Optogenetické frekvenční zamíchání hipokampálních théta oscilací disociuje načítání pracovní paměti z hipokampálních časoprostorových kódů, část 2

Kombinace RS optogenetické stimulace a zobrazování vápníku v hipokampu

Pro studium účinků theta manipulací na hipokampální prostorové a časové kódy jsme kombinovali MS optogenetickou stimulaci s kalciovým zobrazením v CA1. Toto experimentální paradigma vyvolává dva potenciálně důležité problémy: Implantáty čoček GRIN zahrnují poškození tkáně, které by mohlo změnit fyziologický stav oscilací theta, a spektrum vlnových délek excitační LED použité k excitaci GCaMP6f by se mohlo potenciálně překrývat se spektrem opsinu umístěného na koncových vláknech GABAergních MS vláken v hippocampus.

Hipocampus je velmi důležitá struktura v mozku. Zodpovídá především za ukládání a zpracování paměťových informací. Jak všichni víme, paměť je důležitou součástí lidských intelektuálních aktivit a důležitým způsobem komunikace a interakce s okolním prostředím. Proto je funkce hipokampu pro náš život klíčová.

Hippokampální prostor je způsob, jak popsat, jak jsou prostorové informace zpracovávány v našem mozku. Označuje aktivní oblast skupiny neuronů v našem mozku, která zpracovává prostorové informace. Tato oblast se nazývá parahippokampální oblast a úzce souvisí s mořským koníkem. Výzkum ukazuje, že oblast poblíž hipokampu zpracovává informace související s prostorem a pamětí a je klíčovou součástí našeho paměťového procesu.

Konkrétně zpracování prostorových informací hipokampem zahrnuje především dva aspekty. Prvním aspektem je náš smysl pro směr a schopnost navigace. Když chodíme, hipokampus zaznamenává naše kroky a polohu a udržuje naši orientaci v prostoru. Pokud je náš hipokampus poškozen, může to způsobit problémy, jako je dezorientace nebo neschopnost najít cestu domů.

Dalším aspektem je paměťová schopnost. Lidé využívají prostorové informace poskytované hipokampem, aby si lidé zapamatovali. Pokud na určitém místě něco zažijeme, hipokampus si tyto informace uloží a my se o těchto zážitcích nebo lidech můžeme dozvědět prostřednictvím vzpomínání.

Učením neustále posilujeme své paměťové schopnosti a hipokampus hraje v tomto procesu zásadní roli. Vzhledem k důležitosti hipokampu musíme věnovat pozornost jeho zdraví a chránit ho některými metodami. Sudoku, běh, učení se novým dovednostem atd. mohou zlepšit naši paměť a chránit zdraví našeho hipokampu.

Dieta, cvičení a udržování dobrého spánku nám proto mohou pomoci chránit náš hipokampus a zlepšit naši schopnost paměti. Když máme jasnou mysl a silnou paměť, můžeme lépe porozumět světu a vytvořit si lepší život. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola může také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může maso také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostane dostatek živin a energie, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na vědět doplňky pro posílení paměti

Abychom ověřili, zda implantáty čočky GRIN změnily fyziologii theta, nejprve jsme myším implantovali čočku GRIN do pravého hipokampu a dvě elektrody do levého i pravého hipokampu a našli jsme srovnatelné signály theta v obou hemisférách (obr. 3a). Porovnali jsme oscilace theta během průzkumu v otevřeném poli u myší s GRINlens a připojenou elektrodou LFP s myší pouze s elektrodami a nenašli jsme žádné významné rozdíly mezi oběma skupinami (obr. 3b). Nenašli jsme žádný významný rozdíl mezi relativní silou theta u myší s implantovanou čočkou GRIN a LFP elektrodou (0.14 ± 0.007) oproti pouze aneelektrodě ( 0,154 ± 0,008; t-test, t54=1,060, p=0,29).

Ačkoli předchozí zprávy popisovaly, že kombinace optogenetické stimulace ChrimsonR v buněčných tělech se zobrazením GCaMP inneuronů v blízkosti terminálů je možná s minimálním přeslechem53, následně byla monitorována jakákoli potenciální opsinová aktivace MS terminálů v hippocampu záznamem CA1- LFP při vyzařování excitačního světla naším miniskopem přes čočku GRIN. Po kalibraci světelného výkonu miniskopu (obr. 3c) jsme nezjistili žádný vliv modrého excitačního světla miniskopu na endogenní theta výkon (1ANOVA, F(4,295)= 0.7729, p=0.5435 ; obr. 3d). Protože bylo hlášeno, že excitační světlo miniscope může vyvolat depolarizaci terminálů transfekovaných ChrimsonR53, což může potenciálně bránit další optogeneticky indukované depolarizaci, použili jsme dále MSoptogenetické stimulace při zobrazování s ~0,3mW /mm2 výkon LED miniscope a byly schopny významně narušit nebo stimulovat theta pomocí zakódované nebo 8Hz stimulace (Friedmanův test χ2=6.000,p=0.0278; obr. 3e) .

Narušení theta rytmů moduluje malou část buněk CA1

Poté jsme provedli fázovou (5 s ON, 5 s OFF) optogenetickou stimulaci RS při záznamu CA1 pyramidálních buněk, když myši volně prozkoumávaly otevřené pole (obr. 4a). Zjistili jsme, že část zaznamenaných buněk byla za těchto podmínek konzistentně excitována, zatímco jiné byly inhibovány (obr. 4b; viz Metody). Aktivita pyramidálních buněk během stimulace byla celkově nižší ve srovnání s výchozí hodnotou, a to jak u míchané stimulace během běhu (Pearsonova korelace, R2=0.567, p menší nebo rovno 0.0 0{{20}}1) a klid (R2=0.521, p Menší nebo rovno 0,0001) periody, stejně jako pro 8 Hz stimulaci (R{{ 14}}.6, p Menší nebo rovno 0,0001 pro doby odpočinku; R2=0.632, p Menší nebo rovno 0,0001 pro běžící období; n=1849 buněk, N=5 myši, obr. 4c). Celkově bylo ~6,42 ± 0,52 % z celkových buněk významně modulováno míchanými optogenetickými stimulacemi (obr. 4d). Mezi těmito modulovanými buňkami bylo 50,56 ± 6,38 % inhibováno, zatímco 49,43 ± 6,38 % bylo excitováno (n=1849 buněk, N=5 myší; obr. 4e).

Dále jsme analyzovali účinky optogenetické stimulace na prostorové ladění hipokampálních neuronů, když myši volně prozkoumávaly otevřené pole. Za tímto účelem jsme vypočítali mapy míry aktivity pomocí buď epoch v rámci stimulačních období nebo mimo ně (pro základní stav jsme zahrnuli epochy, které následovaly stejný vzor 5 s ON, 5 s OFF použitý pro skutečnou stimulaci; obr. 4f). Stabilita byla poté vypočítána jako korelace mezi rychlostními mapami pro základní a stimulační epochy. Navzdory výše uvedeným změnám v celkové aktivitě nevykázaly frekvenční mapy žádnou změnu prostorové stability ani pro stimulaci scrambledoru 8 Hz (Kruskal–Wallis H3=3.5, p=0.1773; obr. 4g).

RS optogenetická stimulace mění chování, ale ne časoprostorové kódy

Abychom vyhodnotili účinky narušení theta na časové a prostorové kódy, sledovali jsme aktivitu pyramidálních neuronů CA1 na 3-tónové lineární stopě (obr. 5a). Zde využíváme jednu z hlavních výhod kalciového zobrazování, kterou je schopnost registrovat zaznamenané buňky během několika dnů při provádění zakódovaných nebo 8 Hz stimulací ve vybraných dnech (obr. 5b, c, spodní panel). Naši analýzu jsme zaměřili na páry dnů se stejnou dobou (48 h) mezi testováním (obr. 5c, horní panel). Pro každou podmínku jsme hodnotili část celkových buněk významně kódujících jednu nebo několik proměnných a nezjistili jsme žádný účinek 8 Hz nebo kódované stimulace na prostorové a časové kódování (RM-ANOVA; F2=0.807, p {{11 }}.453 pro hlavní účinek stimulací; F6=1.283, p=0.285 pro interakci mezi stimulací a kódovanou proměnnou, n=5 myší; obr. 5d).

Zatímco část buněk se za podmínek stimulace nezměnila, hodnotili jsme účinek stimulace MS na stabilitu křivek ladění buněk modulovaných místem, časem a vzdáleností. Za tímto účelem jsme sledovali neurony ve dnech (obr. 5c; viz Metody) a vypočítali stabilitu polí místa a času jako párovou korelaci mezi poli po dobu 48 hodin. Protože je známo, že CA1 vykazuje výrazné přemapování v průběhu dnů, použili jsme také pár dní bez stimulace k výpočtu základního skóre stability, které se má použít jako reference (obr. 5e–g). Nezjistili jsme žádnou změnu stability během stimulace MS pro buňky modulované místem (1ANOVA, F2=1.907, p=0.1511; n=205 párů buněk shromážděných z N=5 nezávislé myši; obr. 5h), časově modulované buňky (1ANOVA, F2=2.201, p=0.113; n=227 párů buněk sdružených z N=5nezávislých myši; obr. 5i) a na vzdálenost modulované buňky (1ANOVA,F2=0.6962, p=0.5024; n=64 párů buněk sdružených z N=5 nezávislých myši, obr. 5j). Stejnou analýzu jsme také rozšířili na konjunktivní neurony (tj. neurony, které mohou kódovat více než jednu proměnnou; doplňkový obr. 5a–f) a nezjistili jsme žádné účinky optogenetické stimulace na stabilitu konjunktivní prostorové (1ANOVA, F2=3.731, p=0.0661;N=4 nezávislé myši; Doplňkový obr. 5g), dočasný (1ANOVA,F2=1.993, p=0.8228; N {{47 }} nezávislé myši; doplňkový obr. 5h) a distanční buňky (1ANOVA, F2=0.469, p=0.6400; N=4 nezávislých myší; doplňkový obr. 5i).

Dále jsme hodnotili kvalitu časoprostorových kódů pomocí anaivního bayesovského klasifikátoru k dekódování místa (obr. 6a, b), času (obr. 6cd) a ujeté vzdálenosti (obr. 6e, f), pomocí náhodných vzorků bootstrapu (n {{3 }} vzorků bootstrapu, n=160 buněk na vzorek). Dekódované chyby byly systematicky nižší než u náhodně zamíchaných náhrad, včetně 8Hz nebo kódované stimulace pro umístění (2ANOVA,F5=2172, p menší nebo rovno 0.0001; n=50 vzorků bootstrapu z jedné reprezentativní myši, obr. 6a), čas (2ANOVA, F5=1292, p menší nebo rovno 0,0001;n=50 vzorků bootstrapu z jedné reprezentativní myši; Obr. 6c) a vzdálenost (2ANOVA, F5=1964, p Menší nebo rovno 0,0001; n=50 bootstrapsvzorků z jedné reprezentativní myši; Obr. 6e), což ukazuje, že časoprostorové kódy byly během stimulace zachovány. K odhadu interindividuální významnosti časoprostorových kódů byla chyba dekódování vyhodnocena wez použitím skutečných i zamíchaných výsledků (viz Metody) pro daný den pro každou myš (obr. 6b, d, f). významně změnit kódování umístění (1ANOVA, F2,11=2.2332, p=0.1432; N=5 myší; velikost efektuη2=0.29; obr. 6b), čas (1ANOVA, F2,11=0.4561, p=0.6452; N=5myší; velikost efektu η2=0.07; obr. 6d), nebo vzdálenost ( 1ANOVA,F2,11=0.6102, p=0.5606; N=5 myší; velikost efektu η2=0.09; obr. 6f).

V behaviorálním paradigmatu používaném k analýze časové modulace neuronální aktivity jsou myši plánovány ve vodě a trénovány tak, aby sbíraly odměny. Na základě tohoto předpokladu jsme kvantifikovali počet návratů na prázdné místo odměny jako chyby a vypočítali procento správných pokusů k celkovému počtu pokusů jako proxy pro výkon (obr. 6g). Za těchto podmínek jsme zjistili významný vliv optogenetické stimulace na výkon v průběhu dnů (Friedmanův testχ2=6.000, p=0.0278) a zejména významný rozdíl ve výkonu mezi během výchozího stavu (78,70 ± 2,45 %) a míchaná stimulace (44,44 ± 5,56 %; vícenásobná srovnání, p=0,0429;N=3 myší; obr. 6h). Do této analýzy byly zahrnuty pouze myši s minimálně 12 běhy. Vzhledem k omezením tohoto úkolu (nízká kognitivní zátěž a nízký počet testovaných myší) jsme se dále pustili do posouzení účinku optogenetické stimulace RS ve standardizovaných úlohách s pamětí.

Narušení signálů theta zhoršuje prostorové rozpoznávání a získávání pracovní paměti

Abychom otestovali roli theta signálů v prostorové paměti, použili jsme vyhrazenou skupinu myší, kterým byl injikován ChrimsonR a kterým bylo implantováno vláknové vlákno v MS (obr. 7a, levý panel). Myši byly podrobeny úkolu rozpoznávání objektů podle nového místa (NPOR) (obr. 7a, pravý panel). Abychom vyhodnotili roli oscilací theta při kódování a vyhledávání paměti, obr. 7|Optogenetické stimulace RS narušují udržování a vyhledávání, ale nekódování epizodické a pracovní paměti. a Myším byla implantována vláknitá optika v MS po transfekci ChrimsonR (nahoře). Poté byli podrobeni nové úloze rozpoznávání místa objektu (dole, viz Metody). b V této úloze narušily výkon paměti jak zakódovaná (červená) a 8 Hz (modrá) stimulace během načítání, tak i 8 Hz (zelená), ale nezakódovaná (žlutá) stimulace během kódování (2ANOVA, F4, 31=3). 283 pro hlavní účinek léčby, p=0.0097; velikost účinku pro hlavní účinek skupiny, η2p=0.306; N=12 myší). C

K dalšímu zkoumání vlivu stimulace MS na kódování paměti, udržování a vyhledávání byly myši trénovány v úloze zpožděné neshody se vzorkem (DNMTS) v automatizovaném T-bludišti. d Myši s transfekcí ChrimsonR (červená) nebo YFP (černá) byly trénovány (bez stimulace), aby si vybraly správné, neodpovídající podpaží, dokud výkon nepřekročil kritérium 0.8 porcí správné volby za den, např. alespoň dva po sobě jdoucí dny (zelený pruh; RM-ANOVA, F8=8.738,p Menší nebo rovno 0.0001 pro hlavní účinek tréninkových dnů; párové Tukeyho vícenásobné srovnávací testy mezi skupinami, p=0.420; N=17 myší). e–g Výkon během stimulace v různých fázích úkolu u myší, kterým byly injikovány kontroly ChrimonR (nahoře) nebo YFP (dole). Červené stínování označuje stimulované oblasti bludiště. e Průměrný denní výkon při provádění stimulace MS pouze během kódování (RMANOVA, F11=2.197, p=0.547; N=17 myší). f Průměrný denní výkon při provádění RS stimulace pouze během doby zpoždění 10 s (RM-ANOVA, F11=3.483,p=0.0495; velikost účinku pro hlavní účinek léčby, η2p {{ 25}}.109; N=17 myší).g Průměrný denní výkon při provádění stimulace RS pouze během vyhledávání (RM-ANOVA, F11=3.265, p=0,050; N { {33}} myší).

Všechny sloupcové a spojnicové grafy představují průměr ± SEM alespoň tří nezávislých experimentů.Článek https://doi.org/10.1038/s41467-023-35825-5Nature Communications|(2023) 14:410 10prováděl optogenetické stimulace konkrétně během fáze vzorku a testu a vypočítal index rozpoznávání (RI; viz Metody). Při stimulaci během načítání byl výkon paměti významně snížen jak u kódovaných myší (0,472 ± 0.048 RI, n {{10}} myší), tak u 8 Hz stimulace (0,435 ± {{40}},057 RI, n=6 myší) skupiny ve srovnání s kontrolami YFP, které vykazovaly významný nárůst v průzkumu objektů během testování (0,61 ± 0,018 RI; 2ANOVA, F4,31=3,283 pro hlavní účinek léčby, p=0,0097; velikost účinku pro hlavní účinek skupiny, η2p=0,306; N {{30 }} myši, obr. 7b). Na druhou stranu, zakódované stimulace během kódování nezhoršily paměť v době testu (0,60 ± 0,034 RI, p=0,0157, n=6 myší), ale stimulace 8 Hz během kódování snížila výkon paměti na náhodné úrovně (0,39 ± 0,074 RI, p=0,8740, n=6 myší).

Aby se prozkoumal účinek optogenetické kontroly RS na specifické fáze funkce pracovní paměti (kódování, udržování a vyhledávání), byly myši transfekovány ChrimsonR a implantovány vláknovou optikou do RS a trénovány v úloze zpožděné nepřizpůsobení vzorku (DNMTS) . Ve fázi vzorku byly myši nuceny běžet do náhodně určené paže, aby získaly odměnu. Po prodlevě (10 s) mohli buď běžet v opačné paži (správná volba), aby získali další odměnu, nebo běžet ve stejné paži bez odměny (nesprávná paže; obr. 7c). Výhodou tohoto úkolu je umožnit opakované testování, specifickou izolaci fází úkolu (trénink, zpoždění, testování) a kontroly v rámci předmětu. Myši byly trénovány v tomto úkolu bez stimulace, dokud nebylo dosaženo výkonu kritéria 0.8 (část správných pokusů) po dobu alespoň dvou dnů. Kontrolní myši ChrimsonR i YFP vykazovaly v průběhu času výrazné zlepšení (RM-ANOVA, F8=8.738,p Menší nebo rovno 0.{16}}0{{21} }1 pro hlavní efekt tréninkových dnů). Důležité je, že jsme mezi těmito dvěma skupinami nenašli žádné rozdíly v rychlosti učení (párový Tukey;p=0.420; obr. 7d). Jakmile se myši naučily pravidlo související s úlohou DNMTS, hodnotili jsme výkon při dodání buď kódované (0.792 ± 0.045) nebo 8 Hz (0). 850 ± 0.036) optogenetická stimulace pouze ve fázi kódování (nucená volba) a nezaznamenala žádný rozdíl ve výkonu ve srovnání s výchozí hodnotou (0,825 ± 0.030, RMANOVA, F11=2.197, p=0.547, N=17; obr. 7e). Když byly stimulovány pouze během období zpoždění, pouze zakódované stimulace významně snížily výkonnost paměti (0,733 ± 0,057) ve srovnání s výchozí hodnotou (0,825 ± 0,030, RM-ANOVA, F11=3,483, p=0,0495; velikost účinku pro hlavní účinek léčby η2p=0.109; obr. 7f). Naproti tomu, když byly stimulovány během vyhledávání, myši stimulované 8 Hz vykazovaly významně snížený výkon paměti (0,675 ± 0,049) ve srovnání s výchozí hodnotou (0,825 ± 0,030, RM-ANOVA, F11=3,265, p=0). 050, obr. 7g). Naproti tomu kontrolní myši YFP nebyly ovlivněny stimulacemi během kódování (RM-ANOVA, F2=0.1314, p=0.8781), období zpoždění (RMANOVA, F2=0.2020, p=0.8197), nebo vyhledávání (RM-ANOVA, F2=0.0454,p=0.9557; velikost účinku pro hlavní účinek léčby, η2p=0 .196) pracovní paměti.

Optogenetická kontrola RS neuronů nemění lokomoci

Důležité je, že již dříve bylo publikováno, že stimulace theta oscilací může snížit lokomotorickou rychlost a její variabilitu10, což by mohlo alespoň částečně vysvětlit účinky optogenetických stimulací na pracovní a epizodickou paměť. Abychom důkladně vyhodnotili specificitu optogenetické stimulace RS na paměť, provedli jsme další experimenty, abychom vyloučili přímé účinky optogenetických stimulací na lokomotorickou rychlost. Podskupině myší s injekcí ChrimsonRand s implantovanou vláknovou optikou v MS a také LFP elektrodami inCA1 bylo umožněno volně prozkoumat otevřené pole, zatímco byly podrobeny 5 s ON, 5 s OFF optogenetické stimulaci (doplňkový obrázek 6a). 8 Hz stimulace vedlo ke konzistentní stimulaci hipokampálních oscilací na tuto frekvenci (doplňkový obrázek 6b). Tyto stimulace nebyly spojeny s žádnou zjevnou změnou v lokomotorickém chování (doplňkový obr. 6c), včetně střední rychlosti (nepárový, dvoustranný ttest, t116=0.4140, p= 0.6796; doplňkový obr. 6d) a rychlostní koeficient variace (CV; nepárový, dvoustranný t-test, t116=0.8296,p=0.4095, n=59 stimulačních epoch; doplňkový obr. 6e) . Podobně míchaná stimulace konzistentně vedla ke zrušení oscilací theta (doplňkový obrázek 6f), ale žádné zjevné změny v lokomotorickém chování (doplňkový obrázek 6g), včetně střední rychlosti (nepárový, dvoustranný t-test, t118=0.2268 , p=0,8210; n=60 stimulačních epoch; Doplňkový obr. 6h) a rychlostní CV (nepárový, dvoustranný t-test, t118=1,838, p {{36 }}.686; n=60 stimulačních epoch; doplňkový obr. 6i).

Zatímco přirozená theta frekvence a lokomotorická rychlost jsou ve vzájemném vztahu59, přesný směr příčinné souvislosti mezi těmito proměnnými zůstává špatně pochopen. Abychom na tuto otázku odpověděli, provedli jsme optogenetickou stimulaci pomocí paradigmatu 5s ON, 5s OFF a pro každou stimulační epochu byla vybrána náhodná frekvence (doplňkový obrázek 6j). Tyto stimulační frekvence pokrývaly celé spektrum thetaband (doplňkový obr. 6k). Jak se očekávalo, zjistili jsme, že frekvence přirozených oscilací theta přímo korelují s rychlostí běhu pro jeden příklad myši (R2=0.1114, p menší nebo rovno 0.0001; doplňkový obrázek 6l). Důležité je, že když je kmitočet theta výsledkem MSoptogenetické kontroly, korelace klesne pod úroveň pravděpodobnosti (R2=0.0006779, p=0.6244; doplňkový obr. 6m), což naznačuje, že lokomoce určuje frekvenci theta, ale ne naproti. Systematicky jsme replikovali tyto výsledky na myších a pozorovali pokles korelace mezi frekvencí theta a lokomotorickou rychlostí podoptogenetické stimulační kontroly (párový t-test, t3=3.922, p=0.0295;N {{20 }} myši; doplňkový obr. 6n). Celkově tyto výsledky podporují, že naše optogenetická stimulace nemění lokomotorické chování, což je vysoce relevantní pro další behaviorální testy.

For more information:1950477648nn@gmail.com