Část 1: Extrakty z Cistanche Deserticola mohou antagonizovat imunosenescenci a prodloužit životnost u myší s urychleným stárnutím 8 (SAM-P8) myší

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang,1 Xu Ma,1 Wenjun He,1 Haixia Li,1 Shuyan Han,1 Yong Jiang,1

Hounan Wu, 2 Li Han, 3 Tomohiro Ohno, 3 Nobuo Uotsu, 3 Kohji Yamaguchi, 3 Zhizhong Ma,1,4 a Pengfei Tu1

1 Ústav přírodních léčiv, Fakulta farmaceutických věd, Pekingská univerzita, č. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Čína

2 Medical and Healthy Analytical Center, Peking University, No. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Čína

3 Fundamental Research Faculty, Fancl Research Institute, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Yokohama, Kanagawa 244-0806, Japonsko

4 Ústav integrace tradiční čínské a západní medicíny, Fakulta základních lékařských věd, Pekingská univerzita, č. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Čína

Korespondence by měla být adresována Zhizhong Ma; zhma@bjmu.edu.cn a Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Přijato 19. července 2013; Revidováno 23. října 2013; Přijato 11. listopadu 2013; Publikováno 9. ledna 2014; Akademický redaktor: Adair Santos

1. Úvod

Cistanche deserticola, jeden z nejpopulárnějších tradičních čínských rostlinných léčiv/zdravotních produktů, byl popsán v řadě historických čínských bylinných lékopisů jako prostředek proti stárnutí. V důsledku toho se v Číně široce používá k léčbě různých poruch souvisejících s věkem, včetně senilní demence, impotence, neplodnosti, chronické infekce a poruch krvetvorby u starších osob [1]. Moderní chemické přístupy umožnily izolovat dva základní typy sloučenin, fenylethanoidní glykosidy a oligosacharidy, jako hlavní aktivní složky Cistanche deserticola [1]. V posledním desetiletí byly Cistanche deserticola a její extrakty intenzivně studovány a ukázalo se, že jsou schopny chránit neurony před poškozením vyvolaným neurotoxiny[2], inhibovat hepatotoxicitu vyvolanou tetrachlormethanem [2] a podporovat obnovu buněk kostní dřeně z Ko-indukované radiační poškození [3]. Bylo také prokázáno, že má protizánětlivé, antioxidační a anti-aging účinky [4]. Nicméně, zda Cistanche deserticola může prodloužit délku života a jaké jsou základní molekulární mechanismy [3] spojené s jehoproti stárnutívlastnosti nebyly přísně testovány.

Výtažky z Cistanche deserticola proti stárnutí

Imunosenescence, tedy změna imunitního systému s věkem, tvoří pozadí, na kterém byla zaznamenána zvýšená náchylnost k infekcím, rakovině, neurodegenerativním onemocněním a autoimunitním onemocněním u starších osob [5]. Terapeutické intervence, jako je kalorická restrikce [6] a suplementace vitaminem E, byly hlášeny jako účinné při oddálení progrese imunosenescence, a tím i při snižování nemocnosti některých onemocnění souvisejících s věkem, jakož i při prodlužování délky života lidí i hlodavců. [7, 8]. Studie v této oblasti však komplikuje skutečnost, že stárnutí je spojeno s paradoxem současné imunodeficience a chronického zánětu [9]. To znamená, že prostá stimulace proliberace lymfocytů nebo protizánětlivá opatření nepředstavují ideální terapeutické intervence při řešení stárnutí a stavů souvisejících s věkem [10]. Hledání lékařských intervencí schopných předcházet nebo zmírňovat stavy související s věkem, včetně infekcí, rakoviny, autoimunitních onemocnění, aterosklerózy a neurodegenerativních onemocnění, které jsou hlavními příčinami smrti a invalidity, a opravy defektů imunitního systému musí být proto doprovázeny inhibicí zánětlivé reakce.

Myš s akcelerovanou senescencí [11] je inbrední myší model odvozený z kmene AKR/J, který je široce používán ve studiích stárnutí. Podkmen P8 (SAM-P8) těchto myší má výrazně zkrácenou životnost ve srovnání s podkmenem R1 (SAM-R1), který také vykazuje pomalejší proces stárnutí [12]. Paralelně s jejich předčasným stárnutím vykazují myši SAM-P8 také zvýšenou neurologickou senescenci, imunosenescenci a s věkem související hematopoetické deficity, které úzce napodobují typické charakteristiky stárnutí u lidí [13, 14]. Analýza základních mechanismů odpovědných za zrychlený proces stárnutí a poruchy související s věkem ukazuje, že se zdá, že se na tom podílí mitochondriální dysfunkce [15], oxidační stres a zvýšená míra somatických mutací DNA [16, 17]. Tento myší systém se svým homogenním genetickým pozadím proto poskytuje vynikající experimentální model pro studium terapeutik proti stárnutí a proti stárnutí [12] uložených v herbáři School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Čína.

cistanche může proti stárnutí

2. Materiály a metody

2.1. Materiály.

ČerstvýCistanche deserticola YC MAbyl shromážděn z různých oblastí v severozápadní Číně včetně autonomních oblastí Sin-ťiang, Neimenggu a Ningxia. Vzorky použité k přípravě extraktů byly ověřeny profesorem Pengfei Tu, specialistou na farmakognozii na Katedře přírodních léčiv, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University. Použitý poukazový exemplář Cistanche deserticola (číslo CD-2007-03-08) měl Science Center (Peking, Čína). Tato studie byla schválena Výborem pro výzkum zvířat Pekingské univerzity a provedena podle pokynů pro péči a použití laboratorních zvířat na Pekingské univerzitě. Certifikační číslo těchto myší bylo SCXK2001-2008. Myši byly drženy ve standardních metabolických klecích v prostředí

C, 45–60 procent vlhkosti a 12h cyklu světlo/tma) a umožnil volný přístup k potravě a vodě. Po 2 týdnech aklimatizace byla zvířata rozdělena do pěti skupin: 3 léčebné skupiny ECD, kontrolní skupina SAM-R1 a kontrolní skupina SAM-P8 bez léčby. Strava 3 léčebných skupin byla doplněna dietou smíchanou s různými koncentracemi ECD: výtěžek nízkých (50 mg/kg), středních (150 mg/kg) a vysokých (450 mg/kg) průměrných dávek ECD denně. . Kontrolní skupiny SAM-R1 a SAM-P8 bez léčby byly krmeny stejnou stravou bez ECD. Měření příjmu potravy u všech zvířat bylo prováděno každé tři dny v průběhu experimentu. Krevní tlak a srdeční měsíce po dobu trvání experimentu ke zjištění zdravotního stavu myší. Délka života každé myši byla Životaschopné apoptotické a nekrotické lymfocyty byly kvantifikovány pomocí soupravy Annexin V-FITC (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Beijing, Čína). Lymfocyty byly podrobeny dvojitému barvení značeným annexinem V konjugovaným s fluorescein isothiokyanátem (Annexin V-FITC) a suspendovány propidem ve 200 ul vazebného pufru (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Příprava extraktů z Cistanche deserticola (ECD) a HPLC analýza.

Na vzduchu sušená a nakrájená Cistanche deserticola(2,{1}} kg) bylo rozdrceno na prášek a extrahováno dvakrát 70% ethanolem po dobu 1 hodiny. Použité poměry rostlina/ethanol byly 1/6 (hmotn./hmotn.) v první extrakci a 1/4 (hmotn./hmotn.) ve druhé. Tyto dva extrakty byly spojeny a zfiltrovány před zahuštěním na relativní hustotu 1,10–1,15 za sníženého tlaku při 60 C. Tento koncentrát byl poté vakuově vysušen a výsledným práškem byl extrakt z Cistanche deserticola (ECD) použitý v této studii. .

Složky ECD byly analyzovány pomocí HPLC, jak bylo popsáno dříve [1]. Stručně, 100 mg prášku ECD se rozpustilo v 10.0 ml H20 a po filtraci se vstříklo do HPLC. HPLC analýza byla provedena na systému kapalinové chromatografie Agilent 1100 (Agilent Co., USA). Mobilní fáze sestávala ze směsi methanolu (A) a 0,10% kyseliny methanové (B). Byl použit program gradientové chromatografie; to bylo 26,5 procenta (A) a 73,5 procenta (B) za 0–7 minut, 26,5–29,5 procenta (A) a 73,5–70,5 (B) za 8–10 minut a 29,5 procenta (A) a 70,5 procenta (B ) za 20–27 min. Průtoková rychlost byla udržována konstantní na 1,0 ml/min, objem nástřiku byl 10 ml a teplota kolony byla udržována na 25 °C. K monitorování výtoku z kolony a vytváření chromatogramů byl použit UV detektor nastavený na 330 nm.

Sušené a nakrájené Cistanche deserticola

Fenylethanoidové glykosidy a oligosacharidy cistanchebyly identifikovány z jejich retenčních časů a absorpčních spekter. Kvantifikace byla provedena pomocí externích standardních kalibračních křivek. Výnos zextrakty z Cistanche deserticola(ECD) byl asi 3,33 procenta a obsah fenylethanoidů byl 17,94 procenta. Akteosid a echinakosid byly dvě hlavní složky v této frakci, přičemž jejich obsah byl 3,80 procenta a 8,25 procenta. Oligosacharidy tvoří 82 procent celkového ECD. Koncentrace hlavních aktivních složek ECD jsou uvedeny v tabulce 1.

2.3 Analýza délky života zvířat.

Tato studie se zaměřila na zkoumání, zdaextrakty z Cistanche deserticolajsou schopny prodloužit životnost myší SAM-R1 byly zakoupeny od Laboratorního chovu zvířat a výzkumného centra Peking University Health Myši SAM-P8 a zvrátit jejich stav imunosenescence.

2.4. Statistická analýza.

Data jsou uvedena jako průměrné hodnoty SD Srovnání mezi různými skupinami byla provedena jednocestnou ANOVA s post hoc testem. Ve studii délky života byla data podrobena Kaplan-Meierově analýze přežití, která zahrnovala použití jak Log-rank (Mantel-Cox) tak Gehan-Breslow-Wilcoxonových testů. Statistická analýza byla provedena pomocí Statistical Package for Social Sciences for Windows (SPSS, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS, pH 7,4) obsahující 0,01 procenta azidu sodného a podrobena FCM analýze. Subpopulace lymfocytů byly analyzovány průtokem cytometrie za použití průtokového cytometru FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) a analytického softwaru BD CellQuest, Chicago, IL) a být významný.

Fenylethanoidové glykosidy a oligosacharidy cistanche

3. Výsledky

Byla uvažována hodnota menší než 0,05.Hodnocení buněčné životaschopnosti periferních T lymfocytů pomocí Annexin V-FITC a PI dvojité barvení a analýza FACS. Po dietním doplňování myší SAM-P8 třemi dávkami ECD po dobu 4 týdnů byla zvířata fixována na 12 hodin a poté anestetizována a byla odebrána a analyzována krev.

3.1. Analýza potenciálních aktivních složek v extraktech z Cistanche deserticola (ECD). Jak je uvedeno v tabulce 1, ECD se skládá hlavně ze dvou typů sloučenin, fenylethanoidových glykosidů a oligosacharidů. Ve fenylethanoidních glykosidech byly identifikovány echinakosid, akteosid a 8-epiloganová kyselina, zatímco v oligosacharidech byl identifikován pouze galaktitol.

3.2.Vliv CistancheddeserticolakbdO4ct na průměrnou délku života myší SAM-P8. Pro tuto a následující studie byli osmiměsíční samci myší SAM-P8 rozděleni do 4 skupin. Mezi nimi jedna skupina myší byla krmena normální stravou bez ECD, další 3 skupiny samostatně přijímaly stravu, která obsahovala různé podíly ECD. Jako kontrolní skupina byly ve všech experimentech použity myši z podkmene SAM-R1, které mají abnormální proces stárnutí a délku života.

Ve srovnání s kontrolní skupinou SAM-R1 byla průměrná délka života myší SAM-P8 významně zkrácena (obrázek 1(a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Reverze imunosenescence u myší SAM-P8 pomocí extraktů z Cistanche deserticola (ECD). Pokles periferních naivních T lymfocytů a současné zvýšení periferních paměťových T lymfocytů jsou prominentními rysy imunosenescence, které jsou široce považovány za hlavní příčiny imunologických abnormalit souvisejících s věkem. Tato imunosenescence v SAM-P8 vzhledem k SAM-R1

aniftalsv0zcela evidentní, když analýza FACS měla vyčíslit (CD3 plus CD44wCD4Bigh) lymfocyty jako indikátor naivních T buněk a (CD3 plus CD44gh CD45 BR lymfocyty jako san indikátor paměťových T-buněk. Tedy v periferní krvi( Obrázek 2) a populace slezinných buněk (obrázek 3) snížily hladiny naivních T-buněk a zvýšené hladiny paměťových T-buněk byly pozorovány u myší SAM-P8. Bylo zjištěno, že doplnění stravy myší SAM-P8 o ECD dokáže zvrátit tyto indikátory imunosenescence v dávce- závislým způsobem jak v populaci periferní krve (obrázek 2), tak v populaci slezinných buněk (obrázek 3.) Jako další indikátor zvratu imunosenescence suplementací stravy ECD je hladina přirozených zabíječů [18]buněk, hlavní buněčný marker vrozeného imunitního systému To ukázalo, že suplementace ECD dietou vedla k na dávce závislému zvýšení NK(CD3 plus CD49 plus) buněk v populaci lymfocytů periferní krve (obrázek 4) a slezinných buněk (obrázek 5).

3.4. Extrakty z Cistanche deserticola posilují intenzitu fluorescence Relatice Sca{2}} pozitivních buněk u myší SAM-P8. Antigen kmenových buněk-1(Sca{6}}) je jedním z nejvýznamnějších biomarkerů hematopoetických kmenových buněk (HSC) v populacích buněk kostní dřeně. Sca-1 pozitivní buňky také představují progenitory lymfocytů, které mají byly nově exportovány z kostní dřeně do periferní krve, kde procházejí.

Obrázek 2: FACSanalýza vlivu doplňování stravy pomocí ECD na naivní a paměťové Tlymfocyty v periferní krvi. Osmiměsíční samci myší SAM-P8 a kontrolní SAM-RI myši byli rozděleni do 5 skupin. 3 léčebné skupiny zvířat SAM-P8 byly krmeny po dobu čtyř týdnů dietami doplněnými o nízké (100 mg/kg), střední (500 mg/kg) a vysoké (2500 mg/kg) dávky ECD a dvě kontrolní zvířata

pomocí gatingon CD3 plus Tcels. Řádky zobrazené na každém plotu označují prahové hodnoty použité k rozlišení CD44x* a CD45, které mají být použity celkem nízká identifikace naivních (CD3 plus Cp b"C4RB→) a paměti (CD3 plus CD4hCD 4Bl)T-buněk. b)Histogram zobrazující skupiny byly krmeny na stejné dietě bez suplementace Po 12hodinovém hladovění byla odebrána periferní krev zvířatům z podskupiny RB Tcell a podrobena analýze FACS, vše jak je popsáno v části 5. (a) Reprezentativní grafy FACS různých skupin miæ vytvořily procento naivních T buněk v periferní krvi různých skupin zvířat. (c)Histogram ukazující procento paměťových T-buněk v periferní krvi různých skupin zvířat. Sloupce představují průměr ± SD (v každé skupině,=10).<0.05sam-p8versus>

Obrázek 3: FACSanalýza účinku suplementace stravy ECD naivními a paměťovými Tlymfocyty v slezině. Osmiměsíční samci myší SAM-P8 a kontrolní SAM-RI byli rozděleni do 5 skupin. 3 léčebné skupiny zvířat SAM-P8 byly krmeny po dobu čtyř týdnů doplněnou stravou s nízkými (100 mg/kg), středními (500 mg/kg) a vysokými (2500 mg/kg) dávkami ECD a dvěma kontrolními skupinami zvířat pomocí gatingon CD3 plus T-buněk. Čáry zobrazené na každém grafu naznačují, že by mělo být použito k rozlišení CD44z a CD45 bw použité pro umožnění identifikace naivních (CD3 plus CD "CsRB动) a paměti (CD3 plus CD42CD I'm）Tcels.（b) Zobrazení histogramu bylo napájeno stejná strava bez suplementace Po 12hodinovém hladovění byly slezinné lymfocyty odebrány z anestetizovaných zvířat podskupiny RB T buněk a podrobeny FACS analýze, vše popsané v části 5. (a) Reprezentativní FACS grafy různých vytvořených skupin myší.

Obrázek 4: Účinky doplňku stravy ECD na přirozené zabíječské buňky (NK buňky, CD3 plus CD49 plus T buňky) v populacích lymfocytů periferní krve myší SAM-P8. Osmiměsíční samci myší SAM-P8 a kontrolní myši SAM-RI byli rozděleni do 5 skupin. 3 léčené skupiny zvířat SAM-P8 byly krmeny po dobu čtyř týdnů dietami doplněnými o nízké (100 mg/kg), střední (500 mg/kg) a vysoké (2500 mg/kg) dávky ECD a dvě kontrolní skupiny zvířat byly pro stejná strava bez suplementace. Po 12hodinovém hladovění byla zvířatům v anestezii odebrána periferní krev a podrobena analýze FACS, vše jak je popsáno v části 5. (a) Reprezentativní grafy FACS různých skupin myší vytvořených vtokem na CD3 plus CD49 plus T-buňky. (b) Histogram ukazující procento přirozených zabíječů T-buněk v periferní krvi různých skupin zvířat. Sloupky představují průměr ± SD (každá skupina,=10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

Obrázek 5: Účinky doplňku stravy ECD na přirozené zabíječské buňky (NK buňky, CD3 plus CD49 plus T-buňky) ve slezinných lymfocytech myší SAM-P8. Osmiměsíční samci myší SAM-P8 a kontrolní myši SAM-RI byli rozděleni do 5 skupin. 3 léčebné skupiny zvířat SAM-P8 byly krmeny po dobu čtyř týdnů dietami doplněnými o nízké (100 mg/kg), střední (500 mg/kg) a vysoké (2500 mg/kg) dávky ECD a dvě kontrolní skupiny zvířat byly krmeni stejnou stravou bez suplementace. Po 12hodinovém hladovění byly zvířatům v anestezii odebrány lymfocyty sleziny a podrobeny analýze FACS, jak je popsáno v části 5. (a) Reprezentativní graf FACS různých skupin myší vytvořených gatingem na CD3 plus CD494 T buňkách. (b) Histogram ukazující procento přirozených zabíječů T buňky ve slezinných lymfocytech různých zvířecích skupin. Sloupce představují průměr SD (v každé skupině,= 10), # < 0,01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Další diferenciace na různé typy zralých lymfocytů. V důsledku toho tyto Sca-1 pozitivní buňky představují hlavní zdroj naivních T lymfocytů v periferní krvi. Obrázek 6 ukazuje, že ve srovnání s kontrolními myšmi SAM-R1 byla relativní intenzita fluorescence Sca-1 pozitivních buněk u myší SAM-P8 podstatně nižší. Ukázalo se, že suplementace stravy u myší SAM-P8 třemi různými dávkami ECD významně zvyšuje relativní intenzitu fluorescence Sca-1 pozitivních buněk (obrázek 6).

Výhoda byliny cistanche: proti stárnutí