Část 1|Extrakt Herba Cistanche zvyšuje mitochondriální tvorbu ATP v krysích srdcích a buňkách H9c2

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung a Kam Ming Ko

Ústav biochemie, Hong Kong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, Čína

Klíčová slova: ATP,Cistanche deserticola, H9c2 buňky, srdce, mitochondrie

Abstraktní

Prozkoumat farmakologický základ „Jang - povzbuzující"působení Herbal Cistanche [sušená celá rostlinaCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], v čínské medicíně, účinky methanolového extraktu z Herba Cistanche na mitochondriální kapacitu tvorby ATP byly zkoumány pomocí ex vivo modelu srdce potkana a in situ buněčného testu H9c2. Léčba extraktem Herba Cistanche zvýšila u potkanů ​​kapacitu myokardiální mitochondriální tvorby ATP v závislosti na dávce, jak bylo hodnoceno měřením in vitro. Stimulace kapacity tvorby ATP byla spojena s paralelním zvýšením mitochondriálního elektronového transportu podporovaného pyruvátem, ale ne sukcinátem. Léčba Herba Cistanche také zvýšila aktivity myokardiálního mitochondriálního komplexu I a komplexu III, přičemž rozsah stimulace aktivity komplexu I byl větší. Léčba Herba Cistanche vyvolala zvýšení kapacity mitochondriální tvorby ATP v buňkách H9c2 závislé na dávce a čase. Výsledky naznačují, že léčba Herba Cistanche můžezvýšit tvorbu mitochondriálního ATPv srdcích potkanů ​​ex vivo a H9c2 buňkách in situ, případně prostřednictvímzvýšení oxidativní fosforylace.

Cistanche může zlepšit srdeční funkci, snížit krevní tlak a snížit hladinu lipidů v krvi

Úvod

"Jangové povzbuzení", které v čínské medicíně ztělesňuje všeobecné zlepšení tělesné funkce, zahrnuje využití energie při řízení různých biochemických procesů.

V tomto ohledu je ATP, který je univerzální měnou energie pro podporu buněčné funkce, generován hlavně oxidativní fosforylací v mitochondriích. Předpokládali jsme, že byliny "jangové povzbuzující".mají schopnost zvýšit mitochondriální kapacitu tvorby ATP(Ko et al., 2004). To je podpořeno naším nedávným zjištěním, že čínské tonizující byliny „osvěžující jang“, ale nikoli „vyživující jin“, by mohly zvýšit kapacitu myokardiální tvorby ATP v myších srdcích ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, sušená celá parazitická rostlina (kromě květu) Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), je klasifikována jako'Jang-osvěžující 'tonifikační bylina v tradiční čínské medicíně (Chen, 1998) a objevuje se jako nejoblíbenější složka v řadě čínských patentových formulací používaných pro Yang-posílení'. V Číně a Japonsku se Herba Cistanche široce používá k léčbě řady symptomů nedostatku Yang. Farmakologické studie ukázaly, že Herba Cistanche by mohlavychytávat volné radikály(Xiong a kol., 1996),vyrábět sedativum(Lu, 1998),proti stárnutí(Lee a kol., 1990),antinociceptivní a protizánětlivé účinky(Lin a kol., 2002), aposílit imunitní funkce(Wu a kol., 2005). Hlavní účinnou látkou Herba Cistanche jefenylethanoidové glykosidy(Ouyang et al., 2003), u kterých bylo zjištěno, že majíantibakteriální, antistresové a antioxidačnívlastnosti (Xiong et al., 1998), stejně jako antiapoptotické účinky na kultivované neurony (Tian & Pu, 2005). V této studii byly za účelem prozkoumání farmakologického základu Yang povzbuzujícího účinku Herba Cistanche zkoumány účinky léčby Herba Cistanche na kapacitu tvorby ATP v mitochondriích izolovaných ze srdcí potkanů ​​ex vivo a kultivovaných H9c2 kardiomyocytů in situ. Abychom prozkoumali biochemický mechanismus, který je základem účinku zvyšujícího tvorbu ATP, účinky léčby Herba Cistanche na mitochondriální transport elektronů a komplexní I–IV aktivity byly také zkoumány v srdcích potkanů.

Účinné složky Cistanche dokážou vychytávat různé aktivní kyslíkové volné radikály

Materiály a metody

Chemikálie, buněčné kultury a rostlinné materiály

ATP, ADP a 3-[4,5-dimethylthiozol-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazolium bromid (MTT) byly zakoupeny od společnosti Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA). Roztok luciferázy (ATPlite) byl získán od PerkinElmer (Boston, MA, USA). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM) a fetální bovinní sérum (FBS) byly zakoupeny od GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Buněčná linie H9c2 byla zakoupena od ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche dodal místní prodejce bylinek (Lee Hoong Kee). Bylina byla ověřena dodavatelem a vzorek voucheru (HKUSTY00301) byl uložen na katedře biochemie Hong Kong University of Science & Technology (HKUST).

Bylinná extrakce

Herba Cistanche (100g) byl nakrájen na malé kousky a poté extrahován zahříváním pod zpětným chladičem ve 300 ml methanolu při teplotě 65 °C po dobu 2 hodin. Postup byl opakován dvakrát. Shromážděný extrakt byl vysušen odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku a byl získán methanolový extrakt Herba Cistanche s výtěžkem 39 procent (hmotn./hmotn.). Chemická analýza ukázala, že methanolový extrakt Herba Cistanche obsahoval celkové saponiny, celkové flavonoidy, celkové lignany a polysacharidy v koncentracích 1,62 procenta (hmot.), 0,08 procenta, 0,15 procenta a 75,6 procenta, v tomto pořadí.

Péče o zvířata

Dospělí samci potkanů ​​Sprague-Dawley (8–10 týdnů; 250–300 g) byli chováni v 12-hodinovém cyklu tma/světlo v místnosti s řízenou vzduchem/vlhkostí při teplotě asi 22 °C a potrava a voda jim byla povolena podle libosti. v zařízeních péče o zvířata na HKUST. Experimentální protokoly byly schváleny Výborem pro výzkumnou praxi při HKUST.

Léčba drogami

Zvířata byla náhodně rozdělena do skupin, v každé bylo pět až šest zvířat. V léčebných skupinách byl potkanům intragastricky podáván methanolový extrakt Herba Cistanche (rozpuštěný/suspendovaný ve vodě) ve zvyšujících se denních dávkách ({{0}},031–0,5 g/kg) po dobu 3 dnů. Kontrolní zvířata dostávala pouze vodu. Dvacet čtyři hodin po poslední dávce bylo srdce získáno od zvířat anestetizovaných fenobarbitalem a podrobeno biochemické analýze.

Příprava mitochondriálních frakcí a měření kapacity generování ATP (ATP-GC) ex vivo

Vzorky tkáně levé komory srdce byly vyříznuty a promyty ledově chladným izotonickým pufrem (0,32 M sacharóza, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Srdeční mitochondriální frakce byly připraveny diferenciální centrifugací v izotonickém pufru při 4°C. 10% (w/v) srdeční homogenát byl připraven homogenizací nasekané ventrikulární tkáně homogenizátorem z teflonu při 4000 otáčkách za minutu pro 20–30 úplných zdvihů. Homogenát byl centrifugován při 600 x g po dobu 10 minut, aby se odstranila jádra a zbytky buněk. Supernatant byl poté centrifugován při 8000 x g po dobu 30 minut, aby došlo k sedimentaci mitochondrií (Evan, 1992). Pelety byly resuspendovány v 1 ml izotonického pufru a rekonstituovány mitochondriální frakce. Mitochondriální ATP-GC neléčených zvířat byl měřen metodou podle Leung et al. (2005)

Polysacharidy Cistanche mohou oddálit fyziologickou degeneraci orgánů a degeneraci buněčné morfologie

Měření mitochondriálního elektronového transportu

Měření transportu elektronů v izolovaných mitochondriích, které je založeno na redukci MTT, jak[1]provedeno, jak je popsáno Cohenem et al. (1997). Mitochondrie byly připraveny v koncentraci proteinu 1 mg/ml s inkubačním pufrem (250 mM sacharóza, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4) . Alikvot (40 ul) mitochondrií byl smíchán se 100 ul každého z 15 mM pyruvátu nebo 0,5 mM sukcinátu a 0,42 mg/ml MTT. Reakční směs byla inkubována při 37 °C po dobu 10 minut za mírného třepání. Po inkubaci byla reakční směs ukončena přidáním 100 ul lyzačního pufru (10 procent, hmotn./obj., dodecylsulfát sodný a 45 procent dimethylformamidu, upraveno na pH 4,7 ledovou kyselinou octovou). Po 5 minutovém stání byly odečteny absorbance reakční směsi pomocí čtečky mikrotitračních destiček (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a uvedeny jako rozdíl mezi 570 nm a 630 nm. Data byla vyjádřena jako procento průměrné hodnoty kontrolní (tj. Herba Cistanche – neošetřená) skupina.

Buněčná kultura

Buňky H9c2, permanentní buněčná linie odvozená ze srdečních myoblastů (Hescheler et al., 1991), byly kultivovány jako monovrstvy v DMEM doplněném 10 procenty (obj./obj.) FBS. Médium obsahovalo glukózu (4,5 g/l) a glutamin (4,5 mM), doplněné NaHC03 (17 mM), penicilinem (100 IU/ml) a streptomycinem (100 ug/ml). Všechny buňky byly pěstovány v atmosféře 5 % (obj./obj.) CO2 ve vzduchu při 37 °C. Médium bylo nahrazeno čerstvým médiem každé 2 nebo 3 dny. Zásoba buněk byla pěstována v 75 cm2 kultivační baňce a rozdělena před konfluencí v subkultivačním poměru 1:10. Pro test ATP-GC byly buňky H9c2 nasazeny v hustotě 2,5 x 104 buněk/jamku do 24-jamkové destičky. Po připojení buněk byl do média aplikován extrakt Herba Cistanche (rozpuštěný ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem; PBS) a buňky byly inkubovány po prodlužující se časové období (2–16 hodin). Kontrolní (neošetřené) buňky dostaly pouze PBS.

Měření ATP-GC in situ

Po uvedených obdobích inkubace s extraktem HerbaCistanche při zvyšujících se koncentracích (5{{10}}–300µg/ml) byl proveden test ATP-GC. Médium bylo odsáto a buňky byly ošetřeny digitoninem (50 ug/ml) v inkubačním pufru (120 mM KCI, 5 mMKH2P04, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 procenta BSA, pH 3 7,4) ◦C. Po odsátí digitoninu byly k buňkám přidány glutamát (5 mM), malát (5 mM) a ADP (60 uM) pro mitochondriální tvorbu ATP, která byla monitorována ve zvyšujících se časových intervalech v rozmezí od 0 do 15 minut. Reakce byla ukončena přidáním 60 ul kyseliny chloristé (30 procent, w/v) a reakční směsi byly poté centrifugovány při 600 x g po dobu 10 minut při 4 °C. Alikvot (120 ul) supernatantu byl smíchán s 90 ul 1,4 M KHC03 pro neutralizaci. Směsi byly znovu centrifugovány při 600 x g při 4 °C a v supernatantech byl měřen obsah ATP, jak bylo popsáno dříve. ATP-GC neošetřených buněk byla odhadnuta výpočtem plochy pod křivkou grafu (AUC1) vynesením generovaného ATP (nmol/mg proteinu) proti času (0–15 min) a vyjádřeného v libovolných jednotkách. U buněk ošetřených HerbaCistanche byly hodnoty AUC1 prodlužujících se inkubačních časů (3, 5, 7, 10 a 15 minut) normalizovány na příslušnou střední kontrolní hodnotu z neošetřených vzorků a vyjádřeny jako procento kontroly. Poté byla vypočtena plocha pod křivkou (AUC2) grafu vynášejícího procentuální kontrolní hodnoty proti inkubační době (3–15 min) a vyjádřena v libovolných jednotkách. Údaje o skupinách léčených Herba Cistanche byly vyjádřeny jako procento kontroly z rovnice:

[AUC2(HerbaCistanche – ošetřená)/AUC2(neléčená)]×100 procent

Měření komplexu I–IV a aktivity citrátsyntázy

Aktivity komplexu I–III mitochondriálního elektronového transportního řetězce (ETC) byly měřeny spektrofotometrickými metodami za použití komplexně specifických substrátů (NADH pro komplex I, sukcinát pro komplex II a decylubichinol pro komplex III), jak je popsáno (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Mark a kol., 2001). Aktivita komplexu IV byla měřena pomocí testovací soupravy cytochrom c oxidázy od Sigma. Aktivita mitochondriální citrátsyntázy byla měřena metodou podle Srere (1969).

Proteinový test

Koncentrace proteinů mitochondriálních frakcí a buněčných lyzátů byly stanoveny pomocí soupravy BioRad pro stanovení proteinů s použitím hovězího sérového albuminu jako standardu ({{0}},038–0,600 mg/ml).

Statistická analýza

Všechna data byla vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Byly analyzovány jednocestnou analýzou variance (ANOVA). Post hoc vícenásobná srovnání byla provedena s LSD. P hodnoty<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Výsledek

Účinky léčby Herba Cistanche na myokardiální mitochondriální ATP-GC u potkanů

Jak je znázorněno na obrázku 1, léčba extraktem Herba Cistanche v dávkách až 0,5 g/kg zvýšila myokardiální mitochondriální ATP-GC v závislosti na dávce u potkanů, přičemž stupeň stimulace byl 89 procent při dávce 0,5 g/kg.

Účinky léčby Herba Cistanche na onmitochondriální transport elektronů v srdcích potkanů

Rozsah elektronového transportu v izolovaných mitochondriích byl měřen sledováním redukce MTT. Substrát použitý pro test byl buď pyruvát nebo sukcinát.

Obrázek 1. Vliv léčby Herba Cistanche na mitochondriální kapacitu tvorby ATP v srdcích potkanů ​​ex vivo

Každý sloupec představuje průměr ± SEM s n {{0}}. Zvířata byla orálně léčena HerbaCistanche v uvedených denních dávkách po dobu 3 dnů. Kapacita generování ATP byla měřena podle popisu v části "Materiály a metody." Data byla vyjádřena v procentech kontroly vzhledem k hodnotám (AUC2) příslušné neošetřené kontrolní skupiny. ∗Významně odlišné od příslušné neléčené kontrolní skupiny; významně odlišné od skupiny léčené Herba Cistanche v dávce 0,5 g/kg.

Obrázek 2. Účinky léčby Herba Cistanche na mitochondriální transport elektronů v srdcích potkanů

Každý sloupec představuje průměr ± SEM, s n {{0}}. (a) Pyruvátem podporovaný (b) sukcinátem podporovaný mitochondriální elektronový transport byl měřen redukcí MTT, jak je popsáno v "Materiály a metody." Údaje byly vyjádřeny v procentech neošetřených kontrolních hodnot [s pyruvátem: OD570nm– OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; s sukcinátem: samec, 0,255 ±0,015, n=5]. ∗Významně odlišné od příslušné neléčené kontrolní skupiny; výrazně odlišná od skupiny 0,5 g/kg.

Jak je znázorněno na obrázku 2a, léčba Herba Cistanche v závislosti na dávce zvýšila rozsah mitochondriálního elektronového transportu podporovaného pyruvátem v srdcích potkanů, s optimální stimulací pozorovatelnou při dávkách 0,5 g/kg. V srdcích potkanů ​​ošetřených Herba Cistanche však nebyly zjištěny žádné významné změny v rozsahu mitochondriálního elektronového transportu podporovaného sukcinátem (obr. 2b).

Pro část 2,klikněte prosím zde.