Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, Pengfei Tua,b,

Yong Jiang,⁎

acetát Klíčová laboratoř přírodních a biomimetických léčiv, Fakulta farmaceutických věd, Pekingská univerzita, Peking 100191, Čínské moderní výzkumné centrum pro tradiční čínskou medicínu, Škola čínské Materia Medica, Pekingská univerzita čínské medicíny, Peking 100029, Čína

Přijato 17. května 2017; revidováno 20. června 2017; přijato 17. července 2017

Abstraktní: Cistanche deserticola(CD) je jednou ze dvou autoritativních zdrojových rostlinCistanches Herba, známá léčivá rostlina. Zde byla 1H NMR spektroskopie použita k charakterizaci chemického profilu a k rozlišení různých částí, stejně jako k navržení nového pracovního postupu pro CD. Přiřazení signálu bylo dosaženo pomocí několika jednorozměrných a dvourozměrných NMR spektroskopických technik v kombinaci s dostupnými databázemi a autentickými sloučeninami. Horní části rostliny byly odlišeny od spodních částí kombinací 1H NMR spektroskopického souboru dat s vícerozměrnou statistickou analýzou. Ukázalo se, že nová metoda zpracování, která spojuje napařování s lyofilizací, je lepší než napařování spojené se sušením v troubě nebo přímé lyofilizace prostřednictvím holistické metabolomické charakterizace na bázi 1H NMR. Fenylethanoidové glykosidy, hlavně echinakosid aakteosidbyly vytříděny a potvrzeny jako chemické markery zodpovědné za vykazování nadřazenosti nového pracovního postupu zpracování, zatímco sériové primární metabolity, zejména sacharidy a metabolity cyklu trikarboxylových kyselin, byly nalezeny jako primární molekuly řídící rozlišení mezi horní a dolní částí Rostlina. Souhrnně byla 1H NMR spektroskopie demonstrována jako všestranný analytický nástroj pro charakterizaci chemického profilu a pro vedení hloubkového využití CD poskytováním komplexních kvalitativních a kvantitativních informací.

KLÍČOVÁ SLOVA:Cistanchedeserticola; metabolomika založená na 1H NMR; Pracovní postup zpracování; Různé části;Fenylethanoidní glykosid; metabolity cyklu trikarboxylových kyselin;Echinakosid; Akteosid

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

1. Úvod

Cistanches Herba(CH, čínský název: Roucongrong), původně archivováno vČínská Materia Medica od Shen Nonga, byl široce považován za jednu z nejznámějších jedlých tonických a léčivých rostlin a ctěn jako "Ženšen pouští"^1,2. Jako jeden ze dvou oficiálních zdrojových závodů CH,Cistanche deserticola(CD, Orobanchaceae) je holoparazitická rostlina rozšířená hlavně na severu a severozápadě Číny^2,3. V tradičních čínských léčebných postupech se po staletí široce používá k léčbě nedostatečnosti ledvin charakterizované impotencí, bolestmi v bedrech a kolenou, ženskou sterilitou a zácpou.^3–5. Divoké zdroje CD jsou však v posledních letech na pokraji vyhynutí kvůli nadměrné sklizni a byly uvedeny jako jedna z rostlin třídy II, které potřebují ochranu v Číně.¹. Navíc CD nabízí důležitý příspěvek k ovládání pouště. Proto je kritické, ale náročné používat tento rostlinný materiál efektivněji.

Vědecké studie naCistanchezávody zahájené v 80. letech 20. století⁶. Fytochemické výzkumy odhalily existenci různých chemických typů,e.g., fenylethanoidové glykosidy (PhG), iridoidy, lignany, mastné kyseliny, alditoly a sacharidy v rámci CD⁷. Mezi nimi jsou PhGs nejčastěji zmiňovány kvůli jejich širokému spektru biologických aktivit, včetně antioxidačních, anti-agingových, protiúnavových, protizánětlivých, posilujících tělesnou imunitu, zlepšování učení a paměti myší s Alzheimerovou chorobou atd.¹. PhGs v poslední době přitahují stále větší pozornost jako potenciální noví kandidáti na léky pro léčbu neurodegenerativních poruch. Konkrétně byla vyvinuta amalgamace celkových PhG nalezených v CH jako nová droga, registrovaná jako celkováCistancheglykosidkapsle (Memoregain^®) k léčbě vaskulární demence⁸. Echinakosid, nejhojnější a nejúčinnější složka celkových PhG, vykazuje antiapoptotické účinky na neuronální buňky SHSY5Y po ​​apoptóze indukované TNF a ruší deficity u myší s Parkinsonovou chorobou⁹. Navíc další primární aktivní sloučenina, akteosid (také známý jako verbaskosid), je schopen antagonizovat apoptózu v neuronech.¹⁰k obraně proti neurotoxicitě u buněk PC12 vyvolané 1-methyl-4-fenylpyridiem nebo glutamátem¹¹a ke zlepšení skopolaminem vyvolaných deficitů paměti².

PodobnýCordycepsaŽenšen, CD bylo široce konzumováno a ceněno jako zdravá výživa. Skutečné a vnímané přínosy CD pravděpodobně budou hrát rozhodující roli pro cenu surové drogy. Vzhledem k velkému množství surových drog CD jsou plátky na trhu populárnější. Obecně platí, že enzymatická inaktivace a deprivace vody jsou dva klíčové kroky během zpracování léčivých plátků. Konvenční metody sušení CD zahrnují izolaci, sušení v peci, solení a skladování ve sklepě. Produkty z těchto procesů však obvykle trpí špatným vzhledem a nízkým obsahem PhG, což brání širokému uplatnění a spotřebě CD. V roce 2007 naše skupina navrhla novou techniku ​​zpracování CD, která dramaticky zachovala obsah echinakosidu aakteosidv plátcích¹⁴. Protože však produkty z tohoto procesu stále trpí nepříjemným vzhledem, v současné době popisujeme metodologii zpracování pro zlepšení vzhledu a pro další zachování obsahu PhG ve zpracovávaných materiálech.

Pro chemickou analýzu CD se dosud používaly sériové analytické nástroje, včetně tenkovrstvé chromatografie, vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) ve spojení s různými detektory, jako je detektor diodového pole (DAD), odpařovací detektor rozptylu světla (ELSD), detektor elektronového záchytu (ECD) a tandemový hmotnostní spektrometr (MS/MS). Jako kvalitativní markery byly nejčastěji přijímány PhG, zejména echinakosid a akteosid¹. Otisk prstu této rostlinné drogy byl také vyvinut pomocí HPLC–DAD a HPLC–DAD–MS/MS^15,16. Přesto zůstává výzvou posoudit kvalitu CD kvůli jeho extrémně složitému chemickému profilu. Obecně řečeno, přístupy zaměřené na několik analytů nejsou schopny nabídnout holistický chemický pohled na surové extrakty, ačkoli z LC−MS/MS lze získat dostatek kvalitativních a kvantitativních informací. Analytické strategie související s HPLC mohou být navíc omezeny velkým množstvím rozpouštědel, únavnou přípravou vzorků a/nebo časově náročnými postupy. Pro optimální chemickou analýzu je proto nutný nový analytický nástroj, který je schopen poskytnout komplexní informace o souboru sloučenin. Naštěstí,¹H NMR spektroskopie byla přesně demonstrována jako atraktivní nástroj „vše v jednom“, který je schopen nabídnout nejen kvalitativní datový soubor, ale také kvantitativní informace pro širokou škálu primárních i sekundárních metabolitů s jednoduchou přípravou vzorku a rychlým získáváním^17–20. Až dosud široké aplikace¹H NMR spektroskopie byla spuštěna pro simultánní stanovení, chemické profilování a metabolomiku komplexních matric.

Ačkoli bylo provedeno několik výzkumů tohoto vzácného rostlinného léku, jeho globální chemický profil je z velké části neznámý. Protože CD je parazitická rostlina, spodní části by měly být zodpovědné za přenos živin, zejména primárních metabolitů, z hostitele do horních částí, zatímco intenzivní energetický metabolismus, jako je květ, obvykle probíhá v horních částech. Proto je rozumné předpokládat, že pro metabolom různých částí dochází k rozdílům. V této studii se proto snažíme 1) komplexně charakterizovat chemický profil použití CD¹H NMR spektroskopie spojená s různými dvourozměrnými (2D) NMR měřeními; 2) objasnit rozdíly mezi horní a spodní částí a 3) navrhnout nový pracovní postup zpracování¹Metabolomická studie založená na H NMR. Očekává se, že získaná zjištění poskytnou solidní vodítko pro další využití této léčivé byliny lepším způsobem, zejména pro použití různých částí a technik zpracování.

2. Experimentální

2.1. Rostlinné materiály

Dvanáct šarží čerstvých materiálů (CD1–CD12, tabulka S1, doplňkové informace) bylo shromážděno z autonomních oblastí Vnitřní Mongolsko, Xinjiang a Ningxia v Číně. Botanický původ všech surových materiálů byl ověřen jako

Metabolomika založená na 1H NMRCistanche deserticola 649C. deserticolaod jednoho z autorů, prof. Pengfei Tu. Všechny exempláře voucherů jsou uloženy v herbáři Centra moderního výzkumu tradiční čínské medicíny na Pekingské univerzitě (Peking, Čína).

2.2. Chemikálie a činidla

Methanol-d4 (CD3OD, množství deuteria, 99,8 atomových procent D), deuterovaná voda (D2O, množství deuteria, 99,8 atomových procent D) a 3-trimethylsilyl [2,2,3,3-}d4 sodný ] propionátu (TSP-d4) byly získány od Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA). Metanol analytické čistoty byl zakoupen od Beijing Chemical Works (Peking, Čína).

Autentické sloučeniny, včetně echinakosidu, akteosidu a mannitolu, byly v naší laboratoři dříve purifikovány z CD14 a sacharóza, -galaktóza spolu s -glukózou byly dodány společností Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). Čistoty všech referencí byly stanoveny na více než 98 procent pomocí HPLC–UV a 1H NMR analýz.

2.3. příprava vzorků

Všechny surové materiály (CD1–CD11) kromě CD12 byly nasekány na horní části (GU) a spodní části (GD) uprostřed celých stonků a všechny části byly nakrájeny na tenké plátky (přibližně 6- mm - každý tlustý). Následně byly všechny plátky CD1–CD12 postupně napařeny po dobu 10 min a sušeny v sušárně při 6{{40}} stupních po dobu 48 hodin, aby se získaly vzorky typu A. U některých vybraných vzorků, včetně CD1-GU, CD4-GU, byly provedeny dvě další metody zpracování, včetně přímého lyofilizace a 10-minutového napařování následovaného sekvenčním lyofilizací, CD4-GD, CD11-GD a CD12, čímž získáte dvě další sady zpracovaných vzorků (vzorky typu b a c). Podrobné popisy všech vzorků jsou uvedeny v tabulce S1. Před extrakcí byly všechny zpracované plátky rozdrceny na prášky pomocí vzorkového mlýna (model YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Čína) a prosety přes síto 80 mesh. Rozdrcené rostlinné materiály pak byly přesně zváženy (přibližně 200 mg pro každý) a extrahovány 50-násobkem 50% vodného methanolu (w/v) v ultrazvukové vodní lázni (25 stupňů) po dobu 40 minut. Poté byl přidán 50% vodný methanol, aby se kompenzovala ztráta hmotnosti během extrakce. Každý extrakt byl centrifugován při 10,000xg při 10 stupních po dobu 10 minut a přefiltrován přes 0,22 μm membránu. Alikvoty (2 ml) supernatantu byly následně odpařeny a dále exsikovány za použití vakuového sušení při 30 stupních po dobu 30 minut. Vysušené zbytky každého vzorku byly rekonstituovány s použitím 0,5 ml směsi (1:1, obj./obj.) CD3OD a fosfátového pufru v D2O obsahujícím 0,05 procenta TSP-d4 (pH 7,4) a roztok byl poté přenesen do 5 mm (id) NMR zkumavka (Norell ST500-7) pro NMR testy. Každý vzorek byl analyzován trojmo.

2.4. NMR měření

Všechna 1H NMR, 13C NMR a 2D NMR spektra byla zaznamenána na spektrometru Varian Unity Plus 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) při 499,91 MHz protonové frekvenci vybavené TCI kryosonda a Z-gradientový systém. Pro extrakty i referenční sloučeniny byly použity identické parametry, aby se získala srovnatelná spektra. Pro 'H NMR měření bylo získáno 256 skenů s následujícími parametry: šířka spektra, 8012,6 Hz (16 ppm); šířka impulsu, 11,05 μs (úhel překlopení 90 stupňů); doba akvizice, 2,04 s; relaxační zpoždění (dl), 2 s; a teplota, 298 K. CD3OD byl použit k uzamčení frekvence pole a chemické posuny všech spekter byly zarovnány pomocí signálu z TSP-d4 při 5 0.00. Pro potlačení intenzity signálu H2O, který se nacházel kolem 5 3,3021, byl přijat mokrý postup. Byla použita exponenciální funkce s faktorem rozšíření čáry (LB) jako 0,3 Hz a data byla vyplněna nulou, aby poskytla alespoň pět datových bodů nad poloviční šířkou pro každou rezonanci, aby byla zaručena přesná a spolehlivá integrace. Signály rozpadu volné indukce (FID) byly Fourierově transformovány (FT) a všechna spektra byla manuálně fázována a korigována pomocí automatizovaného programu základní polynomiální linie.

Pro usnadnění chemické charakterizace a přiřazení signálů,

13C NMR a různé 2D NMR analýzy, jako je 1H–1H

korelační spektroskopie (1H–1H COSY), heteronukleární jednoduchá kvantová koherenční spektroskopie (HSQC) a heteronukleární vícenásobná korelační spektroskopie vazeb (HMBC) byly také získány pro reprezentativní vzorek (CD1-GUI) pomocí těchto výchozích programů. Spektrální šířka pro COSY byla δ 0.5–10.0 v obou rozměrech a 128t1 přírůstcích pro každý t1. Šestnáct přechodných jevů využívajících relaxační zpoždění 1.{11} s bylo přidáno s 822 komplexními daty.

Optimální jednovazné a n-vazebné heteronukleární vazebné konstanty pro HSQC a HMBC byly 146 a 8 Hz, v daném pořadí. Rozsahy byly nastaveny jako –0.5–10.0 ppm v dimenzi F2 a 0–200 ppm v dimenzi F1.

2.5. Vícerozměrná statistická analýza NMR spektroskopického souboru dat

'H NMR spektra byla zpracována pomocí softwaru MestReNova (verze 5.2.5, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, Španělsko). Každé spektrum bylo zmenšeno na celkovou intenzitu a redukováno na integrované oblasti stejné šířky (0.02 ppm) mezi oblastmi δ 0,50–9,50 po vyloučení oblastí δ 4,70–

5.02 a δ 3,26–3,36 pro vynechání zbytkových signálů vody a metanolu. Analýza hlavních komponent (PCA) s Paretovým (Par) škálováním stejně jako ortogonální parciální diskriminační analýza nejmenších čtverců (OPLS-DA) s jednotkovým rozptylem (UV) škálováním byla provedena pomocí softwaru SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Umeå, Švédsko).

2.6. Současné stanovení echinakosidu a akteosidu pomocí HPLC-UV

Pro křížovou validaci nálezů pro tři zpracovatelské techniky byl použit systém Agilent řady 1260 HPLC sestávající z odplyňovače, kvartérního čerpadla, autosampleru, kolonové pece a detektoru diodového pole (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA) byly použity pro současné stanovení echinakosidu a akteosidu ve všech vzorcích typu a-, b- a c. Pro provádění chromatografických separací byla vybrána kolona Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, velikost částic 5 μm, Agilent Technologies) chráněná odpovídající ochrannou kolonou (10 mm × 4,6 mm, velikost částic 5 μm). Protokol přípravy vzorku, mobilní fáze a eluční program se řídily popisy archivovanými v Chinese Pharmacopeia (2010 Edition)3 s menšími úpravami. Stručně řečeno, extrakce za pomoci ultrazvuku byla prováděna po dobu 30 minut za použití 50% vodného methanolu; 30% vodný methanol byl použit jako mobilní fáze pro izokratickou eluci při průtokové rychlosti 1,0 ml/min a kolonová pec byla udržována při

30 stupňů. Detekční vlnová délka byla nastavena na 330 nm a injekční objem byl nastaven na 10 ul.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Optimalizace extrakčních a spektroskopických parametrů

Pro získání vysoce kvalitních 1H NMR spekter pro všechny vzorky byly různé parametry pečlivě optimalizovány pomocí reprezentativního vzorku (CD1-GUI). Nejprve bylo extrakční rozpouštědlo vybráno z 30% vodného methanolu, 50% vodného methanolu a methanolu. Výsledky ukázaly, že větší celkovou odezvu poskytl 50% vodný methanol než ostatní dva, což dobře souhlasí s extrakčním protokolem ověřeným v čínském lékopisu (vydání 2015)3. Extrakce za pomoci ultrazvuku byla zvolena vzhledem k jejímu pohodlnému provozu při výtěžcích srovnatelných s výtěžky extrakce horkým refluxem a Soxhletova extrakce (data nejsou uvedena). Poté byla doba trvání ultrazvuku porovnána mezi 40 a 60 minutami a 60 minut ultrazvukové vodní lázně nevykazovaly větší extrakční účinnost než 40 minut; proto bylo pro ultrazvukový přístroj nastaveno 40 minut z důvodu úspory času.

Na druhou stranu, {{0}},5 ml CD3OD-fosfátového pufru v D2O (1:1, pH 7,4) bylo porovnáno s 0,5 ml CD3OD-D2O (1: 1) a výsledky ukázaly, že fortifikace fosfátovým pufrem by mohla zabránit změnám a migraci spektrálního profilu. 2,0 ml alikvot extraktu byl postupně koncentrován, rekonstituován a podroben NMR analýze, aby se získala vhodná odezva pro většinu signálů. Dále bylo pozorováno, že mokrá metoda je lepší než program předsycení pro snížení maximální intenzity zbytkové vody (kolem 5 4,8) ve spektru. Zjistili jsme také, že zvýšení skenovacího čísla bylo výhodné pro zlepšení poměru signál-šum (S/N), což bylo docela užitečné pro citlivou detekci (zejména pro detekci stopových složek). Nicméně, protože tento přístup byl škodlivý pro rychlé měření, bylo nakonec použito 256 skenů pro každý 1H NMR test, aby se dosáhlo přijatelné citlivosti.

3.2. Přiřazení signálu 1H NMR spektra

Identifikace chemických složek v CD bylo dosaženo společnou analýzou 1H NMR, 13C NMR a 2D NMR spekter (obr. 1 a doplňkové informace obr. S1–S10) a porovnáním se vzorky autentických sloučenin, jakož i odkazem na dostupné databáze, jako je MMCD . Pravděpodobná přiřazení signálů v1H NMR jsou uvedena na obr. 1. Hodnoty chemického posunu pro domnělé identity jsou shrnuty v tabulce S2 (doplňkové informace).

Strukturní charakteristiky PhGs v rodu Cistanche byly popsány v literatuře1. Kvůli velké strukturní podobnosti mezi PhG, např. echinakosid vs. akteosid, se protonové signály fenylethanoidových skupin v 1H NMR spektru vzájemně značně překrývaly. Toto překrývání představovalo náročný analytický problém spolehlivě rozlišit mezi těmito signály. V současné studii byly signály patřící k echinakosidu a akteosidu, které jsou primárními složkami původní rostliny, jednoznačně přiřazeny pomocí referenčních sloučenin a různých NMR spekter (tabulka S2, obr. 1 a obr. S1–S6). Diagnostický signál při δ 7,73 (d, J 16.0 Hz) indikoval distribuci Castano-

strana B/D nebo jiné PhG substituované feruloylem (tabulka S2 a obr. 1)22. Kromě toho byly v extraktu také pozorovány PhG cis typu (kumaroyl nebo kafeoyl substituované PhGs typu cis) na základě přítomnosti δ 6,95 (d, J 12.0 Hz) ve spektru (tabulka S2 a obr. 1).

V oblasti δ 8 bylo detekováno několik zjevných signálů.0–9,5. Signály při 5 9,15, 8,88 a 8,09 byly předběžně přiřazeny nikotinamidu (tabulka S2 a obr. 1) a 13C NMR stejně jako 2D

NMR spektra (obr. S4–S6) také podporovala toto zadání. Signál při 5 8,48 byl věrohodně přiřazen kyselině mravenčí, zatímco signály při 5 8,13 a 8,11 byly generovány z adenosinu a adeninu, v daném pořadí (tabulka S2 a obr. 1). Sacharidové signály se obvykle nacházejí v oblasti mezi δ 3.00 a 5,50. Sacharóza byla zjevně nejhojnějším disacharidem v CD a vykazovala významné rezonance při 5 4.{48}}4, 4,18 a 5,41 (tabulka S2 a obr. 1 a S7). Zjevné signály patřící k anomerním protonům -galaktózy, -glukózy a -glukózy rezonovaly při 5 5,24, 5,20, respektive 4,60 (tabulka S2, obr. 1 a S8, S9). Výskyt mannitolu byl odhalen pozorováním signálu při 5 4.00 a také porovnáním s referenční sloučeninou (tabulka S2, obr. 1 a S10). Diagnostický signál 1-O-ethyl-glukosidu byl pozorován při 1,16 ppm s odkazem na HMDB. Aminokyseliny, včetně leucinu (0,93 ppm), isoleucinu/valinu (0,98 ppm), threoninu (1,27 ppm), alaninu (1,49 ppm), lysinu (1,71 ppm), glutaminu (2,30 ppm), kyseliny asparaginové (2,96 ppm), prolinu (4,09 ppm), tyrosin (7,12 ppm) a fenylalanin (7,33 ppm) byly předběžně přiřazeny porovnáním jejich příslušných diagnostických spektroskopických chování s chováním archivovaným v HMDB (tabulka S2 a obr. 1). Iridoidy a lignany byly zmíněny jako důležité chemické homology v CD. V reprezentativním 'H NMR spektru (obr. 1) byly pozorovány signály syringaresinolu (derivát lignanu) a kyseliny 8-epiloganové (derivát iridoidu) při 5 7,02 a 0,98, v daném pořadí. Navíc multipletové signály v rozmezí 5 6,56–6,64 mohly být předběžně přiřazeny citrusům A, alaschaniosidu A nebo dehydeodikoniferylalkohol glukosidu (všechny deriváty lignanu), zatímco signály mezi δ 6,18–6,33 mohou být také generovány iridoidy (tabulka S2 a Obr. 1). Kromě toho byly výskyty některých alifatických karboxylových kyselin v CD, včetně kyseliny fumarové, kyseliny maleinové, kyseliny jablečné, kyseliny isocitrónové, kyseliny citrónové, kyseliny ketoglutarové, kyseliny pyrohroznové, kyseliny jantarové, kyseliny octové a další mastné kyseliny, předběžně charakterizovány pozorování diagnostických signálů při 5 6,54, 6,02, 4,27, 3,04, 2,73, 2,52, 2,49, 2,42, 1,97 a 1,33, postupně (tabulka S2 a obr. 1). Navíc některé signály, jako je multipletový signál kolem 3,80 ppm a singlet při 1,97 ppm22, byly považovány za charakteristiky pro methoxy a acetylové skupiny (tabulka S2 a obr. 1), které jsou běžnými substituty fenylových derivátů. , zejména PhGs v tomto případě. Mezitím signál při 1,06 ppm mohl být předběžně přiřazen ke zbytku rhamnózy. Je dobře známo, že1H NMR spektroskopie může poskytnout přímou kvantitativní informaci, protože intenzita protonového signálu je úměrná molární koncentraci analytu19. Předběžné kvantitativní srovnání tedy mohlo být provedeno pro složky v CD. Je zřejmé, že sacharidy, zejména sacharóza, poskytly nejvyšší odezvy v reprezentativním spektru (obr. 1). Jako holoparazitická rostlina, která roste v podzemí téměř celý životní cyklus, není fotosyntéza nezbytná a pro CD není dostupná; proto není překvapivé, že ve spektru nebyl nalezen žádný primární metabolit zapojený do fotosyntézy, jako je účastník Kelvinova cyklu (také známý jako C3 cyklus)23. Naopak bylo detekováno velké množství molekul účastnících se cyklu trikarboxylových kyselin (cyklus TCA, také známý jako cyklus kyseliny citrónové a Krebsův cyklus), jako je kyselina citrónová, kyselina ketoglutarová, kyselina pyrohroznová a kyselina jantarová, což naznačuje, že uhlíkový metabolismus (CCM) probíhá v původní rostlině. Na druhé straně byly PhGs pozorovány jako dominantní chemická rodina mezi různými sekundárními metabolity, zatímco lignany a iridoidy poskytovaly pouze menší příspěvky pro celý spektrální profil.

3.3. Přesný test 1H NMR spektroskopie

Spektroskopická přesnost hraje klíčovou roli ve spolehlivosti metabolomické charakterizace. V současné studii byla přesnost celé metodiky testována tak, že se připravil reprezentativní vzorek (CD1-GUI) v pěti opakováních a následně se analyzoval ve dvou po sobě jdoucích dnech. Získaná spektra vykazovala velkou celkovou podobnost překrytím všech spekter, což naznačuje, že protokol přípravy vzorku a měření 1H NMR byly reprodukovatelné a vzorek mohl zůstat stabilní alespoň dva dny.

3.4. Diskriminace horní a spodní části rostliny

Doposud žádný důkaz neprokázal, že horní části CD jsou ekvivalentní s dolními částmi, pokud jde o chemický profil a farmakologické vlastnosti. S cílem objasnit, zda v určitých částech CD došlo k akumulaci primárních nebo sekundárních metabolitů, byly celé sukulentní stonky rozřezány na horní a spodní části, které byly následně zpracovány, extrahovány a měřeny pomocí 1H NMR spektroskopie. Obr. 2 ukazuje reprezentativní spektra obou částí. Celkově byla většina signálů ve spodních částech vyšší než v horních částech. V rozsahu δ 6.0–9,5 nebyl v žádné části nalezen žádný jedinečný signál; celková intenzita těchto signálů v dolních částech však byla mírně vyšší než v horních částech, což naznačuje, že aromatické deriváty by mohly být obohaceny v doméně blízko parazitního bodu23. Spodní části byly také bohaté na mastné kyseliny, určité aminokyseliny a některé další látky uchovávající energii, protože celková signální odezva alifatické oblasti (δ 0,5–3.{{10}) }) ve spodních částech byla vyšší než u horních částí. Kromě toho bylo možné pozorovat určité zjevné rozdíly v oblasti cukru (δ 3.0–5.0) a většina signálů se nacházela v rozsahu δ 3.0– 5.0 v horních částech byly vyšší než v dolních, což naznačuje, že sacharidy, významné oligosacharidy, se mohly akumulovat v horních částech. Za účelem zvýraznění rozdílů mezi horními částmi a spodními částmi a také k identifikaci primárních přispěvatelů odpovědných za jejich diskriminaci byla ke zpracování spektroskopického souboru různých částí použita vícerozměrná analýza dat. Ke klasifikaci všech vzorků podle charakteristických 'H NMR spekter byl původně použit nekontrolovaný přístup nazvaný PCA, který využívá pouze informace z jedné matrice. U těchto dvou různých částí však došlo k rozsáhlému překrývání (data nejsou uvedena). Poté byl spuštěn OPLS-DA, přístup pod dohledem, aby se vyostřila separace mezi různými skupinami a také aby se porozumělo proměnným nesoucím informaci o separaci tříd. OPLS-DA dosáhl dobrého oddělení pro různé části CD. Obr. 3A a B ukazují graf skóre a S-graf OPLS-DA, v daném pořadí. Jak celková dobrá shoda (R2Y¼{{30}},910), tak celkový koeficient křížové validace (Q2Y¼0,981) se blížily 1,0. Proto byl původní separační model statisticky správný s vysokou předvídatelností. Je zřejmé, že horní části mohly být odlišeny od spodních částí, když byly vzorky označeny dvěma skupinami, a S-graf poskytl signály, které potenciálně přispěly k diferenciaci. Celkově bylo více bodů rozmístěno v oblasti odpovídající nižším částem na S-grafu, kde byly distribuovány vyšší obsahy mastných kyselin (δ 1,32–1,35) a faktorů cyklu TCA (jako je kyselina jantarová na δ 2,42); avšak horní část (pravý shluk na obr. 3A) byla bohatá na některé sacharidy (hlavně δ 3,70–4,10, obr. 3B). Potenciální biomarkery poskytnuté S-grafem byly silně konzistentní s porovnáním spekter dvou částí přímým pozorováním a překrýváním. Je dobře definováno, že metabolity jsou syntetizovány tkáňově, orgánově a vývojově specifickými způsoby pomocí specifických enzymů biosyntézy a poté ukládány, někdy ve vysokém obsahu, v produkčních doménách, což odpovídá jejich různým funkcím pro celou rostlinu. Například oba typy a obsah ginsenosidů vykazují významné rozdíly mezi oddenky, kořeny, listy a následovníky Panax notoginseng24. Pokud jde o CD, z kvalitativního hlediska profily sekundárních metabolitů vykazovaly vysokou podobnost mezi horními částmi a spodními částmi. Vzhledem k tomu, že spodní části celých rostlin hrají roli pro přenos živin, z nichž většinu tvoří primární metabolity, např. sacharidy, z hostitele, Haloxylon ammodendron do bodů intenzivního metabolismu, což naznačuje, že by se v hostiteli mělo vyskytovat hojnější primární metabolity. spodní části. V horních partiích by navíc měla ve velké míře probíhat rozsáhlá hydrolýza polysacharidů na oligosacharidy a následně na monosacharidy, které by mohly být nakonec biotransferovány na některé alifatické karboxylové kyseliny. Protože v této studii byl pro extrakci použit 50% vodný methanol a byl schopen extrahovat hydrofilní nízké molekuly místo makromolekul (např. polysacharidy), není překvapivé poznamenat, že akumulace faktorů cyklu TCA a mastných kyselin byla prokázána v nižších koncentracích. díly. Bylo však zjištěno, že některé oligosacharidy, hydrolytické produkty polysacharidů, jsou v horních částech obohaceny. Na druhou stranu byly u PhG pozorovány menší rozdíly mezi různými částmi z kvantitativního hlediska a celkově byla pozorována mírná akumulace PhG v nižších částech23,25. Bylo hlášeno, že floém haustoria je pravděpodobně sekundárním syntetickým orgánem pro PhGs v CD23; proto by spodní části, které jsou blízko parazitního bodu, měly být bohaté na PhGs.

3.5. Návrh nového způsobu zpracování CD

Je zřejmé, že lékařské plátky patřící ke vzorkům typu c byly lepší, pokud jde o dobrý vzhled, špinavě bílou barvu, světlo a ostrou texturu. Obr. 4 ukazuje reprezentativní1H NMR spektra pro tyto tři typy vzorků. Po paralelních měřeních však byly získány různé spektrální profily pro tyto zpracované lékařské plátky. Prostřednictvím přímého pozorování a překrývání bylo možné pozorovat zjevné rozdíly. Za prvé, v oblasti δ 6.00–8.00, kde byly zahrnuty hlavně signály patřící PhG a některým dalším fenolickým derivátům, byly odezvy vzorků typu c (obr. 4C) poměrně vyšší než u ostatních dvou typů. Za druhé, odpovědi většiny sacharidů a účastníků TCA ve vzorcích typu b (obr. 4B) byly téměř ekvivalentní odezvám ve vzorcích typu c (obr. 4C), ale mnohem vyšší než ve vzorcích typu a (obr. 4A). . Za třetí, obsah glukózy (5 5,20 pro -glukózu a 5 4,60 pro -glukózu) ve vzorcích typu b (obr. 4B) byl mírně vyšší než ve vzorcích typu c (obr. 4C). Nakonec bylo detekováno více mastných kyselin ve vzorcích typu a a c než ve vzorcích typu b (obr. 4). Především nejhojnější fenolové deriváty, jako je tento, které byly široce považovány za účinné složky CD, byly nalezeny ve vzorcích zpracovaných novou metodou (vzorky typu c) ve srovnání s a-a b- typy vzorků. Kromě toho byly ve vzorcích typu c nalezeny také hojné primární metabolity, jako jsou sacharidy, účastníci TCA a mastné kyseliny. Následně byla provedena srovnání všech vzorků prostřednictvím vícerozměrné analýzy dat s cílem zdůraznit podobnosti a také rozdíly mezi těmito třemi typy léčivých plátků. PCA s Par škálováním a OPLS-DA s UV škálováním byla provedena pro zpracování NMR spektroskopické datové sady postupně (data nejsou ukázána). Při použití PCA nebylo dosaženo významné separace; avšak grafy skóre OPLS-DA pro tyto tři skupiny (zelené, modré a červené tečky na obr. 5A) ukázaly jasnou klasifikaci, což ukazuje, že tyto tři skupiny vzorků byly významně odlišné, pokud jde o jejich metabolické profily. The

degradace PhGs iniciovaná buď enzymy v původní rostlině nebo skladováním při vysoké teplotě. V důsledku toho byly zpracované plátky (vzorky typu c) pomocí nové metody výhodné jak pro příjemný vzhled, tak pro vyšší účinné obsahy sloučenin. Ke křížové validaci výše uvedených výsledků pro tři techniky zpracování byla použita metoda HPLC-UV, která byla dobře vyvinuta a ověřena v čínském lékopisu (vydání 2015)3 k současnému stanovení obsahu echinakosidu a akteosidu, které hrály důležitou roli při rozlišit výše uvedené tři druhy zpracovaných produktů. Průměrné obsahy echinakosidu ve vzorcích typu a-, b- a c byly 8,33, 4,10 a 16,19 mg/g, zatímco obsahy akteosidů byly 1,57, 1,14 a 3,66 mg/g. Je zřejmé, že obsahy PhGs v materiálech typu c byly 2–4krát vyšší než ve vzorcích typu a a b, což dobře souhlasí s výsledky metabolomiky založenými na1H NMR. Mezi dostupnými analytickými technikami obecně používanými v metabolomických studiích jsou NMR a metody založené na MS obvykle považovány za výhodné alternativy. NMR spektroskopie, zejména1H NMR, má nepřekonatelné přednosti nad jinými technikami, jako je neselektivita, pohodlná příprava vzorků a snadnost současné detekce různých skupin metabolitů v relativně krátké době měření. Dosud byla metabolomika založená na 1H NMR využívána k autentizaci rostlin17 k porovnání analogových bylin18, k rozlišení stanovišť26 a k charakterizaci degradace bylin26. Zde byla 1H NMR použita k rozlišení různých částí CD a také k navržení nového pracovního postupu, což naznačuje, že 1H NMR spektroskopie je flexibilní a robustní analytický nástroj, který nabízí smysluplné pokyny pro využití CD, stejně jako některé další rostlinné léky poskytováním komplexních kvalitativních a kvantitativních informací o komplikovaných matricích extraktů.