Část 1: Integrovaná farmakologie sítě a model zebřičky pro zkoumání složek Cistanche Tubulosa s dvojím účinkem pro léčbu osteoporózy i Alzheimerovy choroby
Mar 30, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * a Fei Li 1, 2, *
ABSTRAKTNÍ
Etnofarmakologický význam:Osteoporóza (OP) a Alzheimerova choroba (AD) jsou běžná geriatrická souběžná onemocnění a řada studií naznačuje souvislost jejich patogeneze. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) je široce používaná tradiční čínská medicína a byla široce používána k léčbě OP a AD. Účinné látky pro obě souběžná onemocnění současně a základní mechanismy jsou však omezené.
Cíl studie:Cílem této práce bylo vytvořit účinnou a spolehlivou metodu síťového screeningu k nalezení sloučenin s dvojím účinkem v CT, které mohou chránit AD a OP současně. A poskytne nové pohledy na vazbu mezi OP a AD na molekulární mechanismy.
Materiály a metody:Duální účinky CT byly systematicky analyzovány integrací více databází a rozsáhlou analýzou na úrovni síťové farmakologie. Byla vytvořena klasifikovaná síť interakcí lék-cíl, aby odhalila rozdíly v účincích mezi různými typy sloučenin. Aby se prokázala účinnost této sítě, byly některé sloučeniny vybrány k ověření v modelu pre-indukovaného OP a AlCl3-indukovaného AD modelu zebřičky podle topologických parametrů.
klíčová slova:Síťová farmakologie; osteoporóza;Alzheimerova choroba; Cistanche tubulosa; Zebřička.
Cistanche má anti-Alzheimerovu funkci.
1. Úvod
Stárnoucí tendence populace má za následek zvýšenou prevalenci osteoporózy (OP) a Alzheimerovy choroby (AD) v průběhu let (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). V současnosti jsou OP i AD uznávány jako hlavní hrozby pro veřejné zdraví, protože mohou postupovat bez příznaků a přinášet obrovskou sociální zátěž (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Jako onemocnění související s věkem se v klinické praxi často vyskytují společně s vysokou invaliditou a úmrtností (Dengler-Crish a Elefteriou, 2019). OP je systémové onemocnění skeletu charakterizované nízkou kostní hmotou a narušenou mikroarchitekturou kostní tkáně, se zvýšenou křehkostí kostí a zvýšeným rizikem zlomenin (Rizzoli, 2018). AD je nejčastější mozková degenerace charakterizovaná progresivní ztrátou paměti a dalších kognitivních funkcí (Bondi et al., 2017). Doposud stále neexistují dostatečně výkonné možnosti, jak těmto dvěma onemocněním komplexní etiologie a patogeneze předcházet nebo je vyléčit. A co je horší, že pacient má častěji vedlejší účinky (Brown, 2017; Huang a Mucke, 2012).
Na teoretickém základě diferenciace syndromu (Sucher, 2013) má tradiční čínská medicína (TCM) s více složkami zaměřenými na více než jeden patofyziologický mechanismus jedinečnou přednost v léčbě některých známých komplexních onemocnění. Jako ledvinové tonikum je Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) široce používán tradičními čínskými lékaři proti ztrátě paměti a atrofické slabosti kostí (Fu et al., 2018). Kromě své tradiční účinnosti, rozsáhlý výzkum ukázal, že má různé farmakologické aktivity, jako je zlepšení kognitivních a behaviorálních deficitů (Wu et al., 2014), protizánětlivé (Fu et al., 2018), podpora tvorby kostí a potlačení kostí. resorpci (Li et al., 2013; Li et al., 2012), stejně jako antioxidační aktivitu (Zhang et al., 2016). Ale složitost jeho aktivních složek a metabolického procesu vyvolaly potíže jak při zkoumání cílů v lidských tkáních, tak při objasňování mechanismu účinku.
Především je nutná spolehlivá diskuse o terapeutických cílech OP/AD. Zejména na základě myšlenky „stejné léčby různých nemocí“ v TCM a metodologií „vícekomponentních terapeutik, biologické sítě“ v síti farmakologie mohou mít pokusy hledat významné společné cíle mezi oběma nemocemi zvláště praktický smyslu při poskytování poradenství pro prevenci a kontrolu OP a AD. Zebřičky mají ve své kosterní fyziologii silné podobnosti se savci a vysoce homologní geny s lidmi. Je to dostupný a atraktivní zvířecí model in vivo pro výzkum OP a AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Tento síťový farmakologický výzkum byl tedy zaměřen na screening aktivních složek CT s dvojím účinkem, prozkoumání společných potenciálních cílů OP a AD a také na odhalení možnosti použití CT k léčbě dvou onemocnění současně. V této studii byly informace o cílech o aktivních složkách CT, genomech a proteomických informacích OP a AD shromážděny z různých databází za účelem vytvoření interaktivní sítě a byla zkonstruována analýza obohacení, aby se objevily synergické mechanismy CT pro léčbu OP a AD. . Dále jsme vyvolali modely OP a AD zebrafish a zachytili klíčové sloučeniny v síti, abychom ověřili jejich účinnost a cíle pro dvě onemocnění.
Cistanche podporuje růst sklerotinu.
2. Materiály a metody
2.1 Reagencie
Chemické standardy genisteinu (GE), kvercetinu (QU), kyseliny abietové (AA), -sitosterolu (BSS) (čistota větší nebo rovna 98 procentům) byly zakoupeny od Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Kultivační destičky byly získány od Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Čína). Prednisolon (Pre), Etidronát disodný (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O byly zakoupeny od Aladdin Reagent Inc. Alkalická fosfatáza zebrafish (ALP), kyselá fosfatáza odolná vůči tartrátu (TRAP), acetylcholinesteráza (AChE) a cholin acetyltransferázová (ChAT) souprava pro enzymový imunosorbentní test (ELISA) byla dodána společností Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Trizol byl získán od Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, Čína). Transtar Top Green qPCR SuperMix byl zakoupen od TransGen Biotech. Co., Ltd. (Peking, Čína).
extrakt z cistanche
2.2 Zvířata
Dospělé zebřičky (kmen AB, 4 měsíce staré) byly udržovány při 28 stupních v cyklu světlo/tma 14/10 h v akváriu vybaveném sladkovodní výměnou. Byli chováni dvakrát denně s čerstvě vylíhnutou solnou krevetkou (Chen et al., 2018). Normálně oplodněná embrya byla vybrána a kultivována do 3 dnů po oplodnění (dpf) v lehkém růstovém inkubátoru. Všechny pokusy na zvířatech byly v souladu s pokyny instituce a vlády pro pokusy na zvířatech.
2.3 Síťový farmakologický proces
2.3.1 Výpočet chemického prostoru a screening kandidátských sloučenin
Všechny údaje o chemických složkách CT byly shromážděny z databáze farmakologie systémů tradiční čínské medicíny a analytické platformy. TCMSP je systémová farmakologická platforma čínských bylinných léků, která zachycuje vztahy mezi léky, cíli a nemocemi (Ru et al., 2014). Mezitím byly získány čtyři základní parametry související s farmakologií v TCMSP pro analýzu hlavních složek (PCA), včetně molekulové hmotnosti (MW), rozdělovacího koeficientu mezi oktanolem a vodou (AlogP), počtu donorů vodíku (Hdon) a počtu akceptorů vodíku ( Hacc). Chemická distribuce CT byla sestavena s výše uvedenými parametry pomocí softwaru SIMCA (verze 14.1, Umetrics). A ve stejném průběhu byly zpracovány léky s malou molekulou schválené pro AD/OP od DrugBank. Složky z CT byly filtrovány podle podobnosti s drogami (DL). DL je kvalitativní koncept používaný v designu léků pro odhad toho, jak "léku podobná" je potenciální sloučenina. Tato životně důležitá vlastnost se používá jako výběrové kritérium pro sloučeniny „podobné drogám“ v tradičních čínských bylinách a pomáhá optimalizovat farmakokinetiku a farmaceutické vlastnosti (Tao et al., 2013). Na základě doporučení v literatuře a TCMSP jsme jako podmínky filtru vybrali DL větší nebo rovno 0.18. Složky vyhovující podmínkám byly exportovány pro následnou analýzu. Jejich 2-rozměrné (2D) a 3D struktury byly namalovány softwarem ChemDraw Professional 16.0. A 3D struktury byly optimalizovány pomocí funkce minimalizace energie v Chem3D 16.0.
2.3.2 Sběr přidružených cílů OP a AD
Všechny genové asociace pro OP a AD byly nezávisle shromážděny z DisGeNET a GeneCards. Databáze DisGeNET je jednou z největších veřejně dostupných platforem pro objevování genů a variant spojených s lidskými nemocemi (Pinero et al., 2017). GeneCards je integrovaná databáze lidských genů, která zahrnuje genomické, transkriptomické, proteomické, genetické, klinické a funkční informace (Safran et al., 2010).
2.3.3 Shromažďování složených cílů a predikce inverzního dokování
Databáze GeneCards a Swiss TargetPrediction byly zkombinovány za účelem predikce relevantních cílů aktivních složek v CT. GeneCards označuje známé aktivní cíle sloučenin, zatímco švýcarská databáze TargetPrediction dokáže odhadnout nejpravděpodobnější makromolekulární cíle malých molekul (Daina et al., 2019). Před predikcí byly struktury kandidátních molekul převedeny z formátu mol2 do formátu SMILES pomocí Open Babel (verze 2.4.1).
2.3.4 Analýza interakce protein-protein
Databáze STRING byla použita ke zjištění interakcí mezi skupinou sdílených cílů CT-OP-AD. Po hledání podle vzoru "Homo sapiens" byla síť interakce protein-protein (PPI) vizualizována softwarem Cytoscape (verze 3.7.2). STRING je databáze známých a předpokládaných PPI, odvozených z předpovědí genomického kontextu, vysoce výkonných laboratorních experimentů, (konzervované) společné exprese, automatizovaného dolování textu a předchozích znalostí v databázích (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche je dobrý na Alzheimerovu chorobu.
2.3.5 Analýza obohacení cest GO a KEGG
Analýza obohacení genové ontologie (GO) byla provedena na softwaru Funrich. FunRich (verze 3.1.3) je funkční software používaný hlavně pro analýzu obohacení genů a proteinů (Pathan et al., 2015). ConsensusPathDB-lidská databáze byla použita k provedení analýzy obohacení dráhy. Získaný seznam genů byl předložen do databáze s nastavením "p-value cutoff" jako 0,01. Po získání výsledků byly vybrány pouze tyto dráhy související s OP a/nebo AD a rozděleny do skupin podle kategorií funkce KEGG. CPDB je bezproblémová interakční síť obsahující binární a komplexní interakce protein-protein, genetické, metabolické, signalizační, genové regulační a lékové interakce, jakož i biochemické dráhy u Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Experimentální postupy pro model OP Zebrafish
2.4.1 Seskupování modelů
Larvy zebřičky byly rozděleny do několika skupin: kontrolní skupina, modelová skupina, modelová plus Ed skupina, model plus skupiny sloučenin, z nichž každá obsahovala 3 0 larvy. Kontrolní skupina byla udržována v médiu s 0,2 procenta DMSO. Modelová skupina byla ošetřena Pre (25 uM) od 3 dpf do 8 dpf. Model plus Ed skupina byla společně ošetřena Pre a Ed (30 ug/ml).
2.4.2 Barvení alizarinovou červení
Po 5 dnech kultivace s různými sloučeninami byly larvy anestetizovány, fixovány a postupně vyběleny. Alizarinová červeň byla použita k barvení hlavových kostí zebřičky. K odstranění přebytku bylo aplikováno 1 procento KOH a glycerol (poměry 3:1, 1:1 a 1:3). Nakonec byl použit stereomikroskop (Olympus SZX16) k zachycení obrazů barvení zebrafish pod polohou na břiše. Oblast barvení a integrovaná optická hustota (IOD) byly vypočteny pomocí Image-Pro Plus 6.{11}}
2.4.3 Stanovení aktivity ALP a TRAP
Larvy zebrafish při 3 dpf byly subkultivovány v 6-jamkových destičkách a inkubovány s Pre v přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučenin po dobu 5 dnů. Poté byly odebrány pro měření aktivity ALP. Aktivita ALP byla stanovena pomocí zebrafish ALP ELISA kitu na základě protokolu výrobce. Metoda hodnocení aktivity TRAP byla stejná jako ALP.
2.5 Experimentální postupy pro model AD Zebrafish
2.5.1 Seskupování modelů
Larvy zebřičky byly rozděleny do několika skupin: kontrolní skupina, modelová skupina, modelová skupina plus skupina DPZ, skupina model plus sloučenina, z nichž každá obsahovala 3 0 larvy. Kontrolní skupina byla udržována v médiu s 0,2 procenta DMSO. Modelová skupina byla ošetřena AlCl3 (150 uM, pH 5,8) od 3 dpf do 6 dpf. Model plus skupina DPZ byly společně ošetřeny AlCl3 a DPZ (8 uM).
2.5.2 Analýza chování
Po 3 dnech dodávek léků byl pohyb larev zaznamenán analyzátorem chování ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Všechny experimenty byly dokončeny za 60 minut při 28 °C, obsahující 3 cykly fáze světlo/tma (10 minut každý pro světlo a tmu). Podle metod v předchozí zprávě jsou jako účinnost léku proti AD vybrány průměrná rychlost (AS), změna rychlosti (∆S), míra zotavení dyskineze (DRR, rovnice a) a účinnost odezvy (RE, rovnice b). hodnotící index v tomto modelu (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/s)=D / T, DRR ( procenta )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
kde D je vzdálenost pohybu zebřičky během 60 minut, T je experimentální čas.
RE ( procento )=100 × (∆SDrev - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
kde ∆S je změna rychlosti zebřičky v cyklech světlo/tma.
2.5.3 Měření aktivity AChE a ChAT
Larvy zebrafish při 3 dpf byly subkultivovány v 6-jamkových destičkách a inkubovány s AlCl3 v přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučenin po dobu 3 dnů. Poté byly odebrány pro aktivitu AChE. Aktivita AChE byla detekována pomocí zebrafish AChE ELISA kitu na základě protokolu výrobce. Metoda hodnocení aktivity ChAT byla stejná jako AChE.
2.6 Kvantitativní analýza PCR v reálném čase
Larvy zebřičky byly rozděleny do skupin OP a AD. OP skupiny se skládaly z kontrolní skupiny, skupiny Pre a skupin Pre plus sloučenin, kultivovaných od 3 dpf do 8 dpf. Skupiny AD zahrnovaly kontrolní skupinu, skupinu AlCl3 a skupiny AlCl3 plus sloučeniny, kultivované od 3 dpf do 5 dpf. Každá skupina obsahovala 30 larev. Celková RNA byla extrahována z těchto vzorků larev zebřiček pomocí Trizolu. Vzorky RNA byly reverzně transkribovány na cDNA podle pokynů výrobce k soupravě cDNA. Úroveň exprese mRNA byla detekována fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase (Roche LightCycler96). Výsledky byly normalizovány na expresi -aktinu a kvantifikovány srovnávací (2−∆∆Ct) metodou. Použité dopředné a reverzní primery byly syntetizovány společností Sangon Biotech (Shanghai, Čína) a uvedeny v doplňkové tabulce S1.
cistanche a prášek Tongkat alipomáhá zlepšit imunitu.
Pro více informací klikněte sem.
2.7 Statistická analýza
Pro popisné statistické analýzy byl použit GraphPad Prism verze 8.00. Data byla vyjádřena jako průměr ± SD a analyzována metodou ANOVA pro testování variability mezi jednotlivými studiemi s ohledem na P menší nebo rovno 0,05 jako významné.
