Část 1: Oligosacharid z lidského mléka 2/-fukosyllaktóza indukuje neuroprotekci před intracerebrální hemoragickou mrtvicí
Mar 22, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 a Seong-Jin Yu1,*
1Centrum pro neuropsychiatrický výzkum, National Health Research Institutes, Zhunan 35053, Tchaj-wan;
pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);
baee@nhri.edu.tw (E.-KB)
2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Korea; yhsong@aptech.biz (YS);
jongwon.yoon91@gmail.com (JY)
Korespondence: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: plus 886-37206166 (ext. 36710)
Abstraktní:
Intracerebrální krvácení (ICH) nastává, když prasknou mozkové cévy, což způsobí zánět a buněčnou smrt. 2-Fukosyllaktóza (2FL), oligosacharid lidského mléka, má silné antiapoptotické a protizánětlivé účinky. Účelem této studie bylo prozkoumat ochranný účinek 2FL na buněčných a hlodavčích modelech ICH. Hemin byl přidán do primárního kortikálu potkananeuronálnía kokultivace mikroglií BV2 pro simulaci ICH in vitro. IBA1 a MAP2 imunoreaktivity byly použity ke stanovení zánětu aneuronálnípřežití. Hemin významně zvýšil IBA1, zatímco snížil imunoreaktivitu MAP2. 2FL významně znepřátelila obě odpovědi. Ochranný účinek 2FL byl dále zkoumán na potkaním modelu ICH. Intracerebrální podávání kolagenázy typu VII snížilo lokomotorickou aktivitu v otevřeném poli. Časná post-léčba 2FL významně zlepšila lokomotorickou aktivitu. Mozkové tkáně byly odebrány pro imunohistochemii a analýzu qRT-PCR. 2FL snižoval imunoreaktivitu IBA1 a CD4 v lézeném striatu. 2FL downreguloval expresi ER stresových markerů (PERK a CHOP), zatímco upreguloval M2 makrofágové markery (CD206 a TGF ) v poškozeném mozku. Celkově vzato, naše datová podpora, kterou má 2FLneuroprotektivníúčinek proti ICH prostřednictvím inhibiceneurozáněta ER stres. 2FL může mít klinické důsledky pro léčbu ICH.
Klíčová slova: 2-fukosyllaktóza; mrtvice intracerebrálního krvácení; zánět; endoplazmatického retikula
účinky extraktu z cistanche: léčba neuronemocí
1. Úvod
Intracerebrální krvácení (ICH) je hlavníneurologickýporucha spojená s vysokým rizikem úmrtí u dospělých [1,2]. ICH představuje 10–15 procent všech případů akutního iktu [3]. Několik epidemiologických studií podpořilo rozdíly mezi pohlavími u pacientů s ICH [4] nebo cerebrovaskulárním onemocněním [5]. U malé části pacientů s ICH se vyvine hemoragický lakunární syndrom [6]. Současná léčba ICH se zaměřuje na kontrolu krvácení, odstranění krevní sraženiny a zmírnění intrakraniálního tlaku způsobeného krvácením. Účinná farmakologická léčba ICH neexistuje.
Zánět hraje kritickou roli u ICH-indukovanýchneurodegenerace. Po propuknutí ICH se krevní buňky dostanou do mozkového parenchymu, aktivují mikroglie a iniciují produkci prozánětlivých cytokinů [7,8]. Hemin, vedlejší produkt hemoglobinu, způsobujeneuronálnísmrt a indukuje apoptózu a zánět [9,10]. Několik studií podpořilo účinnost protizánětlivé léčby na zvířecích modelech ICH [11,12]. Nedávno jsme prokázali, že časná post-léčba antagonistou CXCR4 CX807 inhibovala zánět a zlepšila behaviorální funkce u experimentálních ICH potkanů [13]. Tyto údaje naznačují, že protizánětlivá terapie může snížit poškození mozku
po ICH.
Lidské mateřské mléko obsahuje výživu a několik kritických bioaktivních složek [14], např. oligosacharidy lidského mléka (HMO) [15]. 2′-Fukosyllaktóza (2FL) je hlavním oligosacharidem v lidském mléce. Orální podávání 2FL se zlepšiloPaměťa učení u potkanů [16,17]. Navíc 2FL potlačil lipopolysacharidem indukovanou expresi CD14 a zánět v lidských enterocytech [18]. Nedávno jsme informovali, že 2FL zmírnilneurozánětu mozku trpícího ischemickou cévní mozkovou příhodou [19]. Tyto údaje naznačují, že 2FL je silné protizánětlivé činidlo a může být tedy užitečné pro léčbu ICH.
Účelem této studie bylo zkoumat nervové ochranné účinky 2FL na buněčných a zvířecích modelech ICH. Hemin byl použit k simulaci ICH v buněčné kultuře [20]. Prokázali jsme, že 2FL antagonizoval heminem zprostředkovanou aktivaci mikroglií. K vytvoření fokální ICH u dospělých potkanů byla použita kolagenáza typu VII [13]. Zjistili jsme, že 2FL významně zmírnil ICH-indukovanou aktivaci mikroglií, infiltraci CD4 plus lymfocytů a ER stres v poškozeném mozku a zlepšil behaviorální funkci. Naše datová podpora, kterou má 2FLneuroprotektivníúčinek proti ICH.
účinky extraktu cistanche
2. Výsledky
2.1. 2FL redukovaná neurodegenerace zprostředkovaná heminem u primárních kortikálních neuronů a kokultivace mikroglií BV2
Ochranný účinek 2FL byl nejprve zkoumán na buněčném modelu mozkového krvácení. Primární kortikálníneuronálníkokultury mikroglií BV2 byly ošetřeny heminem (10 uM) po dobu 48 hodin (viz časová osa na obrázku 1E). Hemin utlumenýneuronálnímarker MAP2 (obrázek 1A), zatímco zvýšil mikrogliový marker IBA1 (obrázek 1B). Obě tyto odpovědi byly antagonizovány 2FL (1 uM, obrázek 1A,B). Imunoreaktivity MAP2 a IBA1 byly dále analyzovány měřením hustoty pixelů specifických markerů. Jak je vidět na obrázku 1C,D, hemin významně snížil imunoreaktivitu MAP2 (Map2-ir) a zvýšil IBA1-ir (p < 0.00="" 1,="" jednosměrná="" anova,="" n="6" v="" každé="" skupině).="" tyto="" odpovědi="" byly="" významně="" antagonizovány="" 2fl="" (map2:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 14="115.863;" iba1:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 15="134" 0,644,="" jednosměrná="">
F
Obrázek 1neuroprotektivníúčinek 2FL v primární kortikálníneurona kokultura mikroglií BV2. (A) Reprezentativní mikrofotografie ukazují, že hemin snižuje imunoreaktivitu MAP2 (-ir). Společné podávání s 2FL antagonizovalo heminem zprostředkovanou ztrátu MAP-ir. (B) Hemin zvýšil IBA1-ir. Společná administrace s 2FL snížila IBA1-ir. (C,D) Hustota pixelů MAP2-ir nebo IBA{{10}}ir byla analyzována pomocí softwaru NIS Elements AR 5.11. (C) 2FL významně antagonizovaná heminem zprostředkovaná ztráta MAP2-ir. (D) 2FL významně zeslabil heminem indukovanou aktivitu IBA1. (E) Časová osa experimentu. * p < 0,05.="" měřítko="100">
cistanche extrakt přínos
2.2. Post-léčba s 2FL zlepšenou lokomotorickou aktivitou u ICH potkanů
Ochranný účinek 2FL byl dále zkoumán na zvířecím modelu ICH. Celkem 14 dospělým samcům potkanů byla stereotakticky podávána nízká dávka (0,5 jednotek/ul x 1 ul) kolagenázy typu VII k vyvolání mozkového krvácení v pravém striatu. 2FL (400 mg/kg/den, ip, n=7) nebo vehikulum (fyziologický roztok, ip, n=7) byl podáván denně po dobu 5 dnů, počínaje 1 dnem po mrtvici (viz časový rozvrh v Obrázek 2G). Poté, 2 hodiny po poslední injekci 2FL nebo vehikula v den 5, byla zvířata jednotlivě umístěna do komor pro infračervenou aktivitu na 30 minut. Pohybové chování v otevřeném poli bylo zkoumáno po dobu 30 minut. Zjistili jsme, že 2FL významně zvýšila vertikální aktivitu (VACTV, obrázek 2A), celkovou ujetou vzdálenost (TOTDIST, obrázek 2B), vertikální čas (VTIME, obrázek 2C), horizontální aktivitu (HACTV, obrázek 2D), dobu pohybu (MOVTME, obrázek 2E ) a číslo pohybu (MOVNO, obrázek 2F). Podrobné statistiky (dvoucestné ANOVA plus post hoc Newman-Keulsovy (NK) testy) jsou uvedeny v tabulce 1.
Obrázek 2. Následná léčba 2FL zlepšuje nervové funkce u ICH potkanů. Dospělí potkani byli léčeni kolagenázou typu VII na D0 (G, časová osa). 2FL nebo vehikulum bylo podáváno systémově denně po dobu 5 dnů. Lokomotorické chování bylo zkoumáno v D5. 2FL výrazně zlepšila (A) vertikální aktivitu, (B) celkovou ujetou vzdálenost, (C) vertikální čas, (D) horizontální aktivitu, (E) dobu pohybu a (F) pohyb
číslo. n {{0}} v každé skupině. * p < 0.05,="" obousměrná="" anova;="" #="" p="">< 0,05,="" post="" hoc="" nk="">
Tabulka 1. Významné rozdíly v lokomotorickém chování mezi ICH plus veh a ICH plus 2FL.
2.3. Časné následné ošetření s 2FL sníženou mikrogliální aktivací v oblasti postižené lézí
Osm ICH potkanů (2FL, n=4; Veh, n=4) bylo po behaviorálním testu v den 5 usmrceno a perfundováno pro imunohistochemii IBA1. Typický IBA1-ir je znázorněn na obrázku 3 IBA1-ir byla zvýšena v oblasti peri-léze ve striatu (obrázek 3B) ve srovnání s odpovídajícími místy v kontralaterálním striatu bez poškození (obrázek 3A) u krys s mozkovou mrtvicí, které dostávaly veh. Při velkém zvětšení byly v poškozené oblasti nalezeny deramifikované nebo améboidní mikrogliální buňky (obrázek 3B, vložka), zatímco klidové mikroglie vykazující rozvětvenou morfologii byly nalezeny v nepoškozeném striatu (obrázek 3A, vložka). Léčba 2FL snížila IBA1-ir a částečně obnovila morfologické rozvětvení mikroglie (obrázek 3C, vložka). IBA1-ir byl kvantifikován a zprůměrován ve třech po sobě jdoucích řezech mozku s vizualizovanou přední komisurou u všech zvířat. 2FL významně snížil IBA1-nebo v mozku ICH (obrázek 3D, p < 0.001,="" f2,12="50.357," jednosměrná="">
Obrázek 3. Časně po léčbě 2FL redukovala mikrogliální aktivaci ve striatu s lézí. Zvířata dostávala vehikulum nebo 2FL po injekci kolagenázy od 1. do 5. dne. Zvířata byla usmrcena 5. den. Zvýšená imunoreaktivita IBA1 s de-ramifikovanou morfologií byla nalezena v lézeném striatu (B vs. A). Léčba 2FL snížila imunoreaktivitu IBA (C vs. B). (D) 2FL významně snížil imunoreaktivitu IBA1 v postiženém mozku. * p < 0,05,="" jednocestný="" test="" anova="" plus="">
2.4. 2FL zmírněná infiltrace CD4 plus lymfocytů do poškozených mozků
Podání kolagenázy zvýšilo infiltraci CD4 plus lymfocytů do lézí striata (obrázek 4B). V nepoškozeném striatu nebyly nalezeny téměř žádné buňky CD4 (obrázek 4A). Infiltrace buněk CD4 do poškozeného striata byla zmírněna léčbou 2FL (obrázek 4C vs. obrázek 4B; p < 0.001,="" f2,="" 6="173.485," jednocestná="" anova,="" obrázek="">
Obrázek 4. Po ošetření 2FL redukovala infiltraci CD4 plus lymfocytů do poškozeného mozku. Reprezentativní mikrofotografie prokazují imunoreaktivitu CD4 v (A) nepoškozeném striatu a (B) ve striatu s lézí od potkana, který obdržel vehikulum při nízkém (kalibrace=50 um) a vysokém zvětšení (vložka, kalibrace=10 um), stejně jako (C) poškozené striatum od krysy, která dostávala 2FL. (D) 2FL významně snížené CD{{10}}}ir v poškozeném mozku (* p < 0,001,="">
způsobem ANOVA).
2.5. 2FL diferenciálně změnil expresi zánětlivých markerů M1 a M2 v ICH mozcích
Striatální tkáně byly odebrány od osmi potkanů (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) v den 5. Exprese zánětlivých markerů M1/M2 byla zkoumána pomocí qRT-PCR. ICH významně zvýšila expresi M1 markeru CD86 (obrázek 5A, p=0.005) a M2 markerů CD206 a TGF (obrázek 5B, C, p=0.005). 2FL nezměnil expresi CD86 (obrázek 5A, p=0.356, dvoucestná ANOVA). Významně však upreguloval expresi CD206 (obrázek 5B) a TGF na poškozené straně (p < 0,05,="" nk="">
cistanche extrakt přínos
2.6. 2FL změnil expresi ER stresu a apoptotických markerů v ICH mozcích
Exprese ER stresu a apoptotických markerů byla zkoumána u osmi potkanů (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL významně snížila expresi PERK (obrázek 6A, p=0,016), IRE1 (obrázek 6B, p=0,018), CHOP (obrázek 6C, p=0,032) a SigmaR1 (Obrázek 6D, p=0.017) ve striatu s lézí. 2FL nezměnila expresi BIP (obrázek 6E, p=0.841) a ATF6 (obrázek 6F, p=0.403). Kromě toho byla exprese kaspázy3 významně snížena pomocí 2FL (obrázek 6G, p=0,029, t-test).
Obrázek 5. 2FL upreguloval expresi M2 markerů v ICH mozcích. ICH významně zvýšila expresi (A) M1 marker CD86 a M2 markerů (B) CD206 a (C) TGF (# p=0.005, obousměrný ANOVA). (A) 2FL signifikantně upreguloval expresi (B) CD206 a (C) TGF, ale ne (A) CD86, ve striatu s poškozením (* p < 0,05,="" nk="">
Obrázek 6. 2FL potlačila expresi ER stresu a apoptotických markerů. Exprese (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 a (G) kaspázy3 byla významně inhibována 2FL v hemoragických mozcích. Exprese (E) BIP a (F) ATF6 nebyla 2FL změněna. * p < 0.05.="" er,="" endoplazmatické="" retikulum;="" perk,="" proteinkinase="" r-like="" er="" kinase;="" ire1,="" inositol-vyžadující="" enzym="" 1;="" chop,="" ccaat="" enhancer-vazebný="" protein="" homologní="" protein;="" sigmar1,="" sigma="" 1="" receptor;="" atf6,="" aktivační="" transkripční="" faktor="">
