Část 1: Akteosidy potlačená mikroglie M1 Polarizace prostřednictvím inhibované signální dráhy NF-KB a obnovení funkce mitochondrií zprostředkované AMPK

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Pls klikněte sem pro část 2

Abstraktní:

Pozadí:Alzheimerova choroba (AD)je nejčastějším typem demence. Zatímcoakteosid z byliny cistanche(ACT), sloučenina izolovaná z Cistanchetubulosamá neuroprotektivní vlastnosti. Základní mechanismus regulace polarizace mikroglií však zůstává špatně definován.Metody:Zde byl použit AlCl3-indukovaný model AD u larev zebry, aby se odhalila terapeutická účinnost ACT. BV-2 buňky byly použity k demonstraci role ACT na polarizaci mikroglií. RNA-sekvence, HPLC-Q-TOF-MS, western blot a molekulární dokování byly zkombinovány, aby se potvrdil její mechanismus.Výsledek:ACT významně zlepšila experimentální dyskinezi a poruchy nervového systému u zebry. Následně potlačila polarizaci M1 a povýšila na fenotyp M2 v LPS-indukovaných BV-2 buňkách. Nejprve jsme prokázali, že ACT má hluboký transkriptomický dopad, který zahrnuje regulaci klíčových signálních drah při zánětu, biosyntéze argininu, jakož i biosyntéze pantotenátu a CoA, korelující s funkcí mitochondrií. AKT(akteosid z byliny cistanche) léčba snížila polarizaci mikroglie M1 inhibicí signální dráhy NF-KB. A metabolické dráhy byly dále potvrzeny pomocí HPLC-Q-TOF-MS. Kromě toho ACT napravil nadměrné ROS, aby obnovil funkci mitochondrií prostřednictvím AMPK zprostředkované PGC-1 a UCP-2 upregulace, v souladu s metabolickými změnami. Je zajímavé, že ACT se může přímo vázat jak na NF-KB, tak na AMPK, jak dokazuje molekulární dokování.Závěry:Výzkum poskytl infuzní mechanismus ACT a ilustroval nový pohled na mitochondriální dysfunkci k odhalení spojení mezi metabolismem a polarizací mikroglií.

Pozadí:

Alzheimernemoc(AD) je běžné neurodegenerativní onemocnění doprovázené kognitivní poruchou a dyskinezí[1]. Je charakterizována závažnou neuronální ztrátou, senilními plaky a neurobrilárními klubky[2]. Patogeneze AD je multidimenzionální a je spojena s neuroinflamací. Neuroin§aminace je řízena aktivací gliových buněk, která úzce souvisí s rozvojem AD[3, 4]. Během progrese a exacerbace neuroin§ammace je mikroglie považována za klíčový faktor. Mikroglie jsou primární imunitní buňky v centrálním nervovém systému. Je úzce spojena s kaskádou procesů, které zahrnují vývoj mozku, udržování neutrálního prostředí, stejně jako reakce na zranění a opravy[1]. Kromě toho mohou být mikroglie stimulovány k fenotypu M1 a exprese prozánětlivých cytokinů je zvýšena, když se vyskytnou nemoci související s neurozánětmi, jako je AD[5]. Studie také ukazují, že polarizace na fenotyp M1 je často doprovázena metabolickými poruchami[6], které způsobují nerovnováhu energetického metabolismu a mitochondriální dysfunkci[7]. Tyto nepříznivé změny jsou odvozeny od neurodegenerace, dokonce i AD.

akteosid z byliny cistanche(ACT), fenylethanoidový glykosid, je primárně odvozen z Cistanchetubulosa. Stále více důkazů naznačuje, že ACT má četné farmakologické účinky, včetně neuroprotektivních[8], protizánětlivých[9] a antioxidačních[10] účinků. Zejména bylo hlášeno, že ACT zlepšuje poruchu učení a paměti a také zvyšuje energetický metabolismus u potkanů ​​indukovaných streptozotocinem [11]. Bylo také navrženo, že inhibuje apoptotickou buněčnou smrt neuronů a poškození mitochondrií u experimentálních myší s autoimunitní encefalomyelitidou[12]. Méně studií však bylo zaměřeno na vliv ACT na polarizaci mikroglií M1/M2. Zejména nebyly provedeny různé mechanismy, jako je oprava funkce mitochondrií a regulace buněčného metabolismu. Mechanismus ACT přispívající k polarizaci mikroglií M1/M2 navíc zůstal neprozkoumaný.

Cílem této zprávy bylo prozkoumat terapeutickou účinnost ACT a také základní molekulární mechanismus ACT u AD. Zde ACT prokázal významný neuroprotektivní účinek u larev AD zebřiček indukovaných AlCl3-. Kromě toho ACT účinně inhiboval polarizaci M1 a podporoval fenotyp M2 v buňkách BV-2 indukovaných LPS. RNA-sekvenování (RNA-Seq) integrované s metabolomickou metodou pro lepší pochopení základního mechanismu ACT při regulaci polarizace mikroglií. Byl zkoumán přeslech mezi metabolismem a polarizací mikroglií z hlediska mitochondriální funkce. Tato studie poskytne nový respekt pro další zkoumání ACT jako potenciálního terapeutického činidla pro léčbu AD.

Metody:

Seskupení zvířat a modelů:

V této studii byly vybrány divoké zebry (kmen AB, 4 měsíce starý) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Byly udržovány v cyklu světlo/tma 14/10 h při 28 stupních podle předchozí metody[13]. Přírodní hnojivo a normálně vyvinutá embrya byla vytvořena a kultivována do 3 dnů po oplodnění (dpf) v osvětlovacím inkubátoru. Všechny experimenty se zebrou se prováděly pod dohledem Výboru pro etiku zvířat Čínské farmaceutické univerzity.

Larvy zebry byly rozděleny do šesti skupin a ošetřeny od 3 dpf do 7 dpf: kontrolní skupina, modelová skupina, modelová skupina plus donepezil hydrochloridová (DPZ) skupina, modelová plus ACT skupiny. Kontrolní skupina byla udržována v médiu s 0,2 procenta DMSO a modelová skupina byla ošetřena 150 uM AlCl3 (pH 5,8). Model plus skupina DPZ byla společně ošetřena AlCl3 a 8 uM DPZ. Model plus skupiny ACT byly společně ošetřeny AlCl3 a různými koncentracemi ACT (200, 100, 50 uM). AKT(akteosid z byliny cistanche)(HPLC čistota větší nebo rovna 98 procentům) byl získán od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Čína). AlCl3.6H20 a DPZ byly zakoupeny od Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Šanghaj, Čína).

Behaviorální analýza

Pohyby larev zebry byly zaznamenány pomocí analyzátoru chování ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) při 28 stupních. Stručně řečeno, parametry chování a zpracování výsledků byly v souladu s metodou, kterou jsme zavedli dříve[13]. Zde byly vybrány průměrná rychlost (AS), změna rychlosti (AS), míra zotavení dyskineze (DRR) a účinnost odezvy (RE, procenta) pro hodnocení zotavení dyskineze u zebry.

Po ošetření od 3 dpf do 7 dpf byly shromážděny larvy zebry pro měření aktivity AChE a ChAT. Na základě protokolu výrobce byla aktivita detekována soupravami ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). A koncentrace proteinů v různých vzorcích byly stanoveny metodou BCA.

BV-2 buňky byly nasazeny do 6-jamkové misky samostatně (n=6/skupina). Po ošetření bylo médium odstraněno a buňky byly třikrát promyty studeným PBS. Poté okamžitě vystaven kapalnému dusíku k potlačení metabolismu buněk. Buňky byly sklizeny studeným 80% methanolem (1 ml/jamka) a suspenze byla přenesena do 2ml Eppendorfovy zkumavky. Pro usnadnění precipitace proteinu energicky vortexujte po dobu 1 minuty a centrifugujte při 13,000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 stupních. Buněčná suspenze byla přenesena do nové 2ml Eppendorfovy zkumavky a vysušena pod proudem dusíku a skladována při -80 stupni až do analýzy. Vysušený zbytek byl rekonstituován ve 150 ul předem vychlazeného 25% acetonitrilu. Aby byla zajištěna stabilita a přesnost sekvenční analýzy, byly stejné objemy (10 μl) každého vzorku buněk kombinovány jako vzorky pro kontrolu kvality (QC). Během detekce metabolitů byly tyto vzorky injikovány po každých šesti vzorcích buněk, aby se potvrdila jejich stabilita. Pro HPLC-Q-TOF-MS byl nastříknut alikvot o objemu 1 ul.

Analýza HPLC-Q-TOF-MS byla provedena na systému Agilent 1290 HPLC spojeném s hmotnostním spektrometrem Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separace byla provedena na koloně ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 um). Mobilní fáze byla složena z 0,1 procenta kyselina mravenčí-voda (obj./obj.; A) a acetonitril (B).

Rychlost průtoku byla nastavena na {{0}},4 ml/min s následujícími optimálními podmínkami gradientové eluce: 0 až 2 min, 5 procent B; 2 až 20 min, 5 procent až 95 procent B (pozitivní iontový mód); 0 až 2 min, 5 procent B; 2 až 20 minut, 5 procent až 95 procent B (negativní iontový režim). Provozní parametry hmotnostního spektrometru byly nastaveny následovně: teplota plynu, 320 stupňů; sušící plyn, 10 l/min; nebulizér, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

Nezpracovaná data byla provozována pod MassHunter Workstation Software verze B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Nezpracovaná data byla předzpracována platformou XCMS. Analýza hlavních složek (PCA) a částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců (PLS-DA) normalizovaných dat byla provedena pomocí MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). V kombinaci s literaturou byly zjištěny rozdílné metabolity (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">