ČÁST 2: Polysacharid Cistanche Deserticola inhibuje OVX-indukovaný úbytek kostní hmoty u myší a RANKL-indukovanou osteoklastogenezi

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Osteoporóza je závažné onemocnění kostí postihující stárnoucí populaci. Bylo prokázáno, že Cistanche deserticola (CD), tonikum a léčivá potravina široce používaná v Číně, poskytuje účinnou léčbu osteoporózy.Polysacharid Cistanche deserticola(CDP), extrahovaný z CD, má různé farmakologické vlastnosti, ale jeho role při tvorbě a funkci osteoklastů, stejně jako osteoporóza, zůstává neznámá. Účelem této studie bylo extrahovat a purifikovat CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)dále prozkoumat jeho potenciální mechanismus účinku na osteoporózu. Výsledky ukázaly, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola) léčba zabránila osteoporóze vyvolané OVX a zlepšila ztrátu kostní hmoty potlačením aktivity a funkce osteoklastů. Dále CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba významně inhibovala RANKL-indukovanou osteoklastogenezi. kostní resorpce a genová exprese specifická pro osteoklasty. Mechanicky, CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)inhibovaly RANKL-indukovanou aktivaci signálních drah NF-xB a MAPKs a následně ovlivnily downstream aktivaci NEATcl. Zjištění v této studii naznačují, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)je potenciálně bezpečný lék pro léčbu osteoporózy.

Léčba osteoporózy: Polysacharid Cistanche Deserticola

KLIKNĚTE ZDE, ABY STE KORÁLI PRAT 1

3. Výsledky

3.1. CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)zabraňuje OVX-indukovanému úbytku kostní hmoty in vivo

Ke zkoumání účinků CDP jsme použili myší model osteoporózy indukované OVX(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba osteoporózy in vivo. Ve srovnání se skupinou Sham se tělesná hmotnost OVX myší významně zvýšila, zatímco uterinní index se snížil, což ukazuje, že model osteoporózy byl zkonstruován úspěšně (obr. 1B a D). micro-CT analýza tibií ve skupině OVX ukázala rozsáhlou kostní ztrátu. Ve srovnání se skupinou OVX se počet kostních trámců zvýšil ve skupině CDP-L, zatímco nárůst ve skupinách CDP-H a E2 byl významnější a trámčiny v posledních dvou skupinách zhrubly a mezera se zmenšila. Kvantitativní analýza potvrdila, že několik kostních histomorfometrických parametrů, včetně BMD, BV/TV, BS/TV a Tb. N měl významně zvýšené hodnoty, zatímco Tb. Sp vykazoval snížené hodnoty ve skupině CDP-H (obr. 1E a F). Histopatologické vyšetření pomocí H&E barvení odhalilo, že počet kostních trámců ve skupinách CDP-H a E2 byl významně vyšší než ve skupině OVX, zatímco ve skupině CDP-L nedošlo k žádnému významnému zlepšení (obr. 1G). Navíc barvení TRAcP ukázalo, že počet osteoklastů se výrazně zvýšil ve skupině OVX, ale snížil se ve skupinách CDP-H a E2 (obr. 1H). Skupiny CDP-L, CDP-H a E2 vykazovaly inhibici OVX-indukovaného zvýšení obsahu P, ale zvýšily obsah Ca v krevním séru. Markery kostní absorpce, RANKL a TRAcP-5b, vykazovaly klesající trend v CDP-L.

3.2. CDP(Polysacharid Cistanche deserticola) potlačuje RANKL-indukovanou osteoklastogenezi in vitro

Sledovali jsme buněčnou proliferaciCDP-léčené BMM pomocí dlouhodobého dynamického zobrazovacího analyzátoru živých buněk v reálném čase. Ve srovnání s kontrolní skupinou, konfluence buněk vCDP-léčené skupiny se v dávce nezměnily<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)na osteoklastogenezi indukovanou RANKL byly BMM stimulovány RANKL a M-CSF v přítomnostiCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 ug/mlCDP(Polysacharid Cistanche deserticola)vykazovaly výrazně sníženou velikost a počet. Tyto výsledky ukázaly, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)účinně inhibovaly očekávanou RANKL-indukovanou osteoklastogenezi, aniž by ovlivnily životaschopnost buněk.

3.3. CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)inhibuje RANKL-indukovanou aktivitu osteoklastické resorpce a expresi genu specifickou pro osteoklasty

Dále jsme určili účinky CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)ošetření kostní resorpční aktivity osteoklastů pomocí hydroxyapatitem potažených destiček. Kostní resorpce je hlavní funkcí a standardem pro měření aktivity a schopnosti osteoklastů (Novack & Faccio, 2011). Výsledky ukázaly, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)může významně snížit kostní resorpční plochu osteoklastů v závislosti na dávce, což ukazuje na CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)inhibovala aktivitu kostní resorpce indukovanou RANKL (obr. 3A a B). Konkrétně osteoklastická kost resorpční plocha se snížila na přibližně 6,3 procenta po léčbě 10 µg/ml CDP(Polysacharid Cistanche deserticola). Abychom lépe zjistili překážku CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)na osteoklastogenezi jsme měřili transkripční hladiny genů souvisejících s osteoklasty. Bez léčby CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)indukce pomocí RANKL podpořila expresi genů NFATcl, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 a Mmp9. Naopak, současná aplikace CDP a RANKL významně down-regulovala těchto pět genů.

3.4. CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)inhibuje RANKL-indukovanou aktivaci NFATcl

Barvení TRAcP odhalilo, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba významně snížila očekávaný nárůst počtu zralých osteoklastů po stimulaci RANKL po dobu 3–7 dnů (obr. 4A a B). Dále jsme zkoumali, zda léčba CDP může účinně narušit diferenciaci osteoklastů inhibicí exprese NFATc1. Výsledky ukázaly, že NFATc1 byl vysoce exprimován po stimulaci RANKL po dobu 5 dnů, což bylo významně inhibováno po CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)ošetření (obr. 4C a D). Kromě toho léčba CDP potlačila hladiny exprese CTSK, proteinu potřebného pro normální tvorbu a funkci osteoklastů (Bossard et al., 1996) (obr. 4E a F). Vybrali jsme reprezentaci bod v čase stimulace RANKL po dobu 5 dnů, abychom dále prozkoumali účinek 10 µg/ml CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba na translokaci NFATc1. Jak se očekávalo, CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba významně inhibovala RANKL-indukovanou NFATc1 jadernou translokaci.

3.5. CDP(Polysacharid Cistanche deserticola) inhibuje RANKL-indukovanou aktivaci signálních drah NF-KB a MAPKs

Abychom objasnili mechanismy zapojené do CDP-indukované inhibice diferenciace osteoklastů, zkoumali jsme dopad CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba na drahách NF-KB a MAPKs. Výsledky ukázaly, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba měla supresivní účinky na degradaci IκB a fosforylaci p65 v závislosti na dávce. Fosforylace tří členů rodiny MAPK, konkrétně extracelulární signálem regulovaná kináza (ERK), c-Jun N-terminální kináza (JNK) a p38, byly upregulovány.

Cistanche Deserticola

4. Diskuze

Osteoporóza je běžné a degenerativní onemocnění kostí. V současné době existuje mnoho léků chemické syntézy používaných v klinické léčbě osteoporózy, jako je estrogen a bisfosfonát. Dlouhodobé užívání těchto léků však postupně oslabí klinickou účinnost a dokonce způsobí mnoho závažných vedlejších účinků, včetně zvýšeného rizika rakoviny vaječníků, prsu a endometria a osteonekrózy čelisti (Beral, 2003; Khan et al., 2009; Lacey a kol., 2002). V této studii jsme vybrali CDP(Polysacharid Cistanche deserticola), účinná složka extrahovaná z CD, jako terapeutické činidlo a prokázala, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)měl ochranný účinek proti

úbytek kostní hmoty u OVX myší a inhiboval tvorbu a funkci osteoklastů indukovanou RANKL. Mezitím, podle teorie "ledviny řídící kost" tradiční čínské medicíny, je ztráta kostní hmoty připisována nedostatkům ledvin. Bylo prokázáno, že CD jako léčivá potravina tonizující ledviny poskytuje účinnou léčbu osteoporózy (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li a Zhang, 2016). Tedy CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)extrahovaný z této přírodní byliny je lepší a bezpečnější léková varianta.

V současné době je myší model OVX klasickým modelem postmenopauzálního úbytku kostní hmoty u žen, který zkoumá příčiny úbytku kostní hmoty a provádí intervenci (Wehrle et al., 2015). V souladu s tím jsme provedli bilaterální ooforektomii na samicích myší C57BL/6J, abychom vytvořili model osteoporózy. V předchozích studiích byly dávky CDP podávané zvířatům 50–200 mg/kg (nízká dávka) a 1800 mg/kg (vysoká dávka) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Zde je vysoká dávka CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)u myší byla 600 mg/kg, což bylo založeno na vysoké klinické dávce 30 g CD v odvaru; je tedy podobný současné klinické praxi. V této studii léčba CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)významně inhiboval OVX-indukovaný nárůst tělesné hmotnosti, což je běžný jev pozorovaný u OVX myší (Davis et al., 2019). Použitím mikro-CT skenování a 3D rekonstrukce jsme zjistili, že OVX vedlo ke znatelnému snížení BMD, BV/TV, BS/TV a Tb. N a zvýšení Tb. Sp, zatímco léčba CDP zvrátila všechny tyto změny. Zejména ve srovnání s pozitivním lékem by CDP mohla významně zlepšit BMD myší OVX, což je důležitý marker kvality kostí a používá se k vyjádření stupně osteoporózy (Fuggle et al., 2019), což naznačuje, že CDP má výhodu nad pozitivním lékem při zlepšování BMD. Kromě toho histologické výsledky ukázaly, že léčba CDP by mohla snížit zvýšené množství TRAcP-pozitivních osteoklastů indukované OVX. Tyto výsledky naznačují, že podávání CDP účinně zmírnilo ztrátu kostní hmoty u osteoporózy indukované OVX, pravděpodobně inhibicí tvorby osteoklastů. V souladu s výše uvedenými výsledky jsme zjistili, že CDP v závislosti na dávce inhibuje tvorbu a funkci osteoklastů indukovanou RANKL, zatímco CDP má v našich experimentech in vitro malý účinek na proliferaci prekurzorových buněk osteoklastů indukovanou M-CSF.

Vazba RANKL a RANK může vést k náboru TRAF6 a následné aktivaci několika downstream signálních drah, jako jsou NF-KB a MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). Signální dráha NF-κB hraje důležitou roli v regulaci diferenciace osteoklastů a umlčení genů kódujících klíčové proteiny v této dráze může vést k abnormálnímu vývoji kostí (Leibbrandt & Penninger, 2008). Je dobře známo, že NF-KB je přítomen v cytoplazmě nestimulovaných buněk v komplexu s IkB, ale po stimulaci RANKL rychle vstupuje do jádra (Boyle et al., 2003). Uvolněný IκB je pak rychle degradován, zatímco NF-κB aktivuje specifickou genovou transkripci, čímž podporuje diferenciaci, zrání a apoptózu osteoklastů (Abdelmagid et al., 2015). V této studii výsledky ukázaly, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)léčba potlačila RANKL-indukovanou aktivaci NF-κB signální dráhy, jak bylo prokázáno inhibicí degradace IκB a fosforylací p65 způsobem závislým na dávce, což může zahrnovat jeho antiosteoklastogenní účinek. Kromě toho se signální dráha MAPK, včetně ERK, JNK a p38, úzce podílí na osteoklastogenezi indukované RANKL (Li et al., 2002). Kromě toho mohou dominantní inhibitory p38 a JNK zabránit osteoklastogenezi indukované RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), zatímco ERK hraje významnou roli v přežití osteoklastů (Miyazaki et al., 2000). Je dobře známo, že RANKL aktivuje signální dráhu MAPK zvýšením fosforylace ERK, JNK a p38 (Mizukami et al., 2002). V naší studii jsme prokázali, že CDP potlačil RANKL-indukovanou fosforylaci klíčových proteinů v signální dráze MAPK. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že inhibice aktivace signálních drah NF-KB a MAPK přispívá k inhibičnímu účinku CDP proti osteoklastogenezi.

Aktivace signálních drah NF-KB a MAPK podporuje expresi několika klíčových transkripčních faktorů, jako je buněčný onkogen fos, aktivátorový protein 1 a NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, důležitý člen rodiny NFAT, se podílí na diferenciaci terminálních osteoklastů jako hlavní regulátor transkripce (Asagiri et al., 2005). Bylo hlášeno, že embryonální kmenové buňky s deficitem NFATc{7}} se nemohou pod stimulací RANKL diferencovat na osteoklasty a ektopická exprese NFATc1 způsobuje, že prekurzorové buňky podstupují diferenciaci a obcházejí signalizaci RANKL, což naznačuje, že NFATc1 má kritickou roli v diferenciace osteoklastů (Takayanagi et al., 2002). Výsledky naší studie prokázaly supresivní účinek CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)na expresi NFATc1 a jeho následného proteinu CTSK. Je zajímavé, že jsme pozorovali, že hladina proteinové exprese NFATc1 se nejprve zvýšila a poté snížila, přičemž nejvyšší hladiny dosáhla 5. den po stimulaci RANKL. To bylo v souladu s výsledky Baek et al. (2014), kteří pozorovali M-CSF-indukovanou degradaci NFATc1 během pozdního stádia osteoklastogeneze prostřednictvím Cbl-indukované ubikvitinace NFATc1 způsobem závislým na Src kináze. Výsledky imunofluorescenčního testu konzistentně podporovaly inhibiční účinek CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)na aktivaci transkripce NFATc1. Kromě toho geny specifické pro osteoklasty, včetně CTSK, Acp5, Mmp9 a Atp6v0d2, jsou všechny regulovány přímo NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), byly potlačeny pomocí CDP. Tato zjištění ilustrují, že NFATc1 je cílem inhibičního účinku CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)na signálních drahách NF-KB a MAPKs.

Polysacharid Cistanche deserticola

5. Závěr

V souhrnu jsme extrahovali a purifikovali aktivní polysacharid z CD a prokázali, že CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)vykazovaly ochranný účinek na osteoporózu indukovanou OVX a zmírňovaly ztrátu kostní hmoty potlačením aktivity a funkce osteoklastů. Dále CDP(Polysacharid Cistanche deserticola)může inhibovat RANKL-indukovanou diferenciaci a funkci osteoklastů tím, že interferuje se signálními cestami NF-KB a MAPKs a následně ovlivňuje downstream aktivaci NFATc1. Závěrem lze říci, že naše zjištění poskytují základ pro rozšíření a aplikaci CDP v léčbě osteoporózy.

Reference

1. Abdelmagid, SM, Sondag, GR, Moussa, FM, Belcher, JY, Yu, B., Stinnett, H., … Safadi, FF (2015). Mutace v osteoaktivinu podporuje aktivátor receptoru pro diferenciaci a přežití osteoklastů zprostředkovanou ligandem NFkappaB (RANKL), ale inhibuje funkci osteoklastů. Journal of Biological Chemistry, 290(33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.

2. Baek, JM, Kim, JY, Cheon, YH, Park, SH, Ahn, SJ, Yoon, KH, … Lee, MS (2014). Aconitum pseudolaeve var. erectum inhibuje aktivátor receptoru jaderného faktoru kappa-B ligandem indukovanou osteoklastogenezi prostřednictvím c-Fos/nukleárního faktoru aktivovaných T-buněk, cytoplazmatické 1 signální dráhy a zabraňujepolysacharid- indukovaná ztráta kostní hmoty u myší. Molekuly, 19(8), 11628–11644. https://doi.org/ 10.3390/molecules190811628.

3. Black, DM, Bauer, DC, Schwartz, AV, Cummings, SR, & Rosen, CJ (2012). Pokračující léčba bisfosfonáty proosteoporózapro koho a na jak dlouho? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.

4. De Martinis, M., Di Benedetto, MC, Mengoli, LP, & Ginaldi, L. (2006). Senilníosteoporóza: Je to imunitně podmíněné onemocnění? Inflammation Research, 55 (10), 399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.

5. Fuggle, NR, Curtis, EM, Ward, KA, Harvey, NC, Dennison, EM, & Cooper, C. (2019). Predikce zlomenin, zobrazování a screeningosteoporóza. Nature Reviews Endocrinology, 15(9), 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.

6. Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., … Zeng, Q. (2020).Polysacharid Cistanche deserticolaindukuje melanogenezi v melanocytech a snižuje oxidační stres prostřednictvím aktivace dráhy NRF2/HO-1. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 24(7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.

7. Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, EJ, Kim, HJ, Kim, HM, … Kim, HH (2006). Diferenciace osteoklastů vyžaduje TAK1 a MKK6 pro indukci NFATc1 a transaktivaci NF- kappaB pomocí RANKL. Cell Death & Differentiation, 13(11), 1879–1891.

8. Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., … Xu, J. (2019). Loureirin B potlačuje RANKL-indukovanou osteoklastogenezi a odstraňuje ovariektomiiosteoporózaprostřednictvím zeslabení aktivit NFATc1 a ROS. Teranostika, 9(16), 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.

9. Rachner, TD, Khosla, S., & Hofbauer, LC (2011).Osteoporóza: Nyní a budoucnost. Lancet, 377(9773), 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.

10. Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, JA, Compston, J., Cooper, C., McCloskey, EV, & Jonsson, B. (2011).Osteoporóza: Zátěž, poskytování zdravotní péče a příležitosti v EU: Zpráva připravená ve spolupráci s InternationalOsteoporózaNadace (IOF) a Evropská federace asociací farmaceutického průmyslu (EFPIA). ArchivyOsteoporóza, 6, 59–155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.

11. Identifikace a charakterizace apolysacharidz kořenů Morinda officinalis, jako induktor tvorby kosti up-regulací exprese cílových genů. International Journal of Biological Macromolecules, 133, 446–456.

12. Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., & Wu, D. (2018). Imunostimulační aktivita vodou extrahovatelnépolysacharidyz Cistanche deserticola jako rostlinné adjuvans in vitro a in vivo. PLoS One, 13(1), článek e0191356. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.

13. Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., … Tu, P. (2014). Extrakty z Cistanche deserticola mohou antagonizovat imunosenescenci a prodloužit životnost u myší náchylných k senescenci 8 (SAM-P8). Doplňková a alternativní medicína založená na důkazech, 2014(2), článek 601383. https://doi.org/10.1155/2014/601383.

14. Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C., & Yan, C. (2018).Anti-osteoporóza aaktivita románu Achyranthes Biden tatapolysacharidprostřednictvím stimulace tvorby kostí. Carbohydrate Polymers, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.

15. Zheng, H., He, B., Wu, T., Cai, J., & Wei, J. (2020). Extrakce, čištění a antiosteoporotická aktivita apolysacharidod Epimedium Maxim. in vitro. International Journal of Biological Macromolecules, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.

Doplňky stravy Cistanche deserticola