Část 1: Účinky vodného extraktu Cistanche Tubulosa na střevní mikroflóru myší s střevními poruchami

Kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comDalší informace

Poruchy střevní mikroflóry jsou spojeny s mnoha nemocemi. *e vodný extrakt zCistanche tubulosa (CT), tradiční čínská bylinná formule, údajně hraje roli vochrana lidského střeva. O jeho účincích na střevní mikroflóru je však známo jen málo. *E tato studie byla provedena s cílem zjistit, zda CT vodný extrakt může modulovat střevní mikrobiom u myší se střevními poruchami. Zjistili jsme, že poškozenéstřevní morfologievyplývající z léčby cefiximem by mohl být zachráněn pomocí CT vodného extraktu. *Srovnání mikrobiální diverzity mezi myšmi léčenými CT extraktem a kontrolními myšmi také ukázalo, že porucha v mikrobiomové komunitě modelových skupin by mohla být obnovena léčbou vysokými a středními koncentracemi vodného extraktu. Léčba cefiximem vedla k významnému poklesu bakterií mléčného kvašení; doplnění CT vodného extraktu však obnovilo růst těchto bakterií mléčného kvašení. Kromě toho byl CT vodný extrakt schopen zmírnit dramatické změny v metabolických drahách střevního mikrobiomu vyvolané cefiximem. *Tyto nálezy poskytly vhled do příznivých účinků CT vodného extraktu na střevní mikroflóru a také poskytly důležitý odkaz pro vývoj příbuzných léků v budoucnu.

Cistanche pro relaxační střeva, prosím klikněte naTadydozvědět se více

Úvod

prokázali, že C.deserticola polysacharidyindukovat melanogenezi umelanocyty, snižuje oxidační stres[15], zmírňuje kognitivní dysfunkci regulací antioxidačních a protizánětlivých procesů u potkanů [16], chrání buňky PC12 před poraněním vyvolaným OGD/RP [17], zvyšuje absorpci echinakosidů in vivo a ovlivňuje střevní mikroflóru [18]. Probiotika jsou živé nepatogenní mikroorganismy, které mají zdravotní přínosy a poskytují mikrobiální rovnováhu v gastrointestinálním traktu, pokud jsou podávány v dostatečném množství [19]. *ey může zvýšit nespecifické buněčné imunitní odpovědi charakterizované aktivací makrofágů, buněk přirozeného zabijáka (NK) a antigenně specifických cytotoxických T lymfocytů a uvolňováním různých cytokinů způsobem specifickým pro kmen a závislým na dávce [20]. Probiotické kmeny zlepšují vlastnosti střevního epitelu prostřednictvím modulace TJ a bylo prokázáno, že specifické probiotické kmeny regulují expresi mucinu, čímž ovlivňují vlastnosti vrstvy hlenu a nepřímo regulují imunitní systém střeva [21]. Kmeny bakterií mléčného kvašení (LAB) a Bifidobacterium jsou hlavní probiotika, která byla použita v mnoha oblastech [22–26]. Přínosy pro zdraví jsou četné, přičemž jejich antioxidační kapacita je důležitým faktorem v jejich zdravotních funkcích[27]. Probiotika mohou chelovat kovové ionty, aby se zabránilo jejich katalyzaci oxidace [28, 29]; mohou také zvýšit expresi antioxidačních enzymů [30, 31], produkovat různé metabolity s antioxidační aktivitou [32, 33], zprostředkovávat antioxidační signální dráhy [34–36] a regulovat enzymy produkující reaktivní formy kyslíku (ROS) a nést odpovědnost střevních mikroorganismů na oxidační stres[37]. Nedávná studie ukázala, že polysacharidy CD by mohly stimulovat růst některých bakterií kyseliny mléčné, což by mohlo být prospěšné pro lidské zdraví [38]. Obsah polysacharidů v CD se však liší od obsahu CT [7, 39] a tento rozdíl může vést k difekferentním účinkům střevních mikroorganismů. Kromě toho, i když CD polysacharidy mohou snížit oxidační stres aktivací dráhy NRF2/HO-1 [15], účinky jednolých polysacharidů se mohou lišit od celkového účinku vícenásobných kompozic v CT. *us, je nutné přesně definovat účinky CT vodných extraktů na střevní mikroorganismy. Kromě toho mohou ventilátory také odolávat oxidačnímu stresu [40] a potlačovat zánětlivé reakce zprostředkované lipolysachou aktivací dráhyKeap1/Nrf2/HO-1 [41]. * před, stanovení účinku CT vodného extraktu má velkou hodnotu. Kromě toho účinky některých složek extraktu vodného CD na oxidační stres a střevní flóru naznačují, že odolnost vůči oxidačnímu stresu může korelovat se změnami střevní flóry. Abychom zaplnili mezery ve znalostech o výše uvedených tématech, zkoumali jsme účinky extraktu CTaqueous na střevní mikroflóru myší s poruchami střevníflóry. *Tyto výsledky poskytnou cenné informace o možných mechanismech, kterými se mění střevní flóra a propůjčuje střevní odolnost vůči oxidačnímu stresu.

2. Materiály a metody

podávané denně ve 12:00 h a jiné látky byly podávány denně v 15:00 h. Během experimentů byly skupiny C, D, E a F udržovány v modelovém stavu střevních poruch. *Výkaly byly odebírány každých sedm dní na sterilně ovladatelném stole a skladovány při teplotě −20 °C.2.4. Histopatologické pozorování myšího tlustého střeva. Na konci experimentu byly myši usmrceny cervikální dislokací a jejich obsah tlustého střeva byl shromážděn na sterilním operabilním stole a uložen při teplotě −80 °C; současně byly vzorky tkáně tlustého střeva fixovány v 10% neutrálním formalinu.*en, vzorky byly dehydratovány pomocí gradientní koncentrace ethanolu, hyalinizovány pomocí xylenu, vloženy do parafínu, rozděleny a obarveny hematoxylinem-eosinem. Morfologické změny v sliznici tlustého střeva byly pozorovány a porovnány pomocí optického mikroskopu. Byla změřena délka klků a hloubka krypty v tlustém střevě a byl vypočítán poměr délky klků k hloubce krypty (hodnota V / C) (51).2.5. Extrakce DNA a konstrukce knihoven. DNA byla extrahována z výkalů pomocí sady E.Z.N.A. ®Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) podle protokolu výrobce. Kvalita DNA byla stanovena pomocí fluorometru (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, USA). Spárované primery v oblasti V3-V4 16s rDNA byly navrženy tak, aby zesílily oblast a produkovaly fragmenty DNA o 466 bp. *e dopředný primer byl 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-) a reverzní primer byl 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Každý objem PCR byl 25 μl, obsahující 2,5 μl 10 × PCR buffffer, 2 μl dNTP, 1 μl každého primeru a 20–30 ng DNA šablony. *en, indexované adaptéry byly připojeny ke konci amplikonů pro generování sekvenčních knihoven. *knihovny byly validovány pomocí fluorometru QuantiFluor™ a kvantifikovány na 10 nmol.2.6. 16s rRNA Gen Sequencing a Mikrobiální komunitní analýza. *e Platforma Illumina (Illumina MiSeq) byla použita k získání 2 × 250 bp spárovaných dat. Operační taxonomické jednotky (OTU) byly získány pomocí softwaru Uparse prostřednictvím standardního shlukování s 97% podobností. *Naivní Bayesianassignment algoritmus klasifikátoru RDP byl použit k zarovnání OTU s databází Greengene Release 13.5 a provedení anotace druhů. Alfa diverzita střevní mikroflóry byla vypočtena pomocí Shannonových a Simpsonových indexů a rozdíly mezi skupinami byly analyzovány lineární diskriminační analýzou Effffect Size (LEfSe). *e Beta diverzita byla analyzována hlavní souřadnicovou analýzou (PCoA) Bradyho–Curtisových odlišností. PICRUSt2 byl použit k odhadu mikrobiální metabolické kapacity střevního mikrobiomu [42].2.7. Statistická analýza dat. SPSS 20 byl použit pro jednosměrnou ANOVA a experimentální data byla vyjádřena jako X ± S; X označuje průměrnou hodnotu a S označuje směrodatnou odchylku.

Cistanche pro zlepšení imunity

3. Výsledky

3.1 8 Vliv VODNÉHO EXTRAKTU CT na morfologii tlustého střeva*E Reprezentativní sloučeniny (echinakosid a acetonid) a jejich koncentrace CT extraktu byly validovány pomocí HPLC (obrázek S1). Abychom zjistili účinek vodného extraktu na střeva, zkoumali jsme délku klků tlustého střeva a hloubku výklenků po ošetření vodným extraktem. *e klky tlustého střeva ve skupinách s normálními a vysokými dávkami (A, B a D) byly delší a prstovité, zatímco klky tlustého střeva v modelové a nízkodávkové skupině (C a F) byly krátké a špičky klků tlustého střeva byly zlomené (obrázek 1). V souladu s tím vysokodávkovaný CT vodný extrakt významně prodloužil délku klků tlustého střeva a snížil hloubku vybrání u myší se střevními poruchami ve srovnání s myší v modelové skupině (P< 0.01).="" in="" contrast,="" recess="" depth="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" high-dose="" group="" and="" the="" normal="" group="" (p="">0,05) (tabulka S1). *Výsledky ukázaly, že vysoká dávka CT vodného extraktu může zlepšit morfologii uvnitř tlustého střeva myší se střevními poruchami.3.2. 8e Účinek CT vodného extraktu na rozmanitost mikroflóry. Provedli jsme sekvenování genu rRNA 16s, abychom prozkoumali potenciální příčinu morfologických změn uvnitř tlustého střeva a prozkoumali změny střevní mikroflóry po léčbě CT vodným extraktem. Z nezpracovaných dat bylo získáno v průměru 100 553 účinných tagů v rozmezí od 77 734 do 125 144 (tabulka S2). *Jeleni byli seskupeni do 4932 OTU (tabulka S3). Poté jsme analyzovali rozmanitost střevní mikroflóry na základě Theseus. *e Shannonovy a Simpsonovy indexy neprokázaly žádný rozdíl mezi skupinou A (normální s VODNÝM EXTRAKTEM CT) a skupinou B (normální bez VODNÉHO EXTRAKTU CT) (obrázek 2 a)). * je indikováno, že u myší bez léčby cefiximem nemusel mít VODNÝ EXTRAKT PRO CT žádné další příznivé nebo škodlivé účinky na rozmanitost střevní mikroflóry. α diverzita v modelové skupině (C) však vykazovala klesající trend ve srovnání s normálními skupinami. *e Myši ošetřené vodnými extrakty s vysokými a středními dávkami CT vykazovaly známky zotavení zα-diverzity, zatímco u myší léčených vodným extraktem s nízkými dávkami CT nebyl pozorován (obrázek 2 a)). Mezitím PCoA odhalila, že normální skupiny (A a B) a skupiny střevních poruch, kterým byly podávány výtažky s vysokou dávkou (D) a střední dávkou (E) CTaqueous, měly tendenci mít kratší vzdálenosti mezi vzorky než skupiny v modelové skupině a v nízkodávkové skupině CTaqueous extract supplement (F) (obrázek 2 (b)). *Výsledky ukázaly, že CT vodný extrakt by mohl pomoci zlepšit rozmanitost střevní mikroflóry u myší se střevními poruchami.

3.3 Změny ve složení střevní mikroflóry ošetřené VODNÝM EXTRAKTEM CT. *Profily složení mikrobioty byly porovnány mezi různými skupinami. Na úrovni kmenů byla relativní četnost proteobakterií v modelové skupině vyšší než v ostatních skupinách.

Obrázek 1: *e vliv vodného extraktu Cistanche tubulosa (CT) na morfologii tlustého střeva: A, normální skupina s přidaným střednědávkovým vodným extraktem Cistanche tubulosa (CT); B, normální skupina; C, skupina modelů; D, modelová skupina s přidaným vodným extraktem s vysokými dávkami CT; E, modelová skupina s přidaným vodným extraktem ct střední dávky; F, modelová skupina s přidaným vodným extraktem s nízkou dávkou CT. a) Skupina A. b) Skupina B. c) Skupina C. d) Skupina D. e) Skupina E. f) Skupina F.

(Obrázek 3 a)). *Zvýšení proteobakterií naznačuje, že mikrobiom modelových myší byl změněn cefiximem a že CT vodný extrakt by mohl prospět střevní mikroflóře, protože zvýšená prevalence proteobakterií je centrálním markerem neuspořádané střevní flóry [43–45]. Kromě toho se na úrovni rodu snížila relativní četnost Lactobacillus v modelové skupině ve srovnání s normální a vysokodávkovou skupinou; ve srovnání se skupinou se střední a nízkou dávkou se však zvýšila(obrázek 3 písm. b)). *Tyto výsledky ukázaly, že vysokodávkový CTaqueous extrakt může podporovat růst některých bakterií z rodu Lactobacillus. Diferenciální mikroflóra mezi studovanými skupinami byla dále stanovena podle analýzy LEfSe. * analýza ukázala, že po léčbě cefiximem se relativní četnost Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales a Chloroflflexi významně zvýšila, zatímco relativní četnost laktobacilů, Eubacterium_nodatum_group, Pseudonokardiálů a Christensenellaceae_R-7_group významně snížena ve srovnání s těmi v normální skupině (obrázek 4(a)). Je pozoruhodné, že když byla modelová skupina doplněna o vysokodávkovaný CT vodný extrakt, relativní četnost Muribaculaceae, Lactobacillus, Kineosporiaceae, Eubacterium no datum group a Pedobacter se významně zvýšila ve srovnání s těmi v modelové skupině. Mezitím se relativní četnost Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 a Candidatus Stoquefifichus významně snížila ve srovnání s těmi v modelové skupině (obrázek 4(b))

Obrázek 2: Analýza diverzity střevní mikroflóry myších výkalů. a) α diverzita bakteriálních společenstev měřená Shannonovým indexem (A) a Simpsonovým indexem (B); b) graf hlavní souřadnicové analýzy (PCoA) vizualizující data na základě Brayových a Curtisových rozdílů. A, normální skupina s přidaným vodným extraktem Cistanche tubulosa (CT) střední dávky; B, normální skupina; C, skupina modelů; D, modelová skupina s přidaným vysokodávkovým CT vodným extraktem; E, modelová skupina s přidaným vodným extraktem ct střední dávky; F, modelová skupina s přidaným vodným extraktem CT s nízkou dávkou.