Část 2: Inhibitor NF-kB a agonista AMPK: Síťová predikce a integrace multi-omiks k odvození signálních cest pro akteosid proti Alzheimerově chorobě

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1 , Yuan-Yuan Shi2 , Xiao-Li Jiang1 , Shan-Shan Wu1 , Ping Zhou1 , Hui-Ying Wang1 , Ping Li1* a Fei Li1,2*

¹ Stát Klíč Laboratoř z Přírodní Léky, Čína Farmaceutický Univerzita, Nanjing, Čína, ² Vysoká škola z LÉKÁRNA,Lékařská univerzita Xinjiang, Urumqi, Čína

Alzheimerova choroba(AD) je nejčastějším typem demence.Akteosid(ACT) je sloučenina izolovaná zCistanche tubulosa, který má vynikající neuroprotektivní vlastnosti. Základní mechanismus ACT při regulaci polarizace mikroglií však zůstává špatně definován. Proto byl vytvořen model výpočetní sítě, který identifikuje hlavní cíle ACT a předpovídá jeho mechanismus integrací více dostupných databází. AlCl3-indukovaná AD(Alzheimerova choroba) byl úspěšně vytvořen model u larev zebry, aby se prokázala terapeutická účinnost ACT. Následně buňky BV-2 indukované LPS odhalily pozitivní roli ACT v polarizaci M1/M2. Dráhy NF-kB a AMPK byly dále potvrzeny transkriptomickou analýzou, metabolomickou analýzou, technikami molekulární biologie a molekulárním dokováním. Výzkum poskytl infuzní mechanismus ACT a odhalil souvislost mezi metabolismem a polarizací mikroglií z pohledu mitochondriální funkce. Ještě důležitější je, že poskytl systematický a komplexní přístup k objevu cílů léků, včetně změn v genech, metabolitech a proteinech.

klíčová slova: akteosid, BV-2 buňky, metabolismus, RNA-seq, mitochondrie, neurozánět

Pls klikněte zde pro část 1

Léčba proAlzheimerova chorobachoroba:Cistanche tubulosa

ACT Mitigated LPS-induced BV-2 Mitochondriální dysfunkce

Mitochondrie jsou jádrem metabolických drah. Vyvíjející se důkazy ukazují, že mitochondrie jsou klíčovým hráčem v mikrogliální polarizaci M1/M2. Přehled stavu mitochondrií v morfologii a buněčné distribuci byl posouzen pomocí TEM. Po stimulaci LPS byl chromatin buněk BV-2 kondenzován a cytoplazma a mitochondrie byly sníženy (obrázek 4A). Kromě toho byly mitochondriální kristy skupiny LPS neuspořádány nebo dokonce zmizely, vykazovaly částečnou kristolýzu, zmenšení velikosti a kulatou morfologii. Je zajímavé, že léčba ACT by mohla zmírnit LPS-indukované morfologické změny na mitochondriích. Postupně jsme zkoumalimitochondriální funkce buněk BV-2 ošetřených LPS, včetně produkce MMP a ATP. Produkce MMP (obrázek 4B) a ATP v mitochondriích (obrázek 4C) byly významně zlepšeny ve skupině ACT ve srovnání s těmi ve skupině LPS. Mitochondriální dysfunkce může souviset se zvýšenou hladinou ROS v buňce. Analýza průtokovou cytometrií odhalila, že obsah ROS byl přetížen ve skupině LPS (obrázek 4D). Naštěstí ACT odstranil nadměrné ROS. Naznačuje, že ACT může obnovit funkci mitochondrií odstraněním ROS.

ACT obnovila funkci mitochondrií prostřednictvím upregulace PGC-1 a UCP-2

Koaktivátor peroxisomového proliferativního receptoru-y-1a (PGC-1a) hraje důležitou roli v mitochondriální biogenezi (Bi et al., 2019). Stimulace LPS snížila expresi PGC-1a, projevující se mitochondriální dysfunkcí. Je pozoruhodné, že exprese mRNA genu PGC{7}} a proteinu byly významně zvráceny působením ACT v buňkách BV-2 ošetřených LPS (obrázek 4E).

Bylo také známo, že mitochondriální uncoupling protein-2 (UCP-2) reguluje mitochondriální funkci. Jako downstream protein PGC-1a může řídit LPS-indukovanou depolarizaci MMP a produkci ROS. Nedávné zprávy naznačují, že je zásadní pro proces mikrogliální aktivace s opačnou regulací polarizace M1 a M2 (De Simone et al., 2015). Výsledky Western blot ukázaly, že hladina proteinu UCP-2 byla po stimulaci LPS snížena. Společná léčba LPS a ACT by mohla zvýšit expresi UCP-2 ve srovnání s léčbou LPS. Hladina exprese mRNA UCP-2 také vykazovala podobné změny (obrázek 4F). Abych to shrnul, ACT obnovil funkci mitochondrií prostřednictvím upregulace PGC-1a a UCP-2.

ACT potlačená polarizace mikroglie M1 prostřednictvím aktivace AMPK

Jako klíčový senzor buněčné energie hraje proteinkináza aktivovaná AMP (AMPK) důležitou roli při udržování rovnováhy buněčného metabolismu. PGC-1a je zároveň následným proteinem AMPK. Jak je ukázáno v analýze síťového modelu, ACT může regulovat dráhu AMPK (obrázek 1B). Výsledky odhalily, že LPS inhibuje aktivaci AMPK, což vede k buňce

poruchy metabolismu a mitochondriální dysfunkce. Je pozoruhodné, že ACT by mohl v závislosti na dávce zvýšit expresi proteinu p-AMPK (obrázek 5A). Předpokládá se, že ACT může zvýšit expresi PGC-1a a obnovit mitochondriální funkci aktivací signální dráhy AMPK.

V této studii, aby se zjistilo, zda aktivace AMPK přispěla k regulačnímu účinku ACT na polarizaci M1/M2, byla k inhibici účinku AMPK použita sloučenina C (CC). Na rozdíl od snížené hladiny NO ve skupině léčené ACT, CC částečně blokoval účinek ACT na hladinu NO (obrázek 5B). Na základě těchto výsledků by ACT mohl regulovat M1/M2 polarizaci BV-2 buněk aktivací AMPK.

ACT Vazba na a inhibovaná NF-kB stejně jako aktivovaná AMPK

Molekulární dokování bylo použito pro potvrzení, zda se ACT váže na proteiny NF-kB a AMPKa. Zjištění ukázala, že vazebná energie ACT a NF-kB byla -8,4 kcal/mol, zatímco vazebná energie ACT a AMPKa byla -10,8 kcal/mol. Významné afinity potvrdily, že ACT se váže přímo na NF-kB a AMPKa (obrázky 5C, D, F, G). Následně byly dále zkoumány možné vazebné režimy a interakce v aminokyselinových kapsách, včetně 11 aminokyselinových zbytků NF-kB (obrázek 5E) a také 12 aminokyselinových zbytků AMPKa (obrázek 5H). Tyto výsledky ukázaly, že ACT může přímo ovlivňovat NF-kB a AMPKa, aby zeslabil polarizaci BV-2 mikroglie M1 a podpořil fenotyp M2.

Bylina cistanche

DISKUSE

Alzheimerova chorobaje progresivní neuronální a kognitivní dysfunkční onemocnění se složitými dysregulovanými mechanismy (Fakhri et al., 2020). Hromadné důkazy prokázaly, že existuje významná souvislost mezi zánětem mozku způsobeným mikrogliemi. Mikroglie jsou makrofágy v mozku (Afridi et al., 2020), které by mohly být aktivovány do klasického zánětlivého fenotypu M1, vyznačujícího se zvýšenou sekrecí prozánětlivých cytokinů (Hanslik a Ulland, 2020). V důsledku toho by nadměrná aktivace M1 mohla urychlit poškození neuronů a neurodegeneraci a dokonce zhoršit AD(Alzheimerova choroba)(Bagheri-Mohammadi, 2020). Je tedy nezbytné hledat nové terapeutické přístupy zaměřené na kontrolu polarizačních bodů mikroglií, aby byly zajištěny adaptivní výhody.

Naše předchozí práce ověřila, že ACT má významný vliv na zlepšení schopnosti učení a paměti a na ochranu neuronů u potkanů ​​(Chen Y. et al., 2020). Důsledně tato studie také prokázala, že ACT může zmírnit AlCl3-indukovanou dyskinezi a poruchu cholinergního systému u zebřiček. Vzrušeně ACT vykazoval pozoruhodné protizánětlivé aktivity v LPS-indukovaných BV-2 buňkách.

ACT potlačila polarizaci M1 inhibicí dráhy NK-kB. Kromě dráhy NF-kB, RNA-seq a HPLC-Q-TOF-MS analýza také zjistila, že léčba ACT by mohla ovlivnit biosyntézu argininu, stejně jako biosyntézu pantotenátu a CoA. Bylo široce publikováno, že iNOS může metabolizovat Arg na NO a citrulin, zatímco Arg-1 může hydrolyzovat Arg na ornitin a močovinu, které jsou spojeny s opravou neuronů (Rath et al., 2014). Stimulace LPS vedla k upregulaci iNOS (obrázek 2D) a downregulaci Arg-1 (obrázek 2E), což vedlo ke zvýšení hladiny NO (obrázek 2C). Data odhalila, že ACT zmírňuje zvýšenou hladinu NO

biosyntéza argininu.

Kyselina pantotenová (PA) je primárním substrátem pro pantothenátkinázu (Kumar et al., 2020) a metabolitem omezujícím rychlost v biosyntéze CoA. PA je obligátním prekurzorem acetyl-CoA, který je zvláště důležitý pro cholinergní neurony (Xu et al., 2020) a účastní se cyklu trikarboxylových kyselin (TCA) (Atamna, 2004). Nedávné studie ukázaly, že zvýšená koncentrace CoA by vedla ke změně morfologie mitochondrií a nižšímu obsahu ATP (Kumar et al., 2020). LPS-indukované BV-2 buňky vykazovaly pokles počtu mitochondrií a změnu tvaru mitochondrií. Po indukci LPS se produkce ROS v buňkách BV-2 zvýšila. Poté přetížené ROS způsobily napadení membránových fosfolipidů volnými radikály (Magnani et al., 2020), což vedlo ke ztrátě MMP a následně k mitochondriální dysfunkci a depleci ATP. Bylo vynikající, že léčba ACT zmírnila pokles obsahu MMP a ATP. Tato data naznačují, že ACT indukoval mitochondriální dysfunkci regulací biosyntézy pantotenátu a CoA.

Bylo široce publikováno, že polarizace mikroglií je úzce spojena s buněčným metabolismem (Orihuela et al., 2016). Zejména jako metabolické centrum hrají mitochondrie pozoruhodnou roli v regulaci buněčného metabolismu. Nedávno byly mitochondrie umístěny jako klíčový determinantní bod v polarizaci mikroglií (Harry et al., 2020). Abychom lépe porozuměli mechanismu ACT, posuzovali jsme funkční osu mitochondrií pomocí Western blotu. Ukázalo se, že ACT indukuje mitochondriální dysfunkci aktivací osy AMPKa/PGC-1/UCP-2.

PGC-1a a UCP-2 oba souvisí s mitochondriální biogenezí (Uittenbogaard a Chiaramello, 2014; de Oliveira Bristot et al., 2019) a lze je považovat za hlavní regulátory ROS (Jamwal a kol., 2020). Zprávy naznačovaly, že mitochondriální biogeneze zprostředkovaná PGC-1a a snížení ROS závisí na indukci UCP-2 (Uittenbogaard a Chiaramello, 2014; de Oliveira Bristot et al., 2019; Jamwal et al., 2020). Kvůli přetížení ROS byla exprese PGC-1a a UCP-2 v buňkách BV-2 indukovaných LPS snížena. Naznačovala, že ACT by mohla eliminovat nadměrné ROS prostřednictvím PGC-1a a UCP-2, a tak obnovit mitochondriální funkci. Podle literatury by změna PGC-1a v BV-2 buňkách mohla přispět k regulaci polarizace. Je zajímavé, že předchozí zpráva zjistila, že zvýšená exprese PGC-1a inhibovala aktivitu NF-kB v LPS-indukovaných BV-2 buňkách (Yang et al., 2017), což kvalifikovalo vztah mezi PGC{{ 24}}a a NF- kB v naší studii.

Exprese PGC-1a je ovlivněna proteiny upstream dráhy, jako je AMPK. AMPK je klíčový protein pro

udržování buněčné homeostázy (Qiu et al., 2020), které hrají různé role při podpoře M2 polarizace mikroglií (Chu et al., 2019). Moduluje metabolické dráhy v buňkách (Szewczuk et al., 2020). Zjistili jsme, že ACT podporuje aktivaci AMPK. Současně aplikace sloučeniny C (inhibitor AMPK) blokovala účinek ACT na zmírnění LPS-indukovaného nadbytku NO. Proto ACT také potlačil LPS-stimulovanou M1 polarizaci prostřednictvím AMPK signální dráhy.

Je to poprvé, kdy se uvádí mechanismus ACT na regulaci polarizace mikroglií (obrázek 6). Data podporují, že ACT by mohl být vyvinut jako terapeutický prostředek pro neurodegenerativní onemocnění spojené s neurozánětmi, jako je AD(Alzheimerova choroba). Konkrétně jsme spojili polarizaci mikroglií s buněčným metabolismem, čímž jsme vysvětlili účinek ACT prostřednictvím změny funkce mitochondrií. Identifikace této metabolické osy jako cíle jedinečné entity může vést k mnohem lepším terapeutickým přístupům proti polarizaci mikroglií M1, zejména u AD.(Alzheimerova choroba).

Proti Alzheimerově choroběchoroba:Cistanche tubulosa

REFERENCE

1. Afridi, R., Lee, WH, a Suk, K. (2020). Mikroglie se zvrtla: spojuje imunometabolismus s neurodegenerací. Přední. Cell Neurosci. 14:246. doi: 10.3389/fncel.2020.00246

2. Agrawal, I. a Jha, S. (2020). Mitochondriální dysfunkce aAlzheimerova choroba: role mikroglie. Přední. Stárnutí Neurosci. 12:252. doi: 10.3389/fnagi.2020.00252

3. Atamna, H. (2004). Hem, železo a mitochondriální rozpad stárnutí. Ageing Res. Rev. 3, 303–318. doi: 10.1016/j.arr.2004.02.002

4. Bagheri-Mohammadi, S. (2020). Mikroglie vAlzheimerova chorobachoroba: Role interakce kmenové buňky-mikroglie v homeostáze mozku. Neurochem. Res. 46, 141–148. doi: 10.1007/s11064-020-03162-4

5. Bi, J., Zhang, J., Ren, Y., Du, Z., Li, Q., Wang, Y., et al. (2019). Irisin zmírňuje ischemicko-reperfuzní poškození jater tím, že inhibuje nadměrné mitochondriální štěpení, podporuje mitochondriální biogenezi a snižuje oxidační stres. Redox Biol. 20, 296–306. doi: 10.1016/j.redox.2018.10.019

6. Chen, J., Gao, L., Zhang, Y., Su, Y., Kong, Z., Wang, D., et al. (2020). Acteosidy - zlepšené streptozotocinem indukované poškození učení a paměti zvýšením regulace hipokampálního inzulínu, transportu glukózy a energetického metabolismu. Phytother. Res. 35, 392–403. doi: 10.1002/ptr.6811

7. Chen, Y., Li, YQ, Fang, JY, Li, P. a Li, F. (2020). Vytvoření souběžného experimentálního modelu osteoporózy kombinované sAlzheimerova chorobachorobau potkanů ​​a dvojí účinky echinakosidu a akteosidu zCistanche tubulosa. J. Ethnopharmacol. 257, 112834. doi: 10.1016/j.jep.2020.112834

8. Chu, X., Cao, L., Yu, Z., Xin, D., Li, T., Ma, W., et al. (2019). Fyziologický roztok bohatý na vodík podporuje polarizaci mikroglií M2 a ztrátu synapse zprostředkovanou komplementem, aby se obnovily behaviorální deficity po hypoxii-ischemii u novorozených myší prostřednictvím aktivace AMPK. J. Neuroinflammation 16:104.

9. de Oliveira Bristot, VJ, De Bem Alves, AC, Cardoso, LR, Da Luz Scheffer, D., a Aguiar, AS Jr. (2019). Role PGC-1alfa/UCP2 signalizace v příznivých účincích fyzického cvičení na mozek. Přední. Neurosci. 13:292. doi: 10.3389/fnins.2019.00292

10. De Simone, R., Ajmone-Cat, MA, Pandolfi, M., Bernardo, A., De Nuccio, C., Minghetti, L., et al. (2015). Mitochondriální uncoupling protein-2 je hlavním regulátorem mikrogliálních odpovědí M1 i M2. J. Neurochem. 135, 147–156. doi: 10.1111/jnc.13244

11. Fakhri, S., Pesce, M., Patruno, A., Moradi, SZ, Iranpanah, A., Farzaei, MH, et al. (2020). Útlum Nrf2/Keap1/ARE inAlzheimerova chorobachorobarostlinnými sekundárními metabolity: mechanistický přehled. Molecules 25:4926. doi: 10,3390/ molekul25214926

12. Hanslik, KL a Ulland, TK (2020). Role mikroglie a zánětu Nlrp3 vAlzheimerova chorobachoroba. Přední. Neurol. 11:570711. doi: 10.3389/ fneur.2020.570711

13. Harry, GJ, Childers, G., Giridharan, S. a Hernandes, IL (2020). Souvislost mezi mitochondrií a funkcí mikrogliového efektoru. Co si myslíme, že víme? Neuroimmunol. Neuroinflamm. 7, 150–165.

14. Jamwal, S., Blackburn, JK, a Elsworth, JD (2020). PPARgamma/PGC1alfa signalizace jako potenciální terapeutický cíl pro mitochondriální biogenezi u neurodegenerativních poruch. Pharmacol. Ther. 219:107705. doi: 10.1016/j. pharmthera.2020.107705

15. Ji, SL, Cao, KK, Zhao, XX, Kang, NX, Zhang, Y., Xu, QM a kol. (2019). Antioxidační aktivita fenylethanoidových glykosidů na glutamátem indukovanou neurotoxicitu. Biosci. Biotechnol. Biochem. 83, 2016–2026. doi: 10. 1080/09168451.2019.1637243

16. Kumar, A., Kumar, Y., Sevak, JK, Kumar, S., Kumar, N. a Gopinath, SD (2020). Metabolomická analýza primárních buněk lidského kosterního svalstva během myogenní progrese. Sci. Rep 10:11824.

17. Lai, X., Xiong, Y., Zhou, J., Yang, F., Peng, J., Chen, L., et al. (2019). Verbascosid zmírňuje akutní zánětlivé poškození při experimentálním mozkovém krvácení potlačením TLR4. Biochem. Biophys. Res. Commun. 519, 721–726. doi: 10. 1016/j.bbrc.2019.09.057

18. Li, L., Wang, Y., Wang, H., Lv, L., a Zhu, ZY (2020). Metabolické odezvy BV-2 buněk na puerarin při jeho polarizaci pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie. Biomed. Chromatogr. 34:e4796.

19. Li, W., Deng, R., Jing, X., Chen, J., Yang, D. a Shen, J. (2020). Akteosid zlepšuje experimentální autoimunitní encefalomyelitidu prostřednictvím inhibice aktivace mitofágie zprostředkované peroxynitritem. Volný Radic. Biol. Med. 146, 79–91. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2019.10.408

20. Li, YQ, Chen, Y., Fang, JY, Jiang, SQ, Li, P. a Li, F. (2020).

21. Integrovaná síťová farmakologie a model zebrafish pro zkoumání komponent s dvojím účinkemCistanche tubulosapro léčbu osteoporózy aAlzheimerova chorobachoroba. J. Ethnopharmacol. 254, 112764. doi: 10.1016/j.jep.2020. 112764

22. Linnerbauer, M. a Rothhammer, V. (2020). Ochranné funkce reaktivních astrocytů po poškození centrálního nervového systému. Přední. Immunol. 11:573256. doi: 10.3389/fimmu.2020.573256

23. Magnani, ND, Marchini, T., Calabro, V., Alvarez, S. a Evelson, P. (2020). Role mitochondrií v redoxní signální síti a její výsledky u vysoce impaktních zánětlivých syndromů. Přední. Endocrinol. (Lausanne) 11:568305. doi: 10.3389/fendo.2020.568305

24. Orihuela, R., Mcpherson, CA a Harry, GJ (2016). Mikrogliální M1/M2 polarizace a metabolické stavy. Br. J. Pharmacol. 173, 649–665. doi: 10.1111/bph.13139

25. Perea, JR, Bolos, M. a Avila, J. (2020). Mikroglie vAlzheimerova chorobachorobav kontextu tau patologie. Biomolecules 10:439.

26. Qiu, WQ, Pan, R., Tang, Y., Zhou, XG, Wu, JM, Yu, L. a kol. (2020). Polyfenol semen liči inhibuje Abeta-indukovanou aktivaci zánětu NLRP3 prostřednictvím indukce autofagie zprostředkované LRP1/AMPK. Biomed. Pharmacother. 130:110575. doi: 10.1016/j.biopha.2020.110575

27. Rath, M., Muller, I., Kropf, P., Closs, EI a Munder, M. (2014). Metabolismus prostřednictvím arginázy nebo syntázy oxidu dusnatého: dvě konkurenční argininové dráhy v makrofázích. Přední. Immunol. 5:532. doi: 10.3389/fimmu.2014.00532

28. Shiao, YJ, Su, MH, Lin, HC a Wu, ČR (2017). Akteosid a isoakteosid chrání amyloid beta peptidem indukovanou cytotoxicitu, kognitivní deficit a neurochemické poruchy in vitro a in vivo. Int. J. Mol. Sci. 18:895. doi: 10.3390/ijms18040895

29. Szewczuk, M., Boguszewska, K., Kazmierczak-Baranska, J. a Karwowski, BT (2020). Úloha AMPK v metabolismu a jeho vliv na opravu poškození DNA. Mol. Biol. Rep. 47, 9075–9086. doi: 10,1007/s11033-020-05900-x

30. Tsukahara, T., Haniu, H., Uemura, T. a Matsuda, Y. (2020). Terapeutický potenciál produktu rozkladu jater prasat: nové pohledy a perspektivy pro mikroglií zprostředkovaný neurozánět u neurodegenerativních onemocnění. Biomedicines 8:446. doi: 10.3390/biomedicíny8110446

31. Uittenbogaard, M. a Chiaramello, A. (2014). Mitochondriální biogeneze: terapeutický cíl pro neurovývojové poruchy a neurodegenerativní onemocnění. Curr. Pharm. Des. 20, 5574–5593. doi: 10.2174/1381612820666140305224906

32. Wei, W., Lu, M., Lan, X., Liu, N., Wang, H., Du, J., et al. (2019). Neuroprotektivní účinek verbascosidu na hypoxicko-ischemické poškození mozku u novorozených potkanů. Neurosci. Lett. 711:134415. doi: 10.1016/j.neulet.2019.134415

33. Xu, J., Patassini, S., Begley, P., Church, S., Waldvogel, HJ, Faull, RLM, et al. (2020). Cerebrální nedostatek vitaminu B5 (kyselina d-pantotenová; pantothenát) jako potenciálně reverzibilní příčina neurodegenerace a demence u sporadickýchAlzheimerova chorobachoroba. Biochem. Biophys. Res. Commun. 527, 676–681. doi: 10. 1016/j.bbrc.2020.05.015

34. Yang, X., Xu, S., Qian, Y. a Xiao, Q. (2017). Resveratrol reguluje polarizaci mikroglií M1/M2 prostřednictvím PGC-1alfa v podmínkách neurozánětlivého poškození. Chování mozku. Immun. 64, 162–172. doi: 10.1016/j.bbi.2017.03.003

Cistanche tubulosa