Část 1: Mapování epigenomické a transkriptomické souhry během formování paměti a vzpomínání v souboru Hippocampal Engram Ensemble
Mar 15, 2022
Další informace:{0}}
Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*
1Picower Institute for Learning andPaměť, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
2Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
3 Laboratoř počítačových věd a umělé inteligence, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.
5Broad Institute of Harvard a MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.
Klikněte naVitamin shop Cistanche a Cistanche pro paměť
Abstraktní
Epigenom a trojrozměrná (3D) – genomická architektura se objevují jako klíčové faktory v dynamické regulaci různých transkripčních programů nezbytných pro neuronální funkce. Zde používáme systém značení závislý na aktivitě u myší k určení epigenetického stavu, 3D-genomové architektury a transkripční krajiny engramových buněk po dobu životaPaměťformace a odvolání. Naše zjištění to ukazujíPaměťkódování vede k epigenetickému primingu, který se vyznačuje zvýšenou dostupností zesilovačů bez odpovídajících transkripčních změn.Paměťkonsolidace následně vede k prostorové reorganizaci velkých chromatinových segmentů a interakcím promotor-enhancer. Nakonec, s reaktivací, engramové neurony využívají podmnožinu interakcí denovolong-range, kde byly primárně aktivované zesilovače uvedeny do kontaktu s jejich příslušnými promotory, aby up-regulovaly geny zapojené do lokální translace proteinů v synaptických kompartmentech. Naše práce společně objasňuje komplexní přepis a Uživatelé mohou prohlížet, tisknout, kopírovat a stahovat text a data-dolovat obsah v takových dokumentech pro akademický výzkum, vždy v souladu s úplnými podmínkami použití: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms
*Korespondence s: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.
Příspěvky autora:
AM a L.-HT projekt vypracovali a navrhli. AM a AZ provedli behaviorální experimenty, ISH, imunobarvení a analýzu MARIS. CA provedl injekci viru a imunobarvení. AM a HSM provedly experimenty ATAC-seq. AM a AZ provedli experimenty s jadernou RNA-seq. AM, HSM a VD provedly pc-Hi-C a Hi-C experimenty. AM, HSM, VD, RMR a JDV provedly analýzu ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD a FG provedly analýzu jaderné RNA-seq. AM, VD, HSM a RMR provedly analýzu pc-Hi-C a Hi-C. Všichni autoři pomáhali interpretovat data. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK a LHT napsali rukopis za přispění všech autorů. LHT poskytla nástroje a dohlížela na projekt.
Konkurenční zájmy:
Autoři neuvádějí žádné konkurenční zájmy.
epigenomická krajina po celou dobu životaPaměťformace a připomenutí v souboru hippocampal engram.
Tvorba a uchování dlouhodobých vzpomínek závisí na koordinované genové expresi a syntéze synaptických proteinů1. Tyto molekulární procesy působí v rámci specifické populace neuronů, označované jako engramové buňky2–4. Nedávné přístupy využívající na aktivitě závislou expresi reportérů poskytly rámec pro zkoumání engramového souboru5–8, ale molekulární mechanismy, které řídíPaměťskladování a vyhledávání zůstávají špatně pochopeny. Konkrétně epigenetické modifikace a 3D -genomická architektura se objevují jako klíčový faktor v dynamické regulaci genové exprese9–17 a jejich význam pro neuronální funkci, vývoj a onemocnění se stále více uznává14, 16, 18
Zde jsme použili myší model Targeted Recombination in Active Populations (TRAP)5,6, ve kterém jsou aktivované neurony exprimující Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein, (Arc) gen, trvale označeny indukovatelným způsobem. Aktivované neurony běhemPaměťkódování, konsolidace a vyvolání byly tříděny a podrobeny sekvenování jaderné RNA (nRNA-seq), testu na chromatin přístupný transposáze pomocí sekvenování (ATAC-seq) a zachycení konformace chromozomů (Hi-C). Naše data to dokazujíPaměťkódování vede k celogenomovému zvýšení dostupnosti chromatinu bez očekávaných změn v genové expresi. Dále jsme prokázali, že pozdní fáze konsolidace paměti byla spojena s re-lokalizací velkých chromatinových segmentů (sub-kompartmentů) z neaktivního do permisivního prostředí a reorganizací prostředí interakce promotor-enhancer. Nakonec reaktivace neuronů běhemPaměťodvolání je spojeno s interakcemi denovopromotor-enhancer, využívající velkou podmnožinu enhancerů, které byly aktivovány běhemPaměťkódování. Tyto interakce promotor-enhancer jsou spojeny s robustní změnou v expresi genů zapojených do lokální syntézy proteinů a synaptické morfogeneze.
Výsledek
Časová a prostorová identifikace aktivovaných a reaktivovaných engramových buněk
Sledování neuronální aktivity v průběhu času bylo jednou z hlavních výzev při studiu engramových buněk, protože markery neuronální aktivity, známé jako bezprostřední rané geny (IEG), se krátce po indukci vracejí na výchozí hodnotu1,2. K překonání tohoto omezení jsme využili model TRAP5,6, který vyžaduje dva transgeny, jeden, který exprimuje CreERT2 z promotoru Arc závislého na aktivitě, a jeden, který umožňuje expresi reportéru žlutého fluorescenčního proteinu (eYFP) v Cre- závislým způsobem. Podávání tamoxifenu (TAM) myším TRAP vede k trvalému značení eYFP v aktivovaných Arc neuronech. Bez TAM je CreERT2 zadržen v cytoplazmě a eYFP není exprimován (rozšířená data obr. 1a). Myši TRAP byly podrobeny klasickému Pavlovovu paradigmatu kontextového podmiňování strachu (CFC) (obr. 1a), běžně používané metodě ke studiu averzivních vzpomínek19. Přibližně 1,5–2 hodiny po expozici FS byly odebrány mozky k identifikaci i) RNA vazebného proteinu fox-1 homolog 3 (Rbfox3), také známý jako NeuN plus a eYFP plus označené neurony, které byly aktivovány během počáteční expozice (aktivováno -časné), které lze odlišit od ii) NeuN plus /eYFP- neaktivované neurony bazálního stavu (Basal) (obr. 1a). Po pěti dnech, v nepřítomnosti vyhledávání, jsme shromáždili iii) NeuN plus /eYFP plus neurony, které byly označeny v tréninkový den, označující dlouhodobéPaměťkonsolidace (Aktivováno-pozdně). V
V jiné kohortě byly myši znovu vystaveny podmíněnému stimulu a následná exprese endogenního proteinu ARC byla testována 1,5–2 hodiny po opětovné expozici. To umožnilo identifikaci iv) dvojitě pozitivních NeuN plus /eYFP plus / endogenních Arc plus engram neuronů, které byly aktivovány během tréninku a reaktivovány běhemPaměťvyvolat (Reaktivováno). Je pozoruhodné, že ačkoli k rekombinaci DNA nemusí plně dojít 1,5–2 hodiny po FS, pozorovali jsme vysokou společnou lokalizaci (v průměru 84 procent) mezi endogenním proteinem Arc a reportérem Arc:eYFP (rozšířená data, obr. 1b), která byla také v souladu s předchozími zprávami20.
PotvrditPaměťkódování a vyvolání během CFC, mrazivé chování bylo zaznamenáno během tréninku a opětovného vystavení podnětům vyvolávajícím strach (rozšířená data obr. 1c). V souladu s předchozími publikacemi6,20 naše data ukázala významný nárůst počtu eYFP plus (aktivovaných-časných a pozdních) neuronů v hippocampu ve srovnání s myšmi, které zůstaly naivní vůči CFC ve své domácí kleci (F (2, 70)=240.3, str<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">
Tvorba paměti je spojena se zvýšenou dostupností chromatinu, převážně na zesilovačích
Abychom lépe porozuměli molekulárním silám, které řídí různé transkripční programy, měřili jsme změny v dostupnosti chromatinu napříč různými fázemi genomu.Paměť. Hippokampální tkáně byly shromážděny a izolovaná jádra (rozšířená data obr. 2a, doplňková tabulka 1) byla podrobena přípravě knihovny ATAC-seq. Analýza diferencovaně přístupných oblastí (DAR) (Diffbind, režim DESeq2) mezi všemi populacemi (obr. 2a) odhalila, že většina změn ve stavu chromatinu nastává během rané fáze tvorby paměti, kde 7,862 oblastí napříč genomem získá dostupnost (Basal vs. Raná, doplňková tabulka 2). Naproti tomu jsme pozorovali relativně minimální změny ve stavu chromatinu při přechodu z Activated-early do Activated-late (582 DAR) a mezi Activated-late a Reactivated neurony (725 DAR), přičemž mezi nimi došlo k 48procentnímu překrytí (rozšířená data obr. 2b ). Je pozoruhodné, že jsme identifikovali velké procento (52 procent) stabilně získaných DAR, které se staly dostupnějšími v aktivovaných-časných a zůstaly dostupné jak v aktivovaných-pozdních i reaktivovaných neuronech (obr. 2b,c; doplňková tabulka 2). Je zajímavé, že zatímco jak rané změny (Basal vs. Early), tak stabilně získané DAR byly obohaceny o intergenové oblasti, pozdní změny chromatinu (Early vs. pozdní a Late vs. Reaktived) byly většinou obohaceny o promotorová místa (obr. 2d).
Funkční náhled byl poskytnut hodnocením toho, jak jsou DAR označeny různými modifikacemi histonů. Nejprve jsme použili ChromHMM k vytvoření modelu stavu chromatinu ze dvou nezávislých studií, které využívaly objemovou tkáň hippocampu před a po šoku do nohy 21,22. Dále jsme provedli analýzu násobného obohacení (pozorovanou nad očekávanou distribucí) DAR pro tyto různé stavy a odhalili jsme, že časné změny chromatinu a stabilní DAR byly obohaceny o značky zesilovačů (obr. 2e; rozšířená data obr. 2c, doplňková tabulka 3) .
Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími publikacemi, které ukazují, že stimulace primární kultury neuronů indukuje prodlouženou aktivitu zesilovače12,23. Dále jsme analyzovali překrývání jednotlivých stabilních lokusů s H3K4me1 a H3K27ac21. Tyto dvě histonové značky vymezují různé populace enhancerů, které mohou být buď „primované“ (pouze H3K4me1), „aktivní“ (H3K4me1 a H3K27ac) nebo „latentní“ (žádné známky)18. Stabilní píky vykazovaly distribuci mezi aktivovanými i aktivními zesilovači (rozšířená data, obr. 2d), kde 47 procent těchto míst bylo předpovídáno jako „latentní“ (žádné překrývání mezi DAR a histonovými značkami21 získanými 1 hodinu po FS). Abychom potvrdili náš model, provedli jsme chromatinovou imunoprecipitaci (ChIP) pro histonové markery H3K4me1 a H3K27ac, následovanou qPCR. Z naší domnělé modelovací analýzy zesilovače byly vybrány čtyři vybrané lokality (rozšířená data, obr. 2d; zesilovač 1 – předpovězená aktivace, zesilovač 2- předpokládaný aktivní, zesilovač 3 a 4 – předpokládaný latentní). V souladu s naším modelem jsme identifikovali dva „latentní“ lokusy v bazálním stavu (Enhancery 3 a 4), které se přeměnily do „aktivního“ stavu běhemPaměťformace (obr. 2f). Navíc bylo zjištěno, že domnělý enhancer 1 byl „primován“ v bazálním stavu a stal se aktivním, kde došlo k významnému stabilnímu nárůstu markerů H3K27ac během pozdní fáze a vyvolání (obr. 2f). Společně tato data naznačují, že repertoár nově dostupných zesilovačů byl rozšířen v potencovaných engramových neuronech, kde latentní nebo aktivované oblasti získaly značky H3K4me1 a H3K27ac a staly se tak aktivními zesilovači.
Abychom porozuměli funkční roli dostupných oblastí promotorů a zesilovačů, provedli jsme analýzu obohacení motivu (doplňková tabulka 4). Naše data ukazují, že většina (70 procent) motivů na dostupných promotorech je stejně obohacena a byly identifikovány ve všech fázíchPaměť(Rozšířená data Obr. 2e). Naproti tomu většina míst zesilovačů vykazovala odlišné vzory vazebných motivů transkripčního faktoru (TF) napříč různými fázemi paměti. Zajímavé je, že všudypřítomné motivy z protoonkogenu Jun, podjednotky transkripčního faktoru Ap-1 (tj. podjednotky Jun-Ap1) a rodiny TF regulačního faktoru X (Rfx) byly významně obohaceny až po počáteční fázi kódování (rozšířená data obr. 2e). Již dříve bylo oznámeno, že komplex Jun-Ap1 hraje ústřední roli při výběru zesilovačů a mohl by působit jako průkopnická TF k definování míst zesilovačů během vývoje mozku a neuronální aktivity12,24. Tato zjištění jsou v souladu s našimi údaji, které ukázaly vysoké procento latentních/primovaných lokusů v bazálním stavu (obr. 2f, rozšířená data obr. 2c, d). Zdá se tedy, že neuronální aktivita může vyvolat vazbu Jun-Ap1 na latentní enhancery, které pak rekrutují modifikátory chromatinu, které aktivují latentní enhancery. Podobně obohacení motivů transkripčního faktoru Yin Yang 1 (Yy1) pouze u zesilovačů z raných a pozdních stavů naznačuje, že organizace promotor-enhancer je aktivním procesemPaměťformace, protože nedávno bylo oznámeno, že Yy1 usnadňuje tvorbu těchto interakcí na dlouhé vzdálenosti25. Souhrnně tato data naznačují, že počáteční fázePaměťformace mění krajinu dostupnosti chromatinu v aktivovaných neuronech, přičemž k dlouhodobým stabilním změnám dochází převážně v oblastech zesilovačů.
Dynamické změny v prostorové jaderné architektuře a dostupnosti chromatinu během inicializacePaměťtvorba koresponduje se zvýšenou frekvencí interakcí promotor-enhancer běhemPaměťodvolání
Jaderná 3D architektura se objevuje jako klíčový faktor v dynamické regulaci genové exprese v mnoha neuronálních funkcích26–28. Proto jsme se zajímali o vymezení přesných změn, ke kterým dochází v prostorové organizaci chromatinu běhemPaměťformace a konsolidace. Vytvořili jsme data Hi-C z bazálního stavu a eYFP plus označených neuronů (brzké a pozdní, doplňková tabulka 5). Chromatin je segregován do dvou prostorově odlišných subnukleárních kompartmentů, „A“ a „B“, což odpovídá transkripčně aktivnímu a neaktivnímu chromatinu, v tomto pořadí15, 16,26. Časné důkazy naznačují, že neuronální aktivita a vnější signalizace mohou vyvolat reorganizaci architektury 3D-chromatinu14,27,28. Naše analýza stavu kompartmentu15, 16,26 (obr. 3a–c) odhalila re-lokalizaci velkých chromatinových segmentů z neaktivního (B) do permisivního prostředí (A) (a naopak) během počáteční a pozdní fázePaměťformace (212 segmentů přepnuto z A do B, 127 z B do A, průměrná velikost ~436Kbp). Je zajímavé, že 52 procent regionů v rané fázi, které přešly z B do A, si udrželo tento stav v pozdní fázi (tj. zůstalo ve stavu A, obr. 3b,c; doplňková tabulka 6). Navíc se téměř všechny tyto regiony překrývaly se získanými DAR z naší analýzy ATAC-seq, což potvrzuje přechod pododdělení z neaktivního do permisivního prostředí (obr. 3d). Tato data naznačují, že některé lokusy podléhají přepínání subkompartmentů napříč různými paměťovými fázemi, a proto mohou přispívat k dlouhodobým změnám neuronálních vlastností a funkcí po počáteční aktivaci.
Zatímco naše data Hi-C naznačovala rozsáhlou reorganizaci, zůstalo nejasné, zda tato reorientace umožnila interakci nových repertoárů promotorů a zesilovačů a jemné doladění různých transkripčních programů (obr. 3e). Využitím techniky promotor-zachycení Hi-C (pc-HiC) jsme studovali přesné změny, ke kterým dochází v interakcích promotor-enhancer během procesuPaměťformace a odvolání. Pro tuto studii jsme použili přizpůsobené „návnady“ cílené na ~5000 promotérů29. V souladu s předchozími publikacemi29 jsme detekovali ~19 000 (na skupinu) významných interakcí promotory-zesilovače (67,5 procenta) a promotory-promotory (46,2 procenta) (rozšířená data obr. 3a,b).
Protože promotory v mozku savců mohou být pod kontrolou více regulačních prvků14, 30, 31, analyzovali jsme překrývání mezi všemi interagujícími zesilovači a jejich příslušnými promotory. Zjistili jsme, že během každéhoPaměťfáze, stejné promotory interagují častěji s odlišnou podskupinou zesilovačů (tj. jedinečný, bazální – 3243, raný - 7602, pozdní - 7028, reaktivovaný – 7244; obr. 4a,b; rozšířená data Obr. 3c; Doplňková tabulka 7). Tento výsledek je v souladu s předchozími publikacemi, které ukazují, že více zesilovačů obklopujících několik genů (c-Fos a Arc) je rozhodující pro jejich aktivaci a frekvence jejich interakcí s jejich příslušnými promotory se mění v reakci na různá depolarizační činidla v kultivovaných neuronech31. Identifikovali jsme také menší podskupinu interakcí, ve kterých promotory interagovaly se stejnými zesilovači napříč různýmiPaměťfáze (tj. společné, ~31 procent všech interakcí; doplňková tabulka 7). Kromě toho reaktivované neurony vykazovaly významně silnější interakční skóre (jak vypočítalo Chicago, obr. 4b; rozšířená data obr. 3d). I když byl počet jedinečných interakcí podobný v časných, pozdních a reaktivovaných stavech, silnější interakční skóre naznačují, že specifické interakce promotor-zesilovač se vyskytují častěji během paměti.
odvolání. Tato představa byla dále ověřena experimenty 3C s primery navrženými pro měření frekvence interakce mezi vybraným zesilovačem (E) a genovými promotory (P), které kódují podjednotku D eukaryotického translačního faktoru 3 (Eif3d) nebo glutamátový receptor, ionotropní, kainát 3 (Grik3) (obr. 4c). Naše data ukázala, že reaktivované neurony měly signifikantní zvýšení frekvence interakce mezi promotorem Eif3d a vybraným zesilovačem ve srovnání s ostatními populacemi (obr. 4c). Souhrnně tato data naznačují, že k interakcím promotor-enhancer dochází častěji běhemPaměťodvolání.
Dále jsme se zeptali, zda dynamické interakce na dlouhé vzdálenosti identifikované pomocí pc-HiC odpovídají oblastem chromatinu, které se stanou dostupnějšími, jak bylo určeno pomocí ATAC-seq. To by potvrdilo, že zvýšená dostupnost má funkční důsledek při vytváření nových interakcí promotor-zesilovač. Abychom toho dosáhli, porovnali jsme překrytí mezi interagujícími zesilovači v každé buněčné populaci s DAR (pozorováno) nebo náhodným souborem dostupných genomických lokusů (očekávané). Naše analýza odhalila významné překrývání mezi oběma získanými DAR v aktivovaných raných neuronech a stabilně získanými DAR s interagujícími zesilovači ve všech buněčných populacích (všechny P < 0.0001,="" rozšířená="" data="" obr.="" 3e).="" naproti="" tomu="" změny="" v="" dostupnosti="" chromatinu,="" ke="" kterým="" došlo="" během="" pozdní="">Paměťkonsolidace a reaktivace se významně nepřekrývaly s interagujícími enhancery (rozšířená data, obr. 3e). Tyto výsledky společně naznačují, že zisk přístupnosti během kódování paměti je primární událostí a tyto aktivované lokusy se účastní de-novo funkčních interakcí promotor-zesilovač během pozdějších fázíPaměťformace. Tato dynamická krajina je ilustrována vizualizací genomových oblastí kolem genu eukaryotického translačního iniciačního faktoru 5 podjednotky A (Eif5a) (obr. 4d). Tato dočasná molekulární disekce životnosti engramu zdůrazňuje, jak koordinované priming epigenetického stavu buňky běhemPaměťkódování a konsolidace usnadňuje dálkové interakce během reaktivace.