ČÁST 1: Extrakty z cistanche zlepšují neurotoxicitu indukovanou peroxidem vodíku u nových buněčných modelů neuroblastomu transfekovaného mutantem DJ‐1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1. ÚVOD

Mezi hlavní neurodegenerativní onemocnění patříAlzheimerova chorobachoroba, Parkinsonova choroba (PD), Huntingtonova choroba a další. Mezi těmito poruchami je četnost výskytu PD(Parkinsonova choroba) je druhý na světě a dosahuje 1 až 2 procenta u lidí starších 60 let (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Jako hlavní neurologická charakteristika PD jsou dopaminergní neurony v substantia nigra pars compacta progresivní degenerativní (Glizer & MacDonald, 2016), což je doprovázeno výskytem ‐synukleinových inkluzí nazývaných Lewyho tělíska (Zhang, An, Zhang a Pu , 2010). V patogenezi PD jsou jako hlavní symptomy PD na klinice diagnostikovány klidové třesy, rigidita, bradykineze a posturální abnormality. Ačkoli přesné progresivní degenerativní mechanismy dopaminergních neuronů nejsou pochopitelné, buď příčiny prostředí včetně expozice insekticidům, neurotoxickým činidlům a těžkým kovům, nebo genetické příčiny, jako jsou mutace Parkina (Kitada et al., 1998), ‐synuklein (Polymeropoulos et al., 1997) a DJ‐1 (Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003), se předpokládá, že vedou k výskytu PD. K dnešnímu dni počet missense mutací, frameshift mutací a delecí velkých fragmentů způsobených mutacemi genu DJ‐1 přesahuje 10 (Andres‐Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). V rámci proteinu DJ‐1 je důležitá substituce leucinu166prolinu (L166P). Kromě toho se také ukázalo, že oxidační stres se vyskytuje u PD (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) a podílí se na její patogenezi (Hague et al., 2003).

DJ‐1 gen obsahující osm exonů distribuovaných přes 24 kb se u lidí nachází na chromozomu 1p36 (Bonifati et al., 2003) a kóduje vysoce konzervovaný protein obsahující 189 aminokyselin. Protein patřil do rodiny ThiJ/PfpI, existuje v homodimerní formě. Gliové buňky v kortexu a substantia nigra a striatum se nacházejí především v oblastech proteinu DJ‐1 (Olzmann et al., 2007). V těchto buňkách hraje DJ-1 následující role, jako je onkogen (Nagakubo et al., 1997), regulace transkripce (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi‐ Niki, Taira, Iguchi‐Ariga, & Agria, 2003 ), antioxidační stres (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), doprovod (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete a Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko a Fink, 2006) a proteáza (Abou‐Sleiman, Healy, Quinn, Lees a Wood, 2003).

Léčba neurodegenerativních onemocnění: extrakt z cistanche

Cistancheje tradiční čínská medicína a byla používána hlavně k léčbě andrologických onemocnění po staletí. Hlavní aktivní složkyCistanchejsou fenylglykosidy zahrnující 34 sloučenin, jako je akteosid, echinakosid atd. Farmakologické účinkyExtrakty z cistanchezahrnují zlepšení sexuálních funkcí, zpomalení stárnutí, zvýšení schopnosti učení a paměti, neuroprotekci, imunomodulaci, protiúnavovou, antiischemickou a jaterní ochranu (Tu et al., 2011). Kyselina kávová je jedním z hlavních metabolitů Cistanche (Yan, 2018).

Mezi běžně používané buněčné modely PD patří buňky PC12 indukované 1‐methyl‐4‐ fenylpyridiniovými ionty (Abou‐Sleiman et al., 2003) a buňky neuroblastomu indukovaného peroxidem vodíku (H2O2) (SH‐SY5Y) (Zhang et al. ., 2009). Typické patologické rysy PD však v těchto modelech nejsou přítomny. Abychom vyvinuli fyziologicky relevantnější buněčný model PD, v této studii jsme vytvořili H2O2 indukované L166P a C106S DJ‐1‐transfekované SH‐SY5Y buňky a zkoumali jsme účinkyExtrakty z cistanchea klíčové bioaktivní sloučeniny, včetně akteosidu, echinakosidu, kyseliny kávové aCelkové glykosidy Cistancheu těchto dvou modelů vůbec poprvé.

Extrakt Cistanche proti neurodegenerativním onemocněním

2. MATERIÁLY A METODY

2,1|Plazmidy, léky, chemikálie a buňky

Plazmidy FLAG‐L166P DJ‐1, FLAG‐C106S DJ‐1 a polyklonální protilátky anti‐DJ‐1 laskavě dodal Dr. Hiroyoshi Ariga, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Univerzita Hokkaido. Dehydratované minimální základní médium (MEM) a médium F-12 byly zakoupeny od Gibco. Lipofectin byl od společnosti Invitrogen. FastDigest Xho I a FastDigest EcoR I byly od společnosti Fermentas. Souprava pro přípravu plasmidu bez endotoxinu byla od biotech. Buněčná linie SH‐SY5Y byla z buněčné banky Čínské akademie lékařských věd. Souprava činidel pro analýzu proteinů BCA byla od Pierce. PVDF membrány byly od Millipore. Anti‐FLAG polyklonální protilátka byla od GeneTex.Extrakty z cistanche, včetně akteosidu, echinakosidu, kyseliny kávové a celkových glykosidů Cistanche, byly dodány Ústavem přírodních léčiv, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University.

2,2|Amplifikace, extrakce a čištění plazmidů

Po kultivaci buněk Escherichia coli JM109 v kapalném médiu LB do OD600=0.5 byly připraveny kompetentní buňky pomocí metody chloridu vápenatého. Kompetentní E. coli byly poté transformovány plasmidovou DNA pomocí metody tepelného šoku, poté byly transformanty kultivovány na LB miskách obsahujících ampicilin po dobu 16–24 hodin při 37 °C. Poté byla vybrána úspěšně transformovaná monoklonální kolonie a kultivována v LB kapalném médiu obsahujícím 50 ug/ml ampicilinu po dobu dalších 12 hodin při 37 stupních. Plazmidy byly extrahovány a purifikovány pomocí soupravy pro přípravu plazmidu bez endotoxinu podle pokynů výrobce.

2,3|Identifikace plazmidu

Extrahované plazmidy byly podrobeny enzymatickému štěpení, po kterém byly plazmidy a štěpené fragmenty zkoumány pomocí elektroforézy na 1% agarózovém gelu. Výsledný gel byl barven v EB roztoku po dobu 20–25 minut při pokojové teplotě a fotografován.

2,4|Transfekce plazmidu do buněk SH‐SY5Y

Purifikovaná plazmidová DNA byla transfekována do buněk SH‐SY5Y kultivovaných v médiu MEM/F‐12 obsahujícím 10 procent fetálního hovězího séra. Transfekované buňky byly poté selektovány v médiu obsahujícím 400 ug/ml G418, načež bylo použito 200 ug/ml G418 k udržení stabilně transfekované buněčné linie.

2,5|Identifikace transfekovaných buněk pomocí Western blotu

Transfekované buňky SH‐SY5Y byly lyžovány v RIPA pufru. Po odstředění lyzátu byla celková koncentrace proteinu v supernatantu stanovena pomocí reagenční soupravy pro analýzu proteinů BCA. Stejná množství proteinového extraktu byla poté podrobena elektroforéze na 12,5% SDS-polyakrylamidovém gelu a přenesena na PVDF membránu. PVDF membrána byla blokována 5% odtučněným sušeným mlékem v roztoku TBST a zpracována pro imunodetekci. Jako primární protilátky byly použity anti‐FLAG a anti‐DJ‐1, sekundární protilátkou byl IgG konjugovaný s HRP. Pro detekci cílových proteinů byl použit vylepšený chemiluminiscenční detekční systém.

2,6|Imunocytochemická identifikace transfekovaných buněk

Transfekované buňky SH‐SY5Y byly fixovány 4% roztokem paraformaldehydu, permeabilizovány 0,3% roztokem Triton X-100 a blokovány 10% kozím sérem. Blokované buňky byly poté inkubovány nejprve s anti‐FLAG a anti‐DJ‐1 polyklonální protilátkou a poté s FITC‐konjugovanou kozí antikráličí sekundární protilátkou. Buněčná jádra byla obarvena Hoechst 33342 a buňky byly vizualizovány pod inverzním fluorescenčním mikroskopem (IX‐71, Olympus).

2,7| Test životaschopnosti buněk

Netransfekované a transfekované buňky SH‐SY5Y byly naneseny do 96‐ extraktů, včetně akteosidu, echinakosidu, kyseliny kávové a celkových glykosidů Cistanche (všechny 10, 20 a 40 ug/ml), byly přidány a buňky byly inkubovány po dobu 6 hodin před ošetřením 0,2 mM H202 po dobu další 1 hodiny. Médium bylo odstraněno a životaschopnost buněk byla testována pomocí MTT, jak je popsáno výše.

2,8|Účinky extraktů Cistanche na životaschopnost buněk

byly přidány extrakty, včetně akteosidu, echinakosidu, kyseliny kávové a celkových glykosidů Cistanche (všechny 10, 20 a 40 ug/ml, v daném pořadí), a buňky byly inkubovány po dobu 6 hodin před ošetřením 0,2 mM H2O2 na další 1 hod. Médium bylo odstraněno a životaschopnost buněk byla testována pomocí MTT, jak je popsáno výše.

2,9|Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD ze tří nezávislých experimentů. Rozdíly mezi skupinami byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA a metody LSD se softwarem SPSS 22.0. Hodnoty p < 0,05="" byly="" považovány="" za="">

Cistanchebylina

3|VÝSLEDEK

3,1|Plazmidy byly úspěšně transformovány a purifikovány. Po oddělené expresi v E. coli JM109 byly plazmidy extrahovány a zkoumány pomocí elektroforézy na 1% agarózovém gelu po štěpení restrikčním enzymem (obrázek 1). Plazmidy o velikosti 6,2 kb byly štěpeny na lineární fragmenty DNA o velikosti 5,4 a 0,8 kb, což potvrdilo, že plazmidy L166P a C106S DJ‐1 byly úspěšně exprimovány a purifikovány.

3,2|Identifikace transfekovaných buněk metodou Western blotting. Jak je znázorněno na obrázku 2, detekovali jsme pásma FLAG‐L166P DJ‐1 a FLAG‐C106S DJ‐1 při asi 70 kDa. Vysoké hladiny proteinu označeného FLAG v transfekovaných buňkách SH‐SY5Y naznačují, že mutanty L166P a C106S DJ‐1 byly silně exprimovány v příslušných transfektantech.

3,3|Imunocytochemická identifikace transfekovaných buněk. Ukazuje silné fluorescenční signály z transfekovaných buněk SH‐ SY5Y po ​​inkubaci s protilátkami anti‐DJ‐1 nebo anti‐FLAG. To potvrzuje vysoké hladiny L166P a C106S DJ‐1 exprimované v transfektantech.

3,4|Transfekované buňky byly citlivější na H2O2 než netransfekované buňky. Po inkubaci po dobu 1 hodiny v přítomnosti odstupňovaných koncentrací H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} },5, respektive 1 mM), životaschopnost buněk SH‐SY5Y transfekovaných L166P nebo C106S DJ‐1 byla ve srovnání s netransfekovanými buňkami snížena v závislosti na dávce

3,5|Extrakty cistanche inhibovaly snížení vyvolané H2O2 SH-SY5Y buněčné životaschopnosti v závislosti na dávce inhibované léčbouExtrakty z cistanchevčetně akteosidu, echinakosidu, kyseliny kávové a celkových glykosidů Cistanche (všechny 10, 20 a 40 ug/ml, v daném pořadí).

Cistanche