Optogenetické frekvenční zamíchání hipokampálních théta oscilací disociuje načítání pracovní paměti z hipokampálních časoprostorových kódů, část 3

Optogenetická stimulace RS neuronů vede k nefyziologické theta synchronii

Překvapivě 8 Hz optogenetické stimulace, které jsou spojeny se stimulací theta oscilací, vedly ke snížení výkonu, když byly aplikovány buď během kódování nebo získávání epizodické paměti v úloze NPOR, stejně jako při získávání prostorové pracovní paměti v DNMTStask. Abychom dále porozuměli účinkům stimulace theta na hipokampální fyziologii, analyzovali jsme fázové uzamčení oscilace theta před a během 8 Hz optogenetické stimulace (doplňkový obrázek 7a) a zjistili jsme, že taková stimulace vedla ke zvýšené fázové synchronizaci napříč stimulačními epochami (doplňkový obrázek 7b). Dále jsme analyzovali vzájemnou korelaci theta oscilací napříč dorzálním CA1 (~1 mm vzdálenost mezi elektrodami podél septotemporální osy (doplňkový obrázek 7c) a zjistili jsme, že stimulace theta rytmů při 8 Hz vedla ke zvýšené vzájemné korelaci mezi těmito dvěma elektrodami ( Doplňkový obr. 7d).

Genetika je věda, která studuje genetickou dědičnost a variace, a paměť je aspektem velkého zájmu. Co má tedy genetika společného s pamětí? Tento článek bude zkoumat problémy související s pamětí z genetického hlediska.

Zaprvé víme, že genetické geny jsou základem lidského fyzického a intelektuálního vývoje, a to, zda jsou tyto geny lepší, ovlivní paměť lidí. Nejnovější výzkumy ukazují, že IQ a paměť lidí jsou ovlivněny genetickými faktory. Výzkum ukazuje, že genetické geny hrají zásadní roli v inteligenci a paměti. Proto se někteří lidé rodí se silnějšími vzpomínkami, zatímco jiní potřebují tvrdě pracovat a trénovat, aby si paměť zlepšili.

Za druhé, faktory prostředí jsou také důležitými faktory ve vývoji paměti. Potřebujeme nejen podporu genetických genů, ale také potřebujeme zlepšit naši paměť vědeckým tréninkem a správnými životními návyky. Můžeme například trvat na každodenním cvičení, dostatku spánku, dodržování zásad správného stravování atd., což může pomoci zlepšit naše mozkové funkce a paměť.

A konečně, obyčejní lidé, příliš nezdůrazňujte vliv genetických faktorů na vývoj paměti. Vzhledem k tomu, že genetické faktory nejsou absolutní, mohou se paměť a inteligence lidí stále zlepšovat zlepšením svého úsilí a tréninku. Vždy bychom si měli udržovat pozitivní a nepřetržitý přístup k učení a neustále zkoumat a rozvíjet svůj paměťový potenciál. Věřím, že jedině tak se můžeme stát chytřejšími a mít větší pocit úspěchu. Suma sumárum, vztah mezi genetikou a pamětí je velmi úzký, ale neměli bychom příliš zdůrazňovat genetické faktory, ale měli bychom neustále zlepšovat svou paměť a inteligenci sebezdokonalováním a tréninkem.

Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost mletého masa vychází z různých účinných látek, které obsahuje, včetně kyselin, polysacharidů, flavonoidů atd. Tyto složky mohou různými způsoby podporovat zdraví mozku.

Klikněte na 10 způsobů, jak zlepšit paměť

Diskuse

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neuronů při provádění optogenetické stimulace MS neuronů se subsekundovým rozlišením pro kontrolu theta rytmů a posouzení jejich role ve fyziologii hipokampu a paměti. Důležité je, že pomocí excitatoropsinu a buď míchané nebo 8 Hz stimulace jsme byli schopni konzistentně a robustně zrušit nebo stimulovat hipokampální theta.

Ve srovnání s inhibicí MS buď pomocí inhibičního opsinu nebo farmakologických sloučenin (např. muscimol), náš přístup umožňuje v rámci subjektu srovnání dvou protichůdných stavů (temped vs. abolishedtheta) při zachování úrovní aktivity v MS-PV buňkách. Zkombinovali jsme úkol s odčiněním lineární stopy, který nám spolu s informačně-teoretickými přístupy umožnil rozluštit prostorové a časové hipokampální kódy. Tato metoda zmírňuje potřebu arbitrárních prahových hodnot a umožňuje standardizovaný přístup k kalciové zobrazovací analýze. Zatímco velká část pyramidálních neuronů CA1 vyjadřovala směs časoprostorových kódů, zaměřili jsme naše analýzy na neuronstuning specificky podle místa, času nebo ušlé vzdálenosti.

Zatímco prostorové kódování bylo rozsáhle zkoumáno v CA1, v poslední době získaly větší zájem časové kódy a kódy vzdálenosti. Časové kódy28,35–37 a kódy vzdálenosti37 byly extrahovány upnutím vizuálně prostorových vodítek nebo extrahovány analyticky pomocí zobecněných lineárních modelů v paradigmatech virtuální reality26,27,38. Zde navrhujeme přístup k rozuzlení prostorových, časových a distančních kódů pomocí teoretického přístupu, který spolu s naším úkolem cuedalternation umožňuje analýzu reálných časoprostorových a multiplexovaných kódů u volně se pohybujících zvířat. Velké množství CA1 pyramidálních neuronů kóduje kromě signálů vlastního pohybu, jako je zrychlení, rychlost a orientace60, multiplexované informace o poloze, vzdálenosti a čase, jak bylo dříve uvedeno26,27,38.

Zjistili jsme, že frekvenční skramblování a 8Hz optogenetické stimulace drasticky zrušily nebo stimulovaly theta rytmy a vedly ke snížení celkové aktivity v subpopulaci pyramidálních buněk CA1, přičemž nezpůsobovaly významné změny v buněčné aktivitě místa, podobně jako předchozí zprávy používající buď farmakologickou inhibici36, 46,47 nebo optogenetická9,48 stimulace MS nebo septálních vstupů do hippocampu. Protože je známo, že neurony RS jsou primárním hybatelem hipokampálních oscilací, očekávali jsme, že stimulace RS bude spojena s narušenou časovou nebo vzdálenou buněčnou aktivitou v podmínkách snížených theta rytmů, ale žádné změny nenastaly, když byla theta zrušena nebo stimulována. Stimulování hipokampálních oscilací na 8 Hz navíc nevedlo ke změnám v kvalitě prostorových kódů, jak bylo uvedeno dříve9, a nezměnilo časové kódy, jak je pozorováno v našem behaviorálním paradigmatu.

Ačkoli bylo hlášeno, že čas (ale ne místo) buňky mohou přímo záviset na vstupech z mediálního entorinálního kortexu (MEC)61, nedávné experimentální důkazy naznačují, že léze MEC nevedou k žádným změnám ve fyziologii hipokampálních časových buněk62. Nedávnější výzkum zjistil, že optogenetická stimulace MS nenarušila prostorové kódy mřížkových buněk v entorhinální kůře63, což dále naznačuje, že aktivita MS není přímo zapojena do prostorových kódů v hipokampální formaci. Spolu s našimi výsledky to naznačuje, že časové kódy mohou být buď výsledkem výpočtů závislých na MS v entorhinální kůře63 (1), nebo mohou být generovány skutečně v rámci samotného hipokampu (2).

Zatímco první studie zjistily, že RS hrála zásadní roli při udržování časových buněk a podpoře pracovní paměti36, nedávné experimentální důkazy ukazují, že přesný příspěvek časových buněk k výkonu pracovní paměti by mohl být menší, než se dříve myslelo62. Vzhledem k tomu, že neurony MS-PV si pravděpodobně udržují významné úrovně aktivity během optogenetické stimulace s frekvenčním zakódováním (na rozdíl od inhibičních přístupů), naše výsledky silně podporují úlohu přesně načasované aktivity septa při podpoře pracovní paměti, o níž se dříve spekulovalo. Ačkoli jsme pozorovali snížený výkon paměti při použití optogenetické stimulace během vyhledávání, stimulace během kódovací fáze úloh DNMTS nebyla spojena se sníženou pamětí v úloze DNMTS. Stimulace thetaoscilace při 8 Hz buď během kódovací nebo vyhledávací fáze úlohy NOPR vedla ke zhoršenému získávání paměti. Naše elektrofyziologické analýzy dále odhalují, že taková stimulace způsobila, že vzdálené oblasti dorzálního CA1 byly unášeny ve stejné fázi, s nefyziologickým uzamčením fáze. I když jsme přímo nezkoumali kauzální vztah mezi fázovými změnami a výkonností paměti, bylo zjištěno, že spiketiming a fázová precese jsou také spojeny se změněnou funkcí pracovní paměti, přestože kódování zůstalo nedotčené64. Navíc se již dříve ukázalo, že fázové zamykání pyramidálních neuronů k thetaoscilacím je prediktorem výkonnosti paměti65.

Jedním z omezení našeho přístupu ke stanovení vlastností časového a vzdálenostního ladění je zejména to, že vyžaduje čtyřikrát více vzorkování než běžná lineární stopa, což zvyšuje šance na vyblednutí světlem při přidávání podmínek stimulace do experimentální časové osy. Zatímco jsme zjistili, že prostorové kódy zůstaly neovlivněny optogenetickými stimulacemi v rámci stejné relace, novější zobrazovací hardware, který obsahuje senzory se zvýšenou citlivostí, by mohl pomoci zabránit fotobleachingu a umožnit delší relace záznamu, a tedy vzorkování časových a vzdálených buněk spolu se stimulacemi. Zjistili jsme také, že skupina neuronů, které významně a specificky kódují pouze jednu proměnnou, je malá ve srovnání s počtem konjunktivních neuronů, takže požadavky na odběr vzorků pro tyto vysoce specifické neurony jsou mnohem vyšší.

Poskytujeme experimentální důkaz, že manipulace s RS nemění lokomoční rychlost a že naopak lokomoční rychlost určuje frekvenci theta. I když byly během našich stimulací MS zachovány kódy místa a času, část (~ 6 %) buněk byla přímo modulována a mohla odpovídat za zhoršení paměti pozorované v našich behaviorálních testech. PV interneurony v hipokampu byly dříve hlášeny jako součást mikroobvodu nezbytného pro regulaci konsolidace paměti66,67 a naše optogenetické manipulace by mohly být spojeny s umlčením části těchto buněk. Navíc, i když jsme nepozorovali změny ve frekvenčních pásmech jiných než theta, nemůžeme vyloučit, že načasování špiček CA1 pyramidálních neuronů by mohlo být drasticky změněno při zakódování oscilací theta, zatímco se ukázalo, že stimulace 8 Hz nevede ke zvýšení aktivity hipokampu18, což by mohlo vysvětlit rozdílné účinky ty stimulační vzorce na výkon pracovní paměti. Poruchy paměti, které jsme pozorovali, byly pravděpodobně necholinergní: za prvé, v našich imunohistologických experimentech jsme nezjistili prakticky žádnou expresi ChrimsonR v ChAT neuronech MS. Zadruhé, naše optogenetické stimulace nebyly spojeny se změnami v hippocampu, zatímco předchozí zprávy naznačují, že stimulace Neurony ChAT jsou spojeny se sníženou frekvencí zvlnění45,57. ChrimsonR transfekce MS VGLUT2 neuronů je také nepravděpodobná, protože aktivace těchto neuronů je spojena s přímým zvýšením lokomotorické aktivity 68, což jsme nepozorovali.

Přestože přesné časové uspořádání pyramidálních hrotů CA1 by mohlo alespoň částečně vysvětlit účinky stimulace RS na paměť, je třeba vzít v úvahu alternativní mechanismy. Je pozoruhodné, že kromě hipokampu a entorhinálního kortexu se MS PVneurony promítají do retrospleniálního kortexu3 a mohly by být zodpovědné za některé zde pozorované poruchy paměti.

Stručně řečeno, pomocí kalciového zobrazování, optogenetiky a elektrofyziologie jsme zjistili, že theta rytmy lze stimulovat nebo zrušit pomocí stimulace RS. Taková stimulace narušila epizodické i pracovní načítání paměti. Tyto účinky nebyly cholinergní a nenarušily aktivitu hippocampu. Konečně, zatímco malá část hipokampálních neuronů reagovala přímo na optogenetickou stimulaci MS, buňky místa, času a vzdálenosti nebyly narušeny manipulacemi s oscilacemi theta. Tyto výsledky společně naznačují, že zatímco vstup MS do hipokampu hraje zásadní roli v paměti, multiplexované kódy v pyramidálních neuronech CA1 nemusí být přímým substrátem pro takové funkce.

Metody

Zvířata

Všechny postupy byly schváleny výborem McGill University Animal CareCommittee a Kanadskou radou pro péči o zvířata (protokol 2015-7650). Celkem n=41 samců (n=20) a samic (n=21) ve věku 8–16 týdnů, B6;129P2 PV-Cre myší (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) byly v této studii použity. n=5 myší bylo použito pro kombinaci optogenetiky s kalciovým zobrazováním; n=3 myší bylo implantováno pro kalciové zobrazování, optogenetiku a elektrofyziologické kontroly; n=4 myší bylo použito v elektrofyziologických studiích; n=29 myší bylo transfekováno a implantováno pro behaviorální testy. Myši byly chovány jednotlivě v 12-hodinovém cyklu světlo/tma při 22 stupních a 40% vlhkosti s potravou a vodou a libitum. Všechny experimenty byly prováděny během světlé části cyklu světlo/tma.

Adeno-asociované virové vektory

Adeno-asociovaný virus AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, získaný z University of Pennsylvania Vector Core) byl použit ve všech experimentech zobrazování vápníku. Adeno-asociovaný virus (AAV) sérotypu dj (hybridní kapsid vytvořený z osmi různých sérotypů AAV) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato byly získány ze zařízení Vector Core Facility na Oregon Health and Science University v Portlandu, Oregon. Ačkoli je to housekeeping gen, nepozorovali jsme transfekci v cholinergních buňkách (viz „Výsledky“ a obr. 2b–e). Jako kontrola byl použit konstrukt eYFP bez sekvence ChrimsonR (v tomto rukopisu nazvaný kontrola YFP).

Chirurgické zákroky

Myši byly anestetizovány isofluranem (5% indukce, 0,5–1% údržba) a umístěny do stereotaxického rámu (David Kopf Instruments). Tělesná teplota byla udržována pomocí vyhřívací podložky, oči byly hydratovány gelem (Optixcare). a Carprofen (10 ml/kg) byl podáván subkutánně. Lebka byla zcela zbavena veškeré pojivové tkáně a byly provedeny malé kraniotomie pomocí zubního vrtáku pro následnou injekci nebo implantát.

Virové injekce. Všechny virové injekce byly provedeny pomocí skleněné pipety připojené k injektoru Nanoject III (Drummond). 500 nl AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (nebo kontrola eYFP) bylo dodáno do MS rychlostí 1 nL/s, na následujících souřadnicích založených na referenčním myším stereotaxickém atlasu69 (vzdálenost od Bregmy v mm): anteroposteriorní (AP) 0,85, mediolaterální (ML) 0, dorzoventrální (DV) −4,50 při použití úhlu 5 stupňů v rovině ML. Po operaci byla zvířata sledována až do zotavení.

Implantát z optických vláken. Dva týdny po injekci byly myši anestetizovány pro implantaci po stejném chirurgickém postupu. Na stejných souřadnicích byla implantována vláknová optika o průměru 200 μm s keramickou objímkou ​​(Thorlabs). Implantáty byly cementovány na místě pomocí C&B-Metabond® (Patterson dental). Na zubní cement byl nanesen černý lak na nehty, aby se zamezilo vyzařování světla během optogenetické stimulace.

Elektrodové implantáty. Pole 7 wolframových mikroelektrod (~1 MΩimpedance) bylo sníženo v dorzálním CA1 pokrývajícím stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad) a stratum lacunosummoleculare (lm). Šrouby umístěné v kosti nad frontálním kortexem a cerebellum sloužily jako základní a referenční. Po umístění elektrody, uzemnění a referenčním umístění byl aplikován dentální cement, aby byl implantát trvale připevněn k lebce.

Implantát pro zobrazování vápníku. AAV5.CamKII.GCaMP6fvirus jsme injikovali (200 nL při 1 nl s−1) do hipokampální CA1 pomocí následujících souřadnic: anteroposteriorní (AP) − 1.86 mm od bregmy, mediolaterální (ML) 1,5 mm, dorzoventrální (DV) 1,5 mm. Dva týdny po injekci byly myši anestetizovány isofluranem a lebka byla vyčištěna. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Simultánní zobrazování vápníku a elektrofyziologické záznamy. Abychom kontrolovali účinky implantátů GRIN na hipokampální theta, jakož i vzájemnou komunikaci mezi miniskopem a optogenetickými excitačními světly, připojili jsme k čočkám GRIN wolframové mikroelektrody. Za tímto účelem jsme čočky GRIN umístili vodorovně pod mikroskop s malým zvětšením v bezprašném prostředí. Na horní okraj čočky GRIN byla pomocí mikromanipulátoru jemně umístěna wolframová mikroelektroda. Použili jsme známý průměr čočky GRIN jako referenční jednotku k odhadu požadovaného vyčnívání elektrody (~50 µm, dále hodnoceno digitálně po pořízení mikrofotografie preparátu) podle našich plánovaných implantačních souřadnic. Malá množství (~ 50 ul) superglue byla nanesena na horní okraj čočky GRIN s elektrodou na místě a ponechána zaschnout po dobu ~ 10 minut před aplikací další vrstvy lepidla. K udržení elektrody připojené k čočce GRIN bylo použito pět tenkých vrstev. Po implantaci těchto elektrod GRIN pomocí výše popsaného protokolu byly vyčnívající dráty jemně ohnuty a skryty pod ochrannou čepičkou (1–1,5 cm vysokou) vytaženou z hrušky ruční sací pipety jako náhrada za Kwik-Sil.

Behaviorální postupy in vivo

Habituace. S myšmi se jemně manipulovalo po dobu ~5 minut po dobu jednoho týdne, s progresivním přivykáním na proceduru ucpávání (vláknová optika, miniskop a elektrofyziologické předamplifikované tethery). Zvířata pak byla naplánována na vodu (přístup 2 hodiny denně).

Záznamy z miniskopu. Miniskopy (V3) byly sestaveny pomocí instrukcí s otevřeným zdrojovým kódem (miniscope.org). Zobrazovací data byla získána pomocí zobrazovacího snímače CMOS (Aptina, MT9V032) a multiplexována pomocí odlehčeného koaxiálního kabelu. Data byla získána pomocí boxu pro sběr dat (DAQ) připojeného přes USB hostitelský řadič (Cypress, CYUSB3013). Chování zvířat bylo zaznamenáno pomocí spotřebitelské webové kamery (Logitech) namontované nad prostředím. Vápník a údaje o chování byly zaznamenány pomocí miniscope.org, zdrojového softwaru DAQ customacquisition. DAQ současně získal behaviorální a celulární zobrazovací toky při 30 Hz jako nekomprimované.avi soubory o 1000 snímcích pro 15-minutové záznamové relace, spolu s odpovídajícími časovými razítky, aby bylo možné přesné časové zarovnání behaviorálních a vápníkových zobrazovacích dat.

Elektrofyziologické záznamy in vivo. Po 1 týdnu po chirurgickém zotavení a jednom týdnu přivykání na nastavení uvazování byla zaznamenána LFP z implantovaných myší. Všechny zaznamenané signály z implantovaných elektrod byly zesíleny předzesilovačem a poté byly digitalizovány při 22 kHz pomocí digitálního záznamového systému (Neuralynx, USA). Záznamy každého signálu kanálu byly uloženy spolu s videonahrávkami a TTL signály z laserové diody pro následnou analýzu.

Optogenetická stimulace. Laserová stimulace byla dodána prostřednictvím optického vlákna (průměr 200 μm) pomocí světelného zdroje s laserovou diodou (Doric Lenses). Intenzita světla byla kalibrována a korigována vlnová délka pomocí Power Meter Bundle s PM100D Console a S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Každá stimulační stimulace (včetně 8 Hz) byla provedena pomocí 5 ms čtvercových pulzů. K aplikaci stimulace zakódovaným světlem jsme použili mikrokontrolér Arduino ke generování signálu oscilace bílého šumu přímo přiváděného do analogového vstupu ovladače laserové diody. K provedení náhodně zvolené frekvenční stimulace jsme použili standardní protokol 5 s ON, 5 s OFF, ale pro každou stimulační epochu jsme použili mikrokontrolér Arduino a náhodně zvolili stimulační frekvenci v pásmu theta. Při aplikaci optogenetické stimulace během chování byl kolem spojení mezi propojovacím kabelem a implantátem ferule myši připevněn volný kus teplem smrštitelné hadičky, aby se omezila emise viditelného světla. Intenzity světla jsou vyjádřeny jako nominální výkon, měřený na špičce sestavy implantátu a kabelu z optických vláken (před chirurgickým umístěním) a korigovaný na příslušnou vlnovou délku.

Behaviorální testy

Sekvenční tónová lineární stopa. Myši byly naplánovány na vodu a měly přístup k vodě pouze 2 hodiny denně od 18 do 20 hodin. Abychom rozluštili prostorové, časové a vzdálenostní kódy, postavili jsme 134 cm dlouhou lineární dráhu pomocí středně šedých kostek Lego®, což umožňuje snadné úpravy a implementace bez použití potřeba trvale upravit strukturu bludiště. Pyroelektrické senzory byly umístěny na každém konci lineární dráhy a byly připojeny k mikrokontroléru Arduino. Každá detekce spustila nový tón v sekvenci, indikující postup k doručení odměny. Pomocí apiezo reproduktoru byly použity a dodány následující tóny: 1 s pípnutí při 2000 Hz, 250 ms pípnutí při 3000 Hz a nepřetržitý tón při 4000 Hz. Když byl spuštěn poslední kontinuální tón, byla na začátek lineární dráhy v uzávěru zkumavky Falcon o objemu 15 ml dodána odměna (10% sacharóza ve vodě). Změny ve směru běhu před spuštěním dalšího tónu byly považovány za chyby a nespustily doručení odměny. Výkon byl měřen jako počet správných pokusů (bez chyby) dělený počtem všech pokusů.

Nové rozpoznávání místa objektu. První den bylo myším umožněno volně prozkoumat 45 × 45 cm tmavě šedé otevřené pole, které na stěnách obsahovalo vizuální prvky (velké bílé horizontální a vertikální mřížky) po dobu 10 minut. Druhý den byly po dobu 10 minut prezentovány dva stejné předměty (základna pomocné ruky). Třetí den bylo myším umožněno prozkoumat stejné otevřené pole, zatímco umístění jednoho ze dvou objektů bylo přemístěno. Pro kontrolu potenciálních prostorových preferenčních zkreslení byla jak počáteční, tak i posunutá poloha objektů randomizována. Myši přiřadily náhodné pořadí testování, které bylo po tři dny testování stejné. Chování bylo zaznamenáno videokamerou (Logitech) a analyzováno offline. Behaviorální analýza byla provedena naslepo ke genotypu a léčbě. Objektové průzkumy byly definovány jako epochy, kdy myši měly nos do 1 cm od objektu. RI byl vypočítán následovně:

Automatizované zpožděné neshody se vzorovým úkolem. Myši byly naplánovány na vodu a trénovány v nepřetržitém T-bludišti ke zpožděnému úkolu, který se neshoduje se vzorkem. Stručně řečeno, každý pokus byl rozdělen do dvou fází: vzorek a test. Ve fázi vzorku bylo jedno rameno zablokováno a myši byly nuceny prozkoumat druhé rameno, kde dostaly odměnu 50 ul 10% sacharózové vody. Po dokončení vzorkovací fáze byly myši vystaveny zpoždění (10 s) ve výchozím oddělení. Poté, během testovací fáze, mohla být prozkoumána obě ramena, ale pouze opačné (neprozkoumané) rameno bylo nastraženo, takže myši musely střídat umístění mezi vzorkovou a testovací fází. Myši byly podrobeny 10 pokusům (vzorek + test) denně po dobu 10 po sobě jdoucích dnů a denní úspěšnost byla vypočtena jako počet správných pokusů dělený celkovým počtem pokusů.

Postmortální histologické analýzy

Po dokončení behaviorálního testování byly myši hluboce anestetizovány směsí ketamin/xylazin/acepromazin (100, 16, 3 mg/kg, v daném pořadí, intraperitoneální injekce) a transkardiálně perfundovány 4% paraformaldehydem (PFA) v PBS. Mozky byly extrahovány a následně fixovány přes noc v PFA při 4 stupních a následně promyty v PBS dalších 24 hodin při 4 stupních. Mozky a řezy byly až do použití chráněny kryoprotekcí v roztoku 30 % ethylenglykolu, 30 % glycerolu a 40 % PBS. Každý mozek byl poté nařezán na 50 um pomocí vibratomu: každý řez byl postupně odebrán do 4 různých 1,5 ml zkumavek, aby bylo možné provádět různé analýzy. (umístění elektrody, imunohistochemie).

Imunohistologie. S použitím jedné zkumavky se sebranými řezy mozku (25% odběr vzorků) pro každou analýzu byly řezy promyty 3 x 5 minut v PBS, aby se odstranil kryoprotektivní roztok. Řezy byly inkubovány přes noc s PGT (0,45% želatina a 0,25% Triton v PBS) při 4 stupních. Dále byly řezy inkubovány s primárními protilátkami: buď 1:200 kozí anti-cholin-acetyl -transferáza z Millipore nebo 1:500 myší anti-PVmonoklonální IgG1 od Sigma-Aldrich v PGT při teplotě místnosti po dobu 48 hodin, respektive 2 hodin. Po promytí 10, 20 a 30 minut byly řezy inkubovány se sekundárními protilátkami [1:2000 oslí anti-kozí spojený s Alexa 488 nebo 1:500 kozí anti-myší IgG1 spojený s Alexa 488 (Life Technologies)] v PGT pro 45 min. Po 10, 20 a 30 minutách promytí v PBS byly řezy upevněny na podložní sklíčka a trvale překryty montážním médiem Fluoromount, které obsahovalo DAPI. Do této studie byly zahrnuty pouze myši s histologicky potvrzeným umístěním implantátů. U GRINlenses musel být povrch čočky<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Analýza dat

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 na lineární dráze).

Automatizované sledování chování. K získání informací o poloze, rychlosti a směru hlavy myší jsme použili DeepLabCut70,71. Krátce jsme vytrénovali model pro detekci uší, nosu, těla a základny ocasu myší. Směr hlavy byl odhadnut pomocí úhlu mezi každým uchem nebo nosem a tělem v závislosti na dostupnosti měření. Údaje o poloze byly interpolovány do vzorkovací frekvence zobrazování vápníku pomocí lineární interpolace. Rychlost byla extrahována výpočtem Δd/Δt, kde d je vzdálenost a t čas, a následně byl výsledek vyrovnán použitím Gaussova filtru s sigma=33 ms k odstranění artefaktů detekce. Rychlostní signály byly použity k identifikaci období lokomotorické aktivity a k výpočtu modulace aktivity místa, času a vzdálenosti specificky pro tato období.

Zobrazovací analýza vápníku. Analýza dat zobrazování vápníku byla provedena pomocí MATLAB 2020a a Pythonu 3.8.4. Videonahrávky byly analyzovány pomocí potrubí Miniscope Analysis (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Stručně řečeno, korekce pohybu (rotace a translace) byla aplikována pomocí NoRMCorre72 a videa byla před zřetězením prostorově převzorkována (3×). Stopy vápníku byly extrahovány pomocí CNMFe51 s použitím následujících parametrů: gSig=3 pixelů (šířka Gaussova jádra), gSiz=20 pixelů (přibližný průměr neuronu), pozadí_model='ring', prostorový_algoritmus='hals', min_corr=0.8 (minimální práh korelace pixelů), min_PNR {{17 }} (minimální prahová hodnota poměru špička-šum).

Stopy surového vápníku byly filtrovány, aby se odstranily vysokofrekvenční fluktuace, a binarizovány: Stručně řečeno, neurony byly považovány za aktivní, když amplituda signálu normalizovaného vápníku přesáhla dvě standardní odchylky a derivát prvního řádu byl nad 0 (další podrobnosti viz odkaz 52 o metodice52). Pro extrakci neuronů laděných na konkrétní proměnné byly sloučeny umístění, čas a vzdálenost (umístění: zásobníky 3 cm; čas: zásobníky 1 s; vzdálenost: zásobníky 3 cm). Z binarizovaných signálů jsme vypočítali marginální pravděpodobnost, že buňky budou aktivní P Að Þ, které používáme jako proxy pro neuronální aktivitu. Ještě důležitější je, že pak odvodíme pravděpodobnost aktivity nebo „pravděpodobnost, že bude aktivní vzhledem ke stavu proměnné“ PA j Si pomocí sdružených proměnných:

kde M je celkový počet možných stavů chování a P(Si∩Aj) je společná pravděpodobnost, že se zvíře nachází v poli I současně s úrovní aktivity j (0 nebo 1). Abychom vyhodnotili významnost získané MIhodnoty, vygenerovali jsme 1000 zamíchaných náhradníků pomocí náhodných kruhových permutací. Kruhové permutace jsme zvolili, protože odstraňují časový vztah mezi neuronální aktivitou a chováním, přičemž stále zachovávají časovou strukturu kalciových přechodů, a vedou tak ke konzervativnějším výsledkům (na rozdíl od úplné randomizace každého datového bodu, která zvyšuje hodnotu významnosti výsledků). Vzhledem k tomu, že promíchané zástupné symboly nebyly systematicky normálně distribuovány, použili jsme neparametrický přístup, kde p-hodnota (pN) odpovídá počtu datových bodů z promíchaného rozdělení, které je větší než skutečná data pro každý bin, děleno počtem permutací52, 73.

Ke stanovení modulace buněk optogenetickými stimulacemi jsme použili podobný přístup, ale vypočítali jsme MI mezi neuronální aktivitou a binarizovanými stimulačními signály (takže považovány za behaviorální stav). Stejný postup kruhového míchání byl poté použit k extrakci statistické významnosti.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, soubor tréninkových dat byl vygenerován s použitím 90 % dat. Zbývajících 10 % dat bylo použito pro testování. Chyba dekódování byla vypočtena pomocí 50 bootstrapped náhradních a souboru 160 buněk pomocí náhodně vybraných datových bodů s náhradou. Předpokládá se, že každý neuron je na sobě nezávislý, což v praxi není tento případ a vede to k větším chybám při rekonstrukci, ale zkracuje se doba výpočtu. Populační zadní pravděpodobnost byla odvozena z následující rovnice:

Sledování buněk během několika dnů. Neurony byly sledovány po několik dní pomocí CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Stručně, prostorové stopy byly zarovnány pomocí pevného zarovnání, aby se opravily rotace a translace. Po zarovnání jsme považovali kandidátní sady buněk za stejný neuron, pokud byla jejich maximální vzdálenost<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Elektrofyziologická analýza. Elektrofyziologická analýza dat byla provedena pomocí MATLAB 2020a s využitím jak zpracování signálu, tak wavelet toolboxu. Waveletová konvoluce byla aplikována na LFPsignals pomocí komplexních Morletových vlnek ('cmor1–1.5' v MATLABu), když byla vyžadována přesnost v časové i frekvenční oblasti. Pohyblivé okno Fourierova konvoluce (okno 2 s v pásmu theta, okno 5 s v pásmu gama, 10 ms pohyblivé kroky) byla použita, když přesnost ve frekvenční oblasti byla upřednostněna před přesností v časové doméně (např. topný graf dominantní frekvence při stimulaci pomocí optogenetiky). Analýza výkonových spektrálních hustot byla provedena, když myši běžely rychlostí 5 cm s-1 nebo vyšší, pokud není uvedeno jinak.

Oscilační síla. OS byl vypočítán jako poměr kumulativní výkonové spektrální hustoty kolem špičkové oscilační frekvence ±1 Hz ke kumulativnímu výkonu pásma v pásmu theta (4–12 Hz). Tato metrika se stane 1, když veškerá výkonová spektrální hustota spadá do špičkové oscilační frekvence (např. 8 Hz při stimulaci na této frekvenci).

Detekce a analýza SWR. Aby bylo možné monitorovat SWR, bylo myším umožněno při nahrávání volně prozkoumávat otevřené pole po dobu 10 minuty. Stimulace (zakódované nebo 8 Hz) byly prováděny s paradigmatem 5 s ON, 5 s OFF. Pro analýzu byla uvažována pouze období tichého klidu. Za tímto účelem jsme vypočítali z-skórovaný poměr výkonu theta/delta po filtraci pro každé frekvenční pásmo, provedení Hilbertovy transformace a pouze zvažovali období, kdy byla výsledná hodnota nižší než 0. Abychom detekovali SWR, filtrovali jsme signály LFP v 150–250 Hz frekvenční pásmo a následně z-skóre. Zvlnění bylo detekováno pomocí funkce findpeaks v MATLABu s následujícími parametry: práh=4 sd, minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0,03 s.

Reference

1. Colgin, LL Rytmy sítě hipokampu. Nat. Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Disinhibition of rat hippocampalpyramidal cells by GABAergic afferents from septum. J. Physiol. 500, 463-474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Synaptické cíle mediálních septálních projekcí v hippocampu a extrahippokampálních kortexech myši. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Spouštěcí vlastnosti anatomicky identifikovaných neuronů v mediálním septu anestetizovaných a neanestetizovaných znehybněných potkanů. J. Neurosci. 26, 9038-9046 (2006).

5. Scotty, F. a kol. Odlišné elektrofyziologické vlastnosti glutamátergních, cholinergních a GABAergních krysích septohippokampálních neuronů: nové implikace pro hipokampální rytmičnost. J. Physiol. 551,927-943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Funkční síť glutamátergických neuronů v oblasti mediálního septa a diagonálního pásu. J. Physiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. a kol. Parvalbuminové interneurony hippocampu ladí populační aktivitu na frekvenci theta. Neuron 86, 1277–1289 (2015).

8. Etter, G. a kol. Optogenetická gama stimulace zachraňuje poruchy paměti u myšího modelu Alzheimerovy choroby. Nat. Commun. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. a kol. Hippokampální nervové okruhy reagují na optogenetické stimulování frekvencí theta generováním zrychlených oscilačních frekvencí. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. a kol. Theta oscilace regulují rychlost lokomoce cestou z hippocampu do laterálního septa. Nat. Commun. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com