiánního genu Per1 přispívá ke změnám hippocampu souvisejícím s věkem

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Pls klikněte zde pro část 1

Knockdown Per1 dlouhodobě zhoršujePaměťu mladých myší.Dále otestovat, zda je upregulace Per1 v dorzálním hipokampu dlouhodobě nezbytnáPaměť48 hodin před 10-min OLM tréninkem jsme infundovali siRNA cílenou na Per1 do dorzálního hipokampu mladých myší. Infuze siRNA Per1 způsobila významnou redukci proteinu PER1 v dorzálním hipokampu, měřeno 2 hodiny po posledním testovacím sezení (obr. 4d, doplňkový obr. 5). Toto relativně mírné snížení proteinu PER1 (~30 procent) způsobilo vážné poškozeníPaměťformace pro OLM; myši s infuzí Per1 siRNA nevykazovaly žádné signifikantní zvýšení DI mezi tréninkem a testováním a vykazovaly významně menší preferenci pro pohybující se objekt během testování než kontrolní myši (obr. 4e) bez vlivu na celkový průzkum objektu při testu (obr. 4f). a žádný rozdíl v pohybu během předtréninkových habituačních sezení (doplňkový obrázek 8c). To poprvé ukazuje, že lokální narušení základního genu cirkadiánních hodin selektivně v hippocampu může poškoditPaměťformace.

Nadměrná exprese Per1 se zlepšujePaměťu stárnoucích myší. Konečně,určit, zda je nadměrná exprese Per1 v dorzálním hipokampu dostatečná ke zlepšení související s věkemPaměťpoškození jsme lokálně upregulovali Per1 pomocí dvou komplementárních metod. Nejprve jsme použili lentivirus exprimující Perl divokého typu s epitopovou značkou v5 (pLVX-v5Perl) (obr. 5a, doplňkový obr. 6a). Abychom potvrdili, že tento plazmid nadměrně exprimuje Per1, transfekovali jsme buňky HT22 pLVX-v5Per1 nebo pLVX-EV a měřili expresi Per1 mRNA. Jak 24, tak 48 hodin po transfekci byla mRNA Per1 významně zvýšena v buňkách transfekovaných pLVX-v5Per1 vzhledem k buňkám transfekovaným kontrolním plazmidem (obr. 5b). Transfekce pLVX-v5Per1 také vedla k významnému zvýšení mRNA pro Per2 (člen rodiny Period clock, který interaguje s Per1) po 24 hodinách (doplňkový obr. 6b), ačkoli toto zvýšení bylo mnohem menší než pozorované zvýšení Per1 (při 24 h, Per1: 466-násobný nárůst oproti EV, Per2: 1.{37}}násobný nárůst oproti EV). Nadměrná exprese Per1 však neovlivnila transkripci nejbližšího downstream genu Hes7 (doplňkový obrázek 6c).

Chcete-li zjistit, zda se nadměrná exprese Per1 zlepšujePaměťu stárnoucích myší byl pLVX-v5Per1 podán infuzí do dorzálního hipokampu 18-mo myší 2 týdny před chováním. Myši pLVX-v5Per1 vykazovaly signifikantní zlepšeníPaměťpro OLM při testu ve srovnání s kontrolami pLVX-EV (prázdný vektor) (obr. 5c). Pouze myši pLVX-v5Per1 vykazovaly významné zvýšení preference pohybujícího se objektu v klidu ve srovnání s tréninkem bez pozorovaných skupinových rozdílů v celkovém průzkumu při testu (obr. 5d) nebo v pohybu během návyku (doplňkový obrázek 8d).

Po chování byla hipokampální tkáň z podskupiny zvířat zpracována pro sekvenování RNA, aby se potvrdila přítomnost transkriptů pLVX-EV a pLVX-v5Per1 ve vhodných skupinách in vivo (doplňkový obrázek 7a, b, f, g).

K doplnění tohoto přístupu jsme také použili systém CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)33 k řízení transkripční aktivace Per1 v dorzálním hipokampu. Tento systém se skládá ze tří lentivirových složek: katalytickyneaktivní Cas9 (dCas9) fúzovaný s VP64 transkripční aktivační doménou s GFP tagem (dCas9-VP64-GFP), modifikovanou single-guide RNA (sgRNA) zacílenou na Per1 se dvěma MS2 RNA aptamery, které mohou získat třetí složku, fúzní protein MS2- dvojitého transkripčního aktivátoru (MS2-p65-HSF1)(obr. 5e). Kontrolní zvířata obdržela kontrolní sgRNA postrádající 20 nukleotidovou sekvenci potřebnou k zacílení systému SAM na Per1 (označované jako ctrl sgRNA). Sestavení těchto složek v promotoru Per1 umožňuje třem efektorovým doménám (VP64, p65 a HSF1) řídit transkripci Per1. Abychom potvrdili, účinnost Obr. 5 Nadměrná exprese Per1 v dorzálním hipokampu zlepšuje poškození související s věkem v umístění objektu.Paměť. Schéma lentivirového konstruktu použitého k nadměrné expresi v{0}}značeného Per1 (pLVX-v5Per1) ve srovnání s prázdnou vektorovou kontrolou (pLVX-EV). b Per1 mRNA byla významně zvýšena 24 a 48 hodin po transfekci pLVX-v5Per1 v buňkách HT22 ve srovnání s buňkami transfekovanými EV (dvoucestná ANOVA: interakce skupina x časový bod (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidakovy="" post="" hoc="" testy,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" myši,="" kterým="" byly="" podávány="" hipokampální="" infuze="" plvx-v5per1,="" vykazovaly="" výrazně="" lepší="" paměť="" pro="" olm="" než="" myši,="" kterým="" byl="" podáván="" kontrolní="" virus="" plvx-ev="" (dvoucestná="" anova:="" interakce="" virus="" x="" relace,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" sidakovy="" post="" hoc="" testy,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" všichni="" muži).="" d="" celkový="" průzkum="" byl="" pro="" obě="" skupiny="" v="" testu="" podobný="" (t(29)="0,57," p="0,57)." e="" schéma="" systému="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" používaného="" k="" řízení="" transkripce="" per1.="" nahoře:="" jednotlivé="" součásti="" sam.="" dole:="" komponenty="" sestavené="" na="" promotoru="" per1,="" které="" řídí="" transkripci="" per1.="" f="" per1="" mrna="" byla="" významně="" zvýšena="" 48="" hodin="" po="" transfekci="" složek="" crispr-sam="" v="" buňkách="" ht22="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" transfekovanými="" kontrolní="" sgrna="" (dvoucestná="" anova:="" interakce="" skupina="" x="" časový="" bod="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" sidakovy="" post="" hoc="" testy,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" myši,="" kterým="" byly="" podávány="" hipokampální="" infuze="" systému="" crispr-sam="" se="" sgrna="" cílenou="" na="" per1,="" vykazovaly="" výrazně="">Paměťpro OLM ve srovnání s EV kontrolními myšmi s kontrolní sgRNA (Dvoucestná ANOVA: interakce virus x relace (F(1,30)=5,83, p < 0,05)="" ,="" sidakovy="" post="" hoc="" testy,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" všichni="" muži).="" h="" celkový="" průzkum="" byl="" pro="" obě="" skupiny="" v="" testu="" podobný="" (t(30)="0.41," p="0.68)." data="" jsou="" prezentována="" jako="" průměr="" ±="" sem="" v="" systému="" crispr-sam,="" buňky="" ht22="" jsme="" transfekovali="" všemi="" třemi="" plazmidy,="" sklidili="" buňky="" o="" 24="" nebo="" 48="" hodin="" později="" a="" měřili="" expresi="" per1="" mrna.="" 48="" hodin="" po="" transfekci="" byla="" mrna="" per1="" signifikantně="" zvýšena="" ve="" skupině,="" která="" dostávala="" per1="" sgrna="" ve="" srovnání="" s="" kontrolami="" (obr.="" 5f),="" což="" potvrzuje,="" že="" systém="" crispr-sam="" účinně="" řídí="" expresi="" per1="" mrna.="" nepozorovali="" jsme="" žádnou="" změnu="" v="" expresi="" ani="" u="" mrna="" per2="" (doplňkový="" obrázek="" 6e)="" ani="" u="" mrna="" hes7="" (doplňkový="" obrázek="" 6f),="" což="" naznačuje,="" že="" systém="" crispr-sam="" řídí="" selektivní="" nadměrnou="" expresi="" cílového="" genu="">

Dále byly 18-mo myším podány intrahippokampální infuze lentivirů CRISPR-SAM (doplňkový obrázek 6d) a o 2 týdny později byly trénovány v OLM. Jak bylo pozorováno u naší nadměrné exprese pLVX-v5Per1, nadměrná exprese Per1 zprostředkovaná CRISPR-SAM se významně zlepšilaPaměťvýkon u myší s infuzí Per1 sgRNA ve srovnání s kontrolními zvířaty (obr. 5g) bez ovlivnění celkového průzkumu (obr. 5h) nebo pohybu během zvykání (doplňkový obrázek 8e). Pouze myši, kterým byla podávána sgRNA Per1, vykazovaly významné zvýšení preference pohybujícího se objektu v klidu ve srovnání s tréninkem, což naznačuje intaktníPaměťpro umístění objektů (obr. 5g). Po chování byla hipokampální tkáň z podskupiny zvířat zpracována pro sekvenování RNA, aby se potvrdila přítomnost transkriptů CRISPR ve vhodných skupinách in vivo (doplňkový obr. 7c–g). Tyto výsledky společně prokazují, že nadměrná exprese Per1 v dorzálním hipokampu je dostatečná ke zmírnění poškození souvisejících s věkem v dlouhodobé paměti umístění objektu. Per1 je tedy klíčový gen, který je kritický pro tvorbu dlouhodobé paměti, je regulován HDAC3 a je narušen ve stárnoucím mozku.

Diskuse

Naše výsledky ukazují, že delece nebo narušení represivní histon deacetylázy HDAC3 může zlepšit poškození související s věkem v obou dlouhodobýchPaměťa synaptickou plasticitu. Dále, delece HDAC3 obnovuje zkušenostmi indukovanou expresi cirkadiánního genu Per1 v dorzálním hipokampu. Vzhledem k tomu, že exprese PER1 v hipokampu je kritická pro tvorbu dlouhodobé paměti (obr. 4) a nadměrná exprese Per1 v hipokampu zmírňuje poruchy paměti související s věkem (obr. 5), je PER1 potenciálním mechanismem, jehož prostřednictvím se zlepšuje delece HDAC3Paměťa synaptická plasticita u stárnoucích myší. Obecněji řečeno, narušení Per1 související s věkem může spojovat poruchy související s věkem jak v dlouhodobé paměti, tak v cirkadiánní rytmičnosti, v závislosti na struktuře.

Jedním z klíčových zjištění ze současné studie bylo, že věkem podmíněná poškození hipokampální LTP by mohla být zlepšena delecí nebo narušením HDAC3. To je v souladu s nedávnou prací z laboratoře Sajikumar, která prokazuje, že farmakologická blokáda HDAC3 může také zlepšit poškození související s věkem u asociativního hipokampálního LTP34. Je zajímavé, že jsme zjistili, že řezy ze starých zvířat HDAC3flox/flox a HDAC3(Y298H) nedosáhly stejné úrovně potenciace jako řezy z mladých zvířat HDAC3flox/flox nebo HDAC3(Y298H) (obr. 2c, f), což naznačuje, že stárnoucí mozky mohou mít nižší strop plasticity než mladé mozky. Jedním z možných vysvětlení tohoto rozdílu v potenciaci je, že ztráta synaptických kontaktů v CA122 související s věkem by mohla snížit strop plasticity ve stárnoucím hipokampu, protože méně dostupných synapsí by se nasytilo rychleji než relativně hojné synapse u mladých DH. Pokud tomu tak je, posílení stimulačního protokolu nebo poskytování rozmístěných stimulačních záchvatů35 by nemělo dále zvyšovat LTP ve stárnoucím hipokampu, protože nejsou k dispozici žádné další synapse. K určení mechanismu, který je základem tohoto rozdílu, bude zapotřebí další práce.

Naše výsledky sekvenování RNA prokázaly, že pouze malá podskupina genů vyhovuje kritériím obnovy ve stárnoucím mozku delecí HDAC3 (obr. 3e). Místo rekapitulace profilu genové exprese mladého mozku tedy odstranění HDAC3 ve stárnoucím mozku obnovilo zkušenostmi indukovanou expresi několika klíčových genů, které jsou kriticky důležité pro tvorbu dlouhodobé paměti, včetně Per1. Zdá se, že Per1 je přímo regulován HDAC3, protože fokální delece HDAC3 obnovila zkušenostmi indukovanou expresi Per1 a HDAC3 je fyzicky odstraněn z promotoru Per1 v reakci na trénink OLM. Dále je nutný výraz Per1Paměťjako siRNA-zprostředkované knock-down proteinu PER1 v DH dlouhodobě narušenéPaměťtvorba u mladých myší a nadměrná exprese se zlepšilaPaměťpro OLM u stárnoucích myší. Je pozoruhodné, že oba lentivirové systémy používané k nadměrné expresi Per1 transfekovaly pouze malý počet buněk v oblasti CA1b dorzálního hipokampu (doplňkový obrázek 6a, d), takže je nutné potvrdit přítomnost těchto konstruktů pomocí sekvenování RNA (viz metody ). Jak předchozí práce ukázala, že tato přesná oblast dorzálního hipokampu je pro OLM36 kritická, ukazuje to, že i malá fokální změna Per1 ve struktuře relevantní pro paměť může ovlivnit tvorbu dlouhodobé paměti. To rozšiřuje předchozí výzkum ukazující, že nespecifická delece Per1 v mozku může narušit tvorbu paměti u mladých myší6,28,29. Abnormální HDAC3-zprostředkovaná represe Per1 ve stárnoucím mozku je proto klíčovou událostí, která by mohla vést ke zhoršení tvorby dlouhodobé paměti a cirkadiánní rytmičnosti související s věkem. Ačkoli tato studie jasně ukazuje, že Per1 je důležitý gen, jehož prostřednictvím HDAC3 reguluje dlouhodobou paměť ve stárnoucím mozku, jiné geny s největší pravděpodobností přispívají k účinkům delece HDAC3 na posílení paměti. Další geny navržené ke zprostředkování účinků HDAC3 na synaptickou plasticitu a paměť zahrnují NF-KB34, FMRP37 a Nr4a226. V současné studii jsme identifikovali další tři geny (obr. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3), které stejně jako Per1 vykazují zhoršenou expresi ve stárnoucím mozku, která je zlepšena delecí HDAC3. V současné době není jasné, jak tyto různé geny jedinečně přispívají k účinkům delece HDAC3 na zlepšení paměti. Je pozoruhodné, že všechny tyto geny se propojují s dráhou CBP/CREB, která je kritická pro tvorbu dlouhodobé paměti38,39 a je jak up-, tak downstream od PER16,28. Protože PER1 je před fosforylací CREB6, je možné, že represe Per1 zprostředkovaná HDAC3-snižuje fosforylaci CREB, což nakonec narušuje transkripci genů zprostředkovaných CREB, jako je Fmrp40,41 a členové rodiny genů Nr4a, Nr4a1 a Nr4a226. Pochopení komplexní dynamiky mezi HDAC3, PER1 a těmito dalšími molekulárními hráči bude důležitým cílem budoucího výzkumu.

V současné studii jsme použili dvě komplementární metody k nadměrné expresi Per1 ve stárnoucím mozku: overexpresi kompletního konstruktu Per1 cDNA pomocí pLVX-v5Per1 a transkripční aktivaci endogenního Per1 pomocí systému CRISPR-SAM. Ačkoli nadměrná exprese zprostředkovaná pLVX vedla k velkému zvýšení mRNA Per1 (obr. 5b), bylo to doprovázeno zvýšením Per2, dalšího člena rodiny období (doplňkový obr. 6b). Exprese downstream genu Hes7 však byla pomocí pLVX-v5Perl nezměněna (doplňkový obrázek 6c). Systém CRISPR-SAM na druhé straně produkoval jemnější nárůst mRNA Per1, který se vyhnul mimocílovému zvýšení exprese Per2 nebo Hes7 (doplňkový obrázek 6e–f). Protože oba přístupy se dlouhodobě zlepšují podobněPaměťu stárnoucích myší je nepravděpodobné, že by mimocílové zvýšení Per2 pozorované u pLVX-v5Per1 bylo příčinou pozorovaného zlepšení dlouhodobé paměti.

Cirkadiánní účinky na dlouhodobéPaměťse tradičně věří, že pocházejí z dysregulace v SCN, která pak řídí změny v periferních strukturách zapojených do tvorby paměti, jako je dorzální hipokampus. O úloze jednotlivých genů cirkadiánních hodin v DH je málo známo, a to i přes jasnou souvislost mezi cirkadiánní rytmicitou a tvorbou dlouhodobé paměti. Paměť je úzce spojena s denní dobou, protože genové kaskády související s plasticitou vykazují cirkadiánní oscilace3,6 aPaměťlze snadněji získat v určitých obdobích cirkadiánního cyklu. Například podmiňování kontextu strachu je získáváno silněji během dne, kdy hladiny fosforylace MAPK vrcholí3. Dále je dobře zdokumentováno, že stárnutí je doprovázeno zhroucením cirkadiánních rytmů, pravděpodobně v důsledku změn v centrálních cirkadiánních hodinách, suprachiasmatic nucleus (SCN) (pro přehled1). Jak toto narušení cirkadiánních hodin souvisí s věkovým postiženímPaměťje otevřená otázka. Naše výsledky naznačují, že HDAC3 omezuje zkušenostmi indukovaný Per1 ve stárnoucím hipokampu, což možná přispívá k pozorovaným poruchám dlouhodobé paměti. Epigenetická represe Per1 proto může představovat důležité rozhraní mezi věkovými poruchami jak v cirkadiánní rytmice, tak v tvorbě dlouhodobé paměti.

Z hlavních kanonických cirkadiánních hodinových genů je Per1 jedinečně připravený dramaticky ovlivnit hipokampální dlouhodobéPaměť. Zdá se, že Per1 se převážně účastní výstupních drah SCN a hraje klíčovou roli v periferních hodinách po proudu od SCN, jako je hipokampus42. Nedávná práce dále naznačuje, že Per1 může „bránit“ vytváření prostorové paměti během cyklu den/noc řízením fosforylace CREB6,28,29. Upregulace mRNA hippocampu Per1 byla skutečně pozorována po kontextu nebo prostorovém učení v nejméně třech dalších studiích RNA-seq, včetně práce na potkanech, což naznačuje, že Per1 je typicky upregulován po učení napříč druhy20, 43, 44. Spolu s výsledky současné studie tato práce ukazuje, že exprese PER1 je kriticky důležitá pro tvorbu dlouhodobé paměti v hipokampu; snížení PER1, ke kterému dochází v noci29 nebo se stárnutím, by mohlo poškodit hipokampusPaměť. K datu,

výzkum zahrnující Per1 inPaměťformace se výhradně spoléhala na globální knockouty, které narušují expresi Per1 v základních cirkadiánních hodinách a dalších oblastech kromě paměťově relevantních struktur, jako je hipokampus6,28,29,45,46, což znemožňuje určit, zda je hipokampální PER1 specificky vyžadován pro formování paměti. V některých zprávách globální delece Per1 skutečně ovlivňuje cirkadiánní rytmičnost42. Zde poprvé ukazujeme, že snížení exprese PER1 přímo v dorzálním hipokampu může poškoditPaměťu mladých myší, zatímco lokální nadměrná exprese Per1 v dorzálním hipokampu může zlepšit paměť u stárnoucích myší. Vzhledem k tomu, že selektivní delece HDAC3 (která reguluje Per1) v dorzálním hipokampu neměla v současné studii žádný vliv na vzorce cirkadiánní aktivity (doplňkový obrázek 4), a dokonce ani elektrolytické léze dorzálního hipokampu jsou nedostatečné k ovlivnění cirkadiánní rytmicity47, zdá se nepravděpodobné, že manipulace s Per1 v dorzálním hipokampu ovlivňuje funkci centrálních cirkadiánních hodin. Nicméně je možné, že zkušenostmi vyvolané zvýšení Per1 nebo virem zprostředkovaná nadměrná exprese Per1 může ovlivnit cirkadiánní oscilaci jiných molekulárních hráčů, jako jsou jiné hodinové geny, v hipokampálních neuronech, a to i bez ovlivnění vzorců cirkadiánní aktivity. Cílem budoucí práce bude pochopení toho, jak Per1 funguje při změně formování paměti, včetně identifikace těchto potenciálních interagujících partnerů.

Tyto výsledky společně ukazují, že klíčovou roli v rámci lokálních hraje klíčový gen cirkadiánních hodin Per1Paměťstruktur ke změně tvorby paměti, což je role, která je nezávislá na jeho funkci v SCN. Obecněji to zpochybňuje tradiční hypotézu, že cirkadiánní změnyPaměťformování je řízeno změnami v základních cirkadiánních hodinách a místo toho podporuje hypotézu, že geny cirkadiánních hodin hrají autonomnější roli v hipokampálních buňkách, což pravděpodobně řídí tvorbu paměti na základě denní doby6.

Metody

Myši. Mladé dospělé myši byly v době testování staré 2 až 4 měsíce a stárnoucí myši byly staré 18 až 20 měsíců. Všechny myši byly C57BL/6J nebo byly udržovány na pozadí C57BL/6 (myši HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox). Myši měly volný přístup k potravě a vodě a světla byla udržována v cyklu světlo/tma 12 hodin. Veškeré behaviorální testy byly prováděny během světelného cyklu. Všechny experimenty byly provedeny podle směrnic amerického Národního institutu zdraví pro péči o zvířata a jejich použití a byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee of the University of California, Irvine.

Chirurgická operace. Myši byly anestetizovány isofluranem (indukovaný, 4 procenta; udržováno 1,5–2 0 procent) a umístěny do stereotaxe. Injekční jehly byly spouštěny do dorzálního hipokampu rychlostí 0,2 mm/15 s (AP, -2.0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, -1,5 mm vzhledem k Bregmě ). Dvě minuty po dosažení cílové hloubky byl 1,{15}} ul viru nebo siRNA infundován bilaterálně do DH rychlostí 6 ul/h. Pro lentivirové infuze CRISPR-SAM byl koktejl tří virů infundován do konečného objemu 1,5 μl na hemisféru stejnou rychlostí. Injekční jehly zůstaly na místě po dobu dvou minut po injekci, aby umožnily viru difundovat. Injektory byly poté zvednuty 0,1 mm a ponechány sedět další minutu, než byly odstraněny rychlostí 0,1 mm za 15 s. Virové infuze byly provedeny 2 týdny před behaviorální analýzou, zatímco knockdown siRNA byl proveden 2 dny před tréninkem13. Pro všechny injekční experimenty byla zvířata náhodně přiřazena k různým injekčním podmínkám (s výjimkou myší HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox, kterým byla všem injekčně podána AAV-CaMKII-Cre). Pro všechny behaviorální experimenty byla zvířata v rámci každého virového stavu náhodně rozdělena do domácích/trénovaných skupin a všechny podmínky (předměty, boxy atd.) byly mezi skupinami vyváženy.

Výroba AAV. AAV2.1-CaMKII-Cre byl zakoupen od Penn Vector Core (titr: 1,81 × 1013 GC/ml). Pro AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5 jsme amplifikovali divoký typ HDAC3 z hipokampální cDNA a klonovali produkt do modifikovaného pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) pod kontrolou CMV promotoru a -globinového intronu. Značka 3x-FLAG, prvek IRES a hrGFP byly odstraněny z vektoru a nahrazeny značkou V5, což umožnilo C-koncovou fúzi k HDAC3 (plazmid MW91). Pro vytvoření bodové mutace jsme změnili nukleotidy tak, aby kódovaly histidinový zbytek místo tyrosinu v aminokyselině 298 (plazmid MW92). Pro kontrolu prázdného vektoru nebyla přítomna kódující sekvence HDAC3, ale všechny ostatní prvky zůstaly (plazmid MW87). AAV byl vytvořen Penn Vector Core a konečné titry byly stanoveny pomocí qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 x 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 x 1013 GC/ml).

Produkce lentivirů. Pro systém CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) byly od Addgene zakoupeny lentivirové plazmidy pro dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) a MS2- Konstrukty P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) (titry větší nebo rovné 8× 106 TU/ml). Pro Per1 sgRNA jsme klonovali a vložili antisense vodící sekvenci odpovídající CRE elementu v Per1 promotoru (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) do Addgene sgRNA(MS2) klonovací páteře (#61427). Kontrolní sgRNA byla identická, kromě toho, že do plazmidu nebyla klonována žádná vodicí sekvence. Lentiviry pro Per1 sgRNA (titr: 6,8 x 107 IFU/ml) i kontrolní sgRNA (3,5 x 107 IFU/ml) byly produkovány USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory.

Pro konstrukt s nadměrnou expresí pLVX-V5Per1 jsme amplifikovali divoký typ Per1 plné délky z plazmidu Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) a klonovali produkt do modifikovaného pLVX-EF1 -IRES-mCherry páteř (Takara, #631987). Elementy IRES a mCherry byly odstraněny a byly nahrazeny značkou V5, což umožnilo N-koncovou fúzi k PER1 (plazmid MW206). Pro kontrolu prázdného vektoru (EV) nebyla přítomna kódující sekvence PER1, ale všechny ostatní prvky zůstaly (plazmid MW93). Lentiviry pro pLVX-v5Perl (titr: 1,3 x 108 IFU/ml) a pLVX-EV (titr: 1,5 x 108 IFU/ml) byly vyrobeny USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory. Všechny lentivirové konstrukty byly exprimovány pod promotorem EF1.

Ověření buněčné kultury pLVX-v5Per1 a CRISPR-SAM. Aby se ověřilo, že pLVX-v5Perl produkuje nadměrnou expresi Perl mRNA, byly myší HT22 buňky (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) transfekovány pLVX-v5Perl nebo pLVX-EV (obr. 5a) pomocí Lipofectaine LTX (Invitrogen). Podobně, aby se ověřilo, že systém CRISPR-SAM může účinně řídit transkripci Per1, byly buňky HT22 transfekovány dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast byl dar od Feng Zhang Addgene plasmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast byl dar od Feng Zhang, Addgene plasmid #61426) a buď Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) nebo necílená kontrolní sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo páteř byla darem od Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) pomocí Lipofectamine LTX (Invitrogen). Buňky byly sklizeny po 24 nebo 48 hodinách, lyžovány a mRNA byla izolována, jak je popsáno výše. qRT-PCR byla provedena, jak je popsáno výše, s použitím primerů a sondy Per1, Per2 a Hes7 uvedených v tabulce S4.

siRNA. Pro experiment Per1 knockdown byly malé interferující RNA Accell SMARTpool (siRNA; Dharmacon, GE) zacílené na Per1 naředěny na konečnou celkovou koncentraci 10 μM v ddH20 a infundovány do DH (1,0 ul/strana). Accell non-target pool siRNA byla použita jako kontrola (celková koncentrace, 10 uM) a byla infundována stejným způsobem. Pro experimenty se siRNA se s myšmi manipulovalo a přivykaly si, jak je popsáno výše, a operace byla provedena den po posledním dni zvykání. Myši dostaly celý den zotavení po operaci a byly trénovány následující den (~48 hodin po operaci), aby se zajistilo maximální snížení cíle. Pro zajištění knockdownu byly myši usmrceny ~ 1 hodinu po testu a údery z dorzálního hipokampu byly zpracovány pomocí western blotů, aby se zajistilo knockdown proteinu PER1.

Umístění a rozpoznávání objektůPaměťúkoly. Pro úkoly týkající se lokalizace objektů a rozpoznávání objektů byly myši ošetřovány po dobu 2 minut/den po dobu 4 dnů a poté byly přivykány na kontext po dobu 5 minut/den po dobu šesti po sobě jdoucích dnů v nepřítomnosti objektů. Během tréninku byly myši vystaveny dvěma identickým předmětům (100 ml kádinky, plechovky na koření nebo skleněné svícny) a nechaly se 10 minut zkoumat. Během retenčního testu (24 hodin později pro dlouhodobéPaměťnebo o 60 m později pro krátkodobou paměť), myši se nechaly zkoumat po dobu 5 minut. Pro umístění objektuPaměť, byl jeden ze dvou známých objektů přesunut na nové místo. Pro rozpoznávání objektůPaměť, umístění objektů zůstalo konstantní, ale jeden z objektů byl nahrazen novým předmětem. Přivykání paměti pro rozpoznávání objektů začalo nejméně jeden týden po dokončení testování OLM a byl použit nový kontext a neznámé objekty48. Průzkum byl hodnocen, když se hlava myši orientovala směrem k předmětu a přiblížila se na 1 cm nebo když se předmětu dotkl nos. Byla zaznamenána celková doba průzkumu (t) a preference pro novou položku byla vyjádřena jako diskriminační index (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 procent). Pro tréninky byl objekt určený k přesunu při testu použit jako nový objekt, aby bylo možné přímo porovnávat tréninkové a testovací DI. Myši, které zkoumaly oba objekty méně než 2 s během testování nebo 3 s během tréninku, byly z další analýzy vyřazeny. Myši, které během tréninku preferovaly jeden objekt (DI > ±20), byly také odstraněny. Habituační relace byly analyzovány (pro určení ujeté vzdálenosti a rychlosti) pomocí softwaru pro analýzu chování ANY-bludiště (Stoelting Co). Veškeré zvykání, trénink, testování a bodování prováděli experimentátoři zaslepení k experimentálním skupinám.

Souvislosti strachu s podmínkou. Pro kontextové podmiňování strachu byly myši nejprve ošetřovány po dobu 5 dnů. Během akvizice byly myši vystaveny kontextu po dobu 2 minut a 28 s, po nichž následoval 2s (0.75 mA) šok, protokol, který typicky vytváří robustní dlouhodobou paměť12,20. Myši zůstaly v kontextu dalších 30 s, než byly odstraněny. Myši byly obětovány 60 m po tréninku spolu s kontrolami v domácí kleci, se kterými se manipulovalo, ale nebyly trénovány. Chování při zamrzání bylo měřeno pomocí softwaru Ethovision 11 (Noldus)12.

Zvýšené plus-bludiště. Plus-bludiště bylo provedeno experimentátorem, který byl slepý k experimentálním skupinám. Jeden týden po dokončení ORM byla podskupina myší testována v plus-bludišti. Dvě ramena bludiště byla otevřená (30 × 5 cm) a dvě ramena byla uzavřena (30 × 5 × 15 cm), spojená centrální plošinou (5 × 5 cm). Bludiště bylo vyvýšeno 40 cm nad podlahu. Myši byly testovány po dobu 5 minut na zařízení, které spočívalo v umístění každé myši na centrální platformu čelem k jednomu z otevřených ramen. Mezi subjekty bylo bludiště vyčištěno 70% ethanolem. Procento času stráveného v zavřených a otevřených ramenech bylo hodnoceno pomocí softwaru ANY-bludisko.

Analýza cirkadiánního rytmu. Mladé ({{0}}}měs.) a stárnoucí (18-}měs.) myši HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox byly chovány a umístěny v 12hodinovém cyklu světlo/tma (LD). Dva týdny po infuzi AAV-CaMKII-Cre (popsané výše) byly myši přeneseny do izolované 12h LD strhávací místnosti na 7 dní. Myši byly poté přeneseny do místnosti pro analýzu aktivity chráněné před světlem, kde byla lokomotorická aktivita analyzována pomocí detektorů pohybu s optickým paprskem (Philips Respironics). Aktivita byla monitorována během 2 týdnů strhávání cyklu LD v místnosti chráněné před světlem, než byly myši převedeny do konstantní tmy (DD) na další 3 týdny. Monitorování aktivity pokračovalo během DD fáze, aby se určilo, zda delece HDAC3 v DH ovlivnila endogenní cirkadiánní rytmy. Data byla shromážděna pomocí Minimitter VitalView 5.0 a ke stanovení nástupu volné aktivity byl použit software Clocklab (Actimetrics). Hodnoty Tau byly vypočteny získáním sklonu tohoto počátku a výpočtem proložení metodou nejmenších čtverců pomocí softwaru Clocklab49,50.

Imunohistochemie. Po dokončení chování byly myši usmrceny cervikální dislokací a jejich mozky byly vyjmuty a bleskově zmraženy v ledově studeném isopentanu. Dvacetimikrometrové řezy byly shromážděny v celém dorzálním hip-campusu, rozmrazeny nasazeny na sklíčka a skladovány při -80 stupních. Sklíčka byla fixována 4% paraformaldehydem (10-min), permeabilizována v 0.01% Triton X-100 v 0,1 M PBS (5-min) a blokovány po dobu 1 hodiny 8% normálním kozím sérem (Jackson). Sklíčka byla inkubována přes noc (4 stupně) v králičí protilátce proti HDAC3 (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) nebo V5 (1:1000, Abcam, ab9116) nebo kuřecí protilátce proti GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Následující den byla sklíčka promyta a inkubována po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě s kozí anti-králičí Alexa 488 (HDAC3 a V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) nebo kozí anti-kuřecí Alexa 488 (GFP ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) ve tmě. Sklíčka byla poté promyta PBST a inkubována po dobu 50 m v NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), fluorescenčním barvivu nissl. K uhašení nespecifické autofluorescence51 byly řezy promyty v PBS s 0,01% Tritonem, opláchnuty ve vodě a inkubovány 10-min v 10 mM CuS04 v 50 mM pufru octanu amonného. Řezy byly znovu opláchnuty ve vodě, promyty v PBS a překryty krycím sklíčkem VectaShield Antifade montážním médiem (Vector Laboratories).

Všechny snímky byly pořízeny skenerem Olympus Scanner VS110 s 20x apochromatickým objektivem (numerická apertura 0,75) se softwarem skeneru VS110. Na každém sklíčku byly zastoupeny všechny léčebné skupiny a všechny snímky na podložním sklíčku byly zachyceny se stejnou dobou expozice za nesaturujících podmínek. Intenzita imunoznačení byla kvantifikována pomocí ImageJ vzorkováním optické hustoty buněčné vrstvy v CA1 a odečtením vzorku fluorescence pozadí na stejném obrázku. U všech AAV experimentů byla zvířata, která nedokázala exprimovat virus v oblasti CA1 dorzálního hipokampu, z analýz vyloučena. Zobrazování a kvantifikaci prováděli experimentátoři slepí k experimentálním podmínkám.

Western blot. Pro ověření knockdownu PER1 byly myši Per1 siRNA a kontrolní siRNA obětovány 2 hodiny po testování a mozky byly bleskově zmraženy. Mozky byly koronálně rozřezány a z 500 μm řezů byly odebrány 1 mm DH razníky. Razníky byly homogenizovány v T-PER pufru (Thermo Fisher) s Halt proteázou a inhibitorem fosfatázy (Thermo Fisher) za použití homogenizéru Dounce. Proteinové lyzáty byly kvantifikovány pomocí modifikovaného Bradfordova testu (BioRad) a 50 ug celkového proteinového lyzátu bylo naneseno do každé dráhy 7,5% NuPAGE Bis-Tris gelu (Thermo Fisher). Gely běžely po dobu 50 minut při 200 voltech a bloty byly přeneseny přes noc při 15 V při 4 stupních na nitrocelulózové membrány (Novexi, LC2001). Následující den byly membrány inkubovány v blokovacím pufru po dobu 1 hodiny (5 procent odtučněného mléka v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku s 0,01 procenta Tween 20), promyty (0,1 procenta Tween 20 v TBS) a poté inkubovány v primární protilátce (1:500, králičí anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) v primárním protilátkovém pufru (3% BSA v TBS s 0,1% Tween) přes noc při 4 stupních. Membrány byly poté promyty a inkubovány v HRP-konjugované myší protilátce králíka (1:10, 000, Jackson Laboratories, specifické pro lehký řetězec, #211-032-171) po dobu 1 hodiny. Membrány byly promyty a vyvinuty pomocí chemiluminiscenčního substrátu Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Pro ověření linearity bylo použito vícenásobné filmové expozice. Bloty byly promyty a stripovány po dobu 10 m pomocí Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), znovu promyty a poté znovu sondovány přes noc (4 stupně) králičí protilátkou proti GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778 ). Bloty PER1 a GAPDH plné délky jsou uvedeny na doplňkovém obrázku 5. Relativní optické hustoty byly vypočteny z naskenovaného filmu pomocí ImageJ (Národní institut zdraví USA) experimentátorem slepým k experimentálním podmínkám. Všechny hodnoty byly normalizovány na hladiny exprese GAPDH.

qRT-PCR. Tkáň byla odebrána z DH raznic (popsaných výše) a zmražena na -80 stupňů až do zpracování. RNA byla izolována pomocí RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) a cDNA byla vytvořena pomocí soupravy Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, 04379012001). Primery a sondy byly odvozeny z Roche Universal ProbeLibrary (tabulka S4) a byly použity pro multiplexování ve stroji Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Všechny hodnoty byly normalizovány na Gapdh. Analýzy a statistiky byly provedeny s využitím proprietárních algoritmů Roche a softwaru REST 2009 založeného na metodě Pfafffl52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 bylo zahrnuto do naší analýzy. Knihovny cDNA pro každou skupinu byly připraveny podle TruSeq RNA Sample Preparation Guide (Illumina). Dvě stě padesát nanogramů celkové RNA z každé myši bylo purifikováno pomocí poly-T oligo-připojených magnetických kuliček a tepelně fragmentováno. Poté byl syntetizován a purifikován první a druhý řetězec cDNA. Poté, co byly konce zatupeny, byl 3' konec adenylován, aby se zabránilo zřetězení templátu během ligace adaptéru. Pro každou skupinu byla na konce cDNA přidána jedinečná sada adaptérů a knihovny byly amplifikovány pomocí PCR. Kvalita knihovny byla hodnocena Bioanalyzerem a kvantifikována pomocí qRT-PCR se standardní křivkou připravenou z komerční sekvenační knihovny (Illumina). Vzorky byly multiplexovány, přičemž každá behaviorální skupina byla zastoupena v každé průtokové buňce sekvenátoru. 10 nM každé knihovny bylo shromážděno ve čtyřech multiplexních knihovnách a sekvenováno na přístroji Illumina HiSeq 2500 během jednoho čtení 50 bp sekvenování, provozovaného Genomic High-throughput Facility na University of California, Irvine. Výsledná sekvenační data pro každou knihovnu byla následně zpracována za účelem vytvoření souborů FastQ. Data byla poté demultiplexována a filtrována pomocí softwaru Illumina CASAVA 1.8.2 a také vlastního softwaru. Z analýz byly odstraněny údaje nízké kvality (neprospěly standardní testy kvality společnosti Illumina) a kontrolní údaje úspěšně zarovnané s kontrolním genomem PhiX. Kvalita zbývajících sekvencí byla dále hodnocena pomocí skóre kvality PHRED vytvořených v reálném čase během kroku základního volání běhu sekvenování (doplňkový obrázek 3a).

Zarovnání k referenčnímu genomu a transkriptomu. Hodnoty z každého experimentu byly odděleně porovnány s referenčním genomem a odpovídajícím transkriptomem pomocí zarovnávačů pro krátké čtení ELAND v2e (Illumina) a Bowtie24. Do transkriptomu byla zahrnuta čtení jedinečně zarovnaná oběma nástroji se známými exony nebo sestřihovými spoji s ne více než dvěma neshodami na jakémkoli 25 bp fragmentu čtení. Čtení jedinečně zarovnané, ale s více než dvěma neshodami na jakémkoli 25 bp fragmentu čtení byly z analýz odstraněny. Podobně byly z analýzy odstraněny hodnoty odpovídající několika umístěním v referenčním genomu. Procento čtení přiřazených referenčnímu genomu a transkriptomu pomocí tohoto protokolu je uvedeno pro každou skupinu replikátů (doplňkový obrázek 3b). To vedlo v průměru k přibližně 30 milionům čtení na vzorek.

Pro ověření přítomnosti plazmidů pLVX a CRISPR-SAM po lentivirové infuzi jsme provedli sekvenování RNA na vzorcích hipokampu z podskupiny tří zvířat na skupinu podle chování. Protože počet buněk infikovaných lentiviry in vivo byl příliš malý na to, aby spolehlivě detekoval přítomnost příslušných transkriptů pomocí RT-qPCR (doplňkový obr. 6a, d), použili jsme RNA-seq jako citlivější metodu k detekci přítomnosti těchto přepisů. Aktualizovaná verze sestavení genomu a anotace genomu byly vytvořeny připojením sekvencí a anotace plasmidových konstruktů k původnímu myšímu genomu mm10 a k anotaci myšího genomu mm10, v daném pořadí. Pomocí nástroje pro zarovnání čtení TopHat v Tuxedo Suite54 byla čtení mapována do genomu a pouze zásahy, které byly jedinečné pro plasmidové transkripty ve srovnání s endogenním myším referenčním genomem, byly považovány za "odpovídající čtení" k plasmidovým konstruktům. Počet těchto odpovídajících čtení byl poté kvantifikován pro každý konstrukt pro každý vzorek.

Genová exprese a diferenciální analýza. Hladiny genové exprese byly přímo vypočítány z výsledků přečteného seřazení pro každý replikát. Standardní hodnoty RPKM55, čtení na kilobázi exonového modelu na milion mapovaných čtení) byly extrahovány pro každý gen pokrytý sekvenačními daty a každý replikát použitý v této studii.

Diferenciální transkripční analýzy byly provedeny pomocí Cyber ​​T56,57 napříč každým párem skupin (domácí klec versus 60 m po tréninku), aby se identifikovaly geny s regulací nahoru nebo dolů po OLM. Kromě 18-měsíců starých myší HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox trénovaných pro současnou studii byla identicky zpracována data o sekvenování RNA od {{10}}měsíců starých myší divokého typu C57 ( homecage a OLM-trénovaný stejným způsobem jako současná studie) z předchozí studie20 byl použit pro diferenciální analýzy. Počet zvířat (biologické replikáty) pro každou skupinu byl: mladý HDAC plus / plus HC: 6, mladý HDAC3 plus / plus OLM: 6, starý HDAC3 plus / plus HC: 6, starý HDAC3 plus / plus OLM: 6, starý HDAC3flox/flox HC: 8, staré HDAC3flox/flox OLM: 8. Nebyly použity žádné technické repliky. Prahová hodnota p použitá pro stanovení diferenciální exprese je 0,05 pro všechny skupiny. Falešná míra zjišťování (FDR) měřená Benjamini & Hochberg (BH) q-hodnotou byla použita ke korekci pro vícenásobné testování, s prahem FDR 0,15. Soubory genů upregulovaných po zkušenosti (ve srovnání s domácí klecí) pro tyto 3 skupiny (mladý divoký typ, stárnoucí HDAC plus/plus nebo stárnoucí HDAC3flox/flox) byly protnuty, aby se určily geny společné dvěma nebo více skupinám. Obohacení každé skupiny pro tkáňově specifickou expresi, termíny genové ontologie58 a KEGG dráhy59,60 bylo hodnoceno pomocí DAVID61 na základě odlišně exprimovaných genů po chování. Vizualizace dat byla provedena pomocí "matplotlib" pro python a "ggplot" pro R.

Imunoprecipitace chromatinu. ChIP byla provedena na DH raznicích na základě protokolu ze sady Millipore ChIP11,12,62. Tkáň byla zesítěna 1% formaldehydem (Sigma), lyžována a sonikována a chromatin byl přes noc imunoprecipitován pomocí 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) nebo 4 ul anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) nebo ekvivalentní množství normálního králičího séra (H4K8Ac negativní kontrola, Millipore) nebo anti-myší IgG (HDAC3 negativní kontrola, Millipore). Po promytí byl chromatin eluován z kuliček a reverzně zesíťován v přítomnosti proteinázy K před čištěním DNA na koloně. Sekvence primerů pro promotory každého genu byly navrženy programem Primer 3 (tabulka S4). Pět ul vstupního imunoprecipitátu anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG nebo anti-králičí/myší IgG z každého zvířete bylo zkoumáno v duplikátech. Pro normalizaci dat ChIP-qPCR jsme použili metodu procentního vstupu. Vstupní vzorek byl upraven na 100 procent a vzorky IP i IgG byly vypočteny jako procento tohoto vstupu pomocí vzorce 100*AE^(upravený vstup – Ct(IP)). Násobné obohacení bylo poté vypočteno jako poměr ChIP k průměrnému IgG. Standardní křivka na destičce určila účinnost amplifikace (AE).

Příprava řezu a záznam. Mladým (přibližně 3-měs.) a stárnoucím (18-měs.) myším byl virus stereotaxicky infuzován. Pro první experiment byly mladým a starým myším HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox podány infuzí AAV-CaMKII-Cre bilaterálně do DH. Pro druhý experiment byl mladým a starým myším C57 divokého typu podán infuzí AAV-HDAC3(Y298H) do DH jedné hemisféry a kontrola AAV-EV do druhé hemisféry. Dva týdny po infuzi (aby byla umožněna optimální exprese viru)2 byly řezy příčného hipokampu (320 μm) umístěny do komory pro záznam rozhraní s předehřátou (31 ± 1 stupeň) umělou mozkomíšní tekutinou (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2P04, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 a 10 mM D-glukózy). Řezy byly nepřetržitě promývány rychlostí 1,75–2 ml za minutu, zatímco povrch řezů byl vystaven teplému, zvlhčenému 95 % O2/5 % CO2. Záznamy začaly po alespoň 2 hodinách inkubace.

Polní excitační postsynaptické potenciály (fEPSP) byly zaznamenány z CA1b stratum radiatum pomocí jediné skleněné pipety (2–3 MΩ) naplněné 2 M NaCl. Stimulační pulzy (0.05 Hz) byly dodány do Schafferových kolaterálně-komisurálních projekcí pomocí bipolární stimulační elektrody (kroucený nichromový drát, 65 μm) umístěné v CA1c. Intenzita proudu byla upravena tak, aby bylo dosaženo 50 procent maximální odpovědi fEPSP. Poté, co byla stanovena stabilní základní linie, byl LTP indukován jediným sledem pěti theta vzplanutí, ve kterých byl každý impuls (čtyři pulsy při 100 Hz) dodán s odstupem 200 ms (tj. na frekvenci theta). Intenzita stimulace nebyla během TBS zvýšena. Data byla shromážděna a digitalizována systémem NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Statistická analýza. Statistické analýzy byly provedeny tak, jak je uvedeno v textu a legendách obrázků pomocí Prism 6 (GraphPad). Naše analytické přístupy jsou založeny na dříve publikovaných pracích12,20,63,64. K předurčení velikostí vzorků nebyly použity žádné statistické metody, ale naše velikosti vzorků jsou podobné těm, které se obecně používají v této oblasti, včetně těch, které byly uvedeny v předchozích publikacích12, 20, 64, 65. Předpokládá se, že distribuce dat je normální, s podobným rozptylem pozorovaným mezi skupinami, ale toto nebylo formálně testováno. Když měl experiment k porovnání dvě skupiny, byly použity dvoustranné Studentovy t-testy. Když byly porovnány dva faktory (jako je věk a genotyp nebo relace a skupina), data byla analyzována pomocí dvoucestných ANOVA následovaných Sidakovým vícenásobným srovnáním post hoc testy. Všechny analýzy jsou dvoustranné, s hodnotou 0,05 požadovanou pro významnost. Chybové úsečky na všech obrázcích představují SEM. Pro všechny experimenty byly hodnoty ± 2 SD od skupinového průměru považovány za odlehlé a byly z analýz odstraněny.

Dostupnost dat. Údaje podporující zjištění této studie jsou k dispozici od odpovídajícího autora na odůvodněnou žádost. Údaje o sekvenování RNA byly uloženy v NCBI Gene Expression Omnibus a jsou přístupné prostřednictvím přístupového čísla GEO Series GSE94832.

Reference

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Epigenetické změny v suprachiasmatickém jádře a hippocampu přispívají k poklesu kognitivních funkcí souvisejícím s věkem. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Cirkadiánní rytmy a formování paměti. Nat. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL a kol. Cirkadiánní oscilace aktivity hipokampální MAPK a cAmp: důsledky pro perzistenci paměti. Nat. Neurosci. 11, 1074–1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Cirkadiánní modulace učení a paměti u myší podmíněných strachem. Chovej se. Brain Res. 133, 95-108 (2002).

5. Kondratová, AA & Kondratov, RV Denní hodiny a patologie stárnoucího mozku. Nat. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Období 1 ohraničuje cirkadiánní modulaci paměťově relevantní signalizace v myším hipokampu regulací nukleárního kyvadlového pohybu CREB kinázy pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Epigenetická hypotéza kognitivní dysfunkce související se stárnutím. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. a kol. Změněná acetylace histonů je spojena s věkem závislým poškozením paměti u myší. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. a kol. Inhibice H3K9me3 zlepšuje paměť, podporuje tvorbu páteře a zvyšuje hladiny BDNF ve starém hipokampu. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Epigenetické příspěvky ke kognitivnímu stárnutí: oddělování délky mysli a délky života. Naučte se Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. a kol. Selektivní inhibitor HDAC3-umožňuje trvalé vymírání chování při vyhledávání kokainu. Proč. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL a kol. Kontext a sluchový strach jsou diferencovaně regulovány aktivitou HDAC3 v laterálních a bazálních subnukleech amygdaly. Neuropsychopharmacology 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC a kol. HDAC3 je kritický negativní regulátor tvorby dlouhodobé paměti. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM a kol. Inhibice histondeacetylázy prostřednictvím RGFP966 uvolňuje brzdy senzorické kortikální plasticity a specifičnosti tvorby paměti.J. Neurosci. 35, 13124–13132 (2015).

15. Lahm, A. a kol. Odhalení skryté katalytické aktivity histondeacetyláz třídy IIa obratlovců. Proč. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335– 17340 (2007).

16. Sun, Z. a kol. Funkce HDAC3 v transkripci a metabolismu nezávislá na deacetyláze vyžaduje korepresor jaderného receptoru. Mol. Cell 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. a kol. Odlišné role deacetylázové domény HDAC3 v hipokampu a mediálním prefrontálním kortexu při tvorbě a zániku paměti. Neurobiol. Učit se. Mem. 145, 94–104 (2017).

18. Nott, A. a kol. Histon deacetyláza 3 se spojuje s MeCP2 a reguluje FOXO a sociální chování. Nat. Neurosci. 19, 1497–1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histonová deacetyláza 3 je nezbytná pro správný vývoj mozku. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. a kol. Regulační podjednotka chromatinu BAF53b specifická pro neurony je nezbytná pro synaptickou plasticitu a paměť. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Transkripční faktory v dlouhodobé paměti a synaptická plasticita. Physiol. Rev. 89, 121–145 (2009).

22. Barnes, CA Dlouhodobá potenciace a stárnutí mozku. Philos. Trans. R. Soc. Londýn. B 358, 765-772 (2003).

23. Speir, ML a kol. Databáze UCSC Genome Browser: aktualizace 2016. Nucleic Acids Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Ultrarychlé a paměťově efektivní zarovnání krátkých sekvencí DNA k lidskému genomu. Genome Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB a kol. Analýzy hipokampální exprese odhalují selektivní asociaci okamžitých, časných, neuroenergetických a myelinogenních drah s kognitivní poruchou u starých potkanů. J. Neurosci. 27, 3098-3110 (2007).

26. McNulty, SE a kol. Rozdílné role pro Nr4a1 a Nr4a2 v umístění objektu vs. v dlouhodobé paměti rozpoznávání objektů. Naučte se Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Účinky spánkové deprivace a stárnutí na dlouhodobou a vzdálenou paměť u myší. Naučte se Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. a kol. PERIOD1 koordinuje hipokampální rytmy a zpracování paměti s dnem. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. a kol. Časová dynamika exprese genu myších hipokampálních hodin podporuje zpracování paměti. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Cirkadiánní oscilace v hipokampu podporují tvorbu paměti a vytrvalost. Přední Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Genová exprese závislá na zkušenostech v potkaním hipokampu po prostorovém učení: srovnání bezprostředně raných genů Arc, c-fos a zif268. J. Neurosci. 21, 5089-5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Chromatinové modifikace a jejich funkce. Cell 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. a kol. Transkripční aktivace na úrovni genomu vytvořeným komplexem CRISPR-Cas9. Příroda 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Inhibice histonové deacetylázy 3 obnovuje synaptické značení a zachycení při stárnutí prostřednictvím aktivace nukleárního faktoru kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramář, EA a kol. Synaptické důkazy o účinnosti prostorového učení. Proč. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM a kol. Hippokampální fokální knockout CBP ovlivňuje specifické modifikace histonů, dlouhodobou potenciaci a dlouhodobou paměť. Neuropsychopharmacology 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Zvýšená dlouhodobá potenciace na buněčných synapsích dentátních granulí mediální-perforantní dráhy indukovaná selektivní inhibicí histondeacetylázy 3 vyžaduje protein mentální retardace Fragile X. Neurobiol. Učit se. Mem. 114, 193–197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB a paměť. Annu. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Funkční role CREB jako pozitivního regulátoru při tvorbě a posilování paměti. Brain Res. Býk. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Gen kódující fragilní protein vázající RNA X je řízen nukleárním respiračním faktorem 2 a rodinou transkripčních faktorů CREB. Nucleic Acids Res. 34, 1205–1215 (2006).

41. Wang, H. a kol. Role CREB v regulaci FMRP metabotropními glutamátovými receptory skupiny I v cingulárním kortexu. Mol. Mozek 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Změněné behaviorální rytmy a exprese hodinového genu u myší s cílenou mutací v genu Period1. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. a kol. Změny metylace DNA v genech plasticity doprovázejí tvorbu a udržování paměti. Nat. Neurosci. 19, 102–110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Epigenomická reorganizace v hippocampu závislá na zkušenostech. Naučte se Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Hodinový gen, tečka, hraje klíčovou roli při tvorbě dlouhodobé paměti u Drosophila. Proč. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058–16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Kokainová senzibilizace a odměna jsou pod vlivem cirkadiánních genů a rytmu. Proč. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Denní oscilace aktivit MAP (mitogenem aktivovaný protein) kinázy a adenylyl cyklázy v hippocampu závisí na suprachiasmatickém jádře. J. Neurosci. 31, 10640–10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Zkoumání umístění objektů a paměti rozpoznávání objektů u myší. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. a kol. Cirkadiánní hodiny ve ventromediálním hypotalamu řídí cyklický energetický výdej. Cell Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotypizace cirkadiánních rytmů u myší. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Snížení autofluorescence podobné lipofuscinu ve fluorescenčně značené tkáni. J. Histochem. Cytochem. 47, 719-730 (1999).

52. Pfafffl, MW Nový matematický model pro relativní kvantifikaci v reálném čase RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).

53. Pfafffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Softwarový nástroj pro relativní expresi (REST) ​​pro skupinové srovnání a statistickou analýzu výsledků relativní exprese v PCR v reálném čase. Nucleic Acids Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. a kol. Diferenciální analýza genové a transkriptové exprese experimentů RNA-seq s TopHat a Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapování a kvantifikace savčích transkriptomů pomocí RNA-Seq. Nat. Metody 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Webový server Cyber-T: diferenciální analýza dat s vysokou propustností. Nucleic Acids Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Bayesovský rámec pro analýzu dat exprese mikročipů: regularizovaný t-test a statistické závěry o změnách genů. Bioinformatics 17, 509–519 (2001).