Abstraktní

Cistanche tubulosaje vzácná tonická bylina široce používaná v tradiční čínské medicíně. Fenylethanoidové glykosidy reprezentované echinakosidem a akteosidem jsou jejími základními bioaktivními látkami. Tento výzkum si klade za cíl optimalizovat moderní parametry zpracování proCistanche tubulosakousky odvaru pro zlepšení výtěžku echinakosidu a akteosidu a dále prozkoumání jeho antioxidačního stresu a protizánětlivého mechanismu na buněčné úrovni.

Byly provedeny jednofaktorové experimenty, po kterých následovala Box-Behnkenova optimalizace povrchu odezvy s tloušťkou řezu, dobou napařování a teplotou sušení jako ovlivňujícími faktory. K detekci obsahu dvou markerových sloučenin byla přijata vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Model poškození makrofágů RAW264.7 indukovaný LPS byl zkonstruován pro hodnocení farmakologických aktivit. Byly stanoveny reaktivní formy kyslíku (ROS), oxid dusnatý (NO), malondialdehyd (MDA), aktivity antioxidačních enzymů včetně obsahu SOD, CAT, LDH a glutathionu (GSH). ELISA byla použita k testování hladiny sekrece prozánětlivých cytokinů TNF‑, IL‑1 a IL‑6. Pro analýzu stavu fosforylace klíčových proteinů v signální dráze p38/AKT/JNK/NF‑κB byl proveden test Western blot.

Optimální podmínky zpracování byly tloušťka plátku 0,6 cm, doba paření 6 minut a teplota sušení 57 stupňů. Za těchto podmínek dosáhl obsah akteosidu 7,25 % a echinakosidu 31,62 %. Extrakty z optimalizovaných kousků odvaru by mohly významně snížit nadprodukci intracelulárních ROS, NO a MDA v buňkách RAW264.7 stimulovaných LPS. Zvýšil aktivity SOD, CAT, LDH a zvýšil intracelulární hladinu GSH, mezitím výrazně inhiboval uvolňování TNF‑, IL‑1 a IL‑6. Výsledky Western blot ukázaly, že extrakt down-reguloval fosforylační poměr p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK a p-NF-κB/NF-κB.

Optimalizovaná technologie zpracování v páře-sušení může účinně zvýšit rychlost obnovy hlavních fenylethanoidových glykosidůCistanche tubulosa. Kousky odvaru mají antioxidační a protizánětlivé účinky proti poškození buněk spouštěným LPS prostřednictvím inhibice signální dráhy p38/AKT/JNK/NF‑κB. Tato studie poskytuje praktické technické parametry pro standardizované průmyslové zpracováníCistanche tubulosaa nabízí experimentální důkazy pro vývoj funkčních potravin a nutraceutických produktů získaných z tohoto rostlinného zdroje.

Klíčová slova: Cistanche tubulosa; technologie zpracování odvarových kusů; akteosid; echinakosid; antioxidační stres; makrofág RAW264.7; p38/AKT/JNK/NF‑κB dráha

1. Úvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight patří do čeledi Orobanchaceae a její léčivou součástí je sušená dužnatá nať s listy šupin. V Číně se tato rostlina pěstuje hlavně v suchých oblastech severozápadu, s největší pěstební plochou na jihu Sin-ťiangu. Jako známý tonizující rostlinný lék působí na tonizaci ledvinového jangu, doplnění esence a krve a zvlhčení střev pro zmírnění zácpy. Klinicky se používá k léčbě nedostatečnosti ledvin-jangu, nedostatku esence-krev, neplodnosti, bolestivosti a slabosti pasu a kolen a suchosti střev, zácpě.

Fenylethanoidové glykosidy, zejména echinakosid a akteosid, jsou primárními aktivními složkamiCistanche tubulosa. Podle požadavků Čínského lékopisu nesmí být celkový obsah echinakosidu a akteosidu v kvalifikovaných léčivých surovinách nižší než 1,50 %, což slouží jako kritický ukazatel hodnocení kvality. Tradiční postupy zpracování proCistanche tubulosavětšinou používají metody namáčení-vlhčení, krájení-sušení nebo vaření vína v páře. Mnoho studií se zaměřuje na zlepšení výtěžnosti aktivních složek, zatímco výzkumy kombinující optimalizaci technologie zpracování s ověřováním biologické aktivity zůstávají nedostatečné.

Oxidační stres působí jako společný patologický základ mnoha metabolických a zánětlivých onemocnění. Stávající výzkumy prokázaly, že celkové glykosidy jsou extrahovány zCistanche tubulosamůže potlačit zánětlivou odpověď a aktivovat dráhu Nrf2/HO‑1 ke zmírnění poškození jater u zvířat se sepsí. Frakce lignanových glykosidů z této byliny mohou zmírnit zánět makrofágů regulací signalizace PI3K/AKT. Farmakologické vlastnosti moderních zpracovaných odvarových kousků a jejich základní molekulární mechanismus však stále vyžadují další zkoumání.

V této studii byl návrh povrchu odezvy Box-Behnken aplikován na základě jednofaktorových testů, přičemž tloušťka řezu, doba napařování a teplota sušení byly proměnnými pro optimalizaci pracovního postupu zpracování. Po získání optimálních technických parametrů byl sestaven LPS-indukovaný buněčný model oxidativního poškození RAW264.7, který vyhodnotil antioxidační stres a protizánětlivou kapacitu a rozebral relevantní signální mechanismus. Cílem této práce je poskytnout stabilní a provozuschopné parametry zpracování pro poloprovozní výrobu a položit experimentální základ pro komplexní využitíCistanche tubulosazdroje.

2. Materiály a metody

2.1 Rostlinný materiál, činidla a nástroje

Čerstvé dužnaté stonkyCistanche tubulosabyly sklizeny na podzim z Hotan, Xinjiang. RAW264.7 myší monocyt-makrofágové leukemické buňky byly zakoupeny od Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Čína).

Acetonitril a methanol čistoty pro HPLC byly získány od společnosti Merck. Referenční standardy echinakosid (Větší nebo rovno 98 %) a akteosid (Větší nebo rovno 98 %) byly dodány Beijing North Weiye Metrology Institute. Dimethylsulfoxid (DMSO) byl zakoupen od Sigma-Aldrich. DMEM médium s vysokým obsahem glukózy, fetální bovinní sérum (FBS), roztok dvojitých protilátek penicilin-streptomycin, souprava pro kvantifikaci proteinu BCA, testovací soupravy pro NO, MDA, SOD, CAT, GSH a LDH, lipopolysacharid (LPS), činidlo MTT a soupravy ELISA pro zánětlivé cytokiny.

Experimentální přístroje zahrnovaly vysoce výkonný kapalinový chromatograf Shimadzu, rotační odparku, drtič čínských bylinek, termostatickou horkovzdušnou sušárnu, parní hrnec, čtečku mikrodestiček s plnou vlnovou délkou, elektronické analytické váhy, chlazenou centrifugu, biologickou bezpečnostní skříň a inverzní optický mikroskop.

2.2 Jednofaktorový experiment zpracování

ČerstvýCistanche tubulosamasité stonky byly nakrájeny na plátky o tloušťce 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm a 1,2 cm. Plátky byly napařeny po dobu 3 minut, 6 minut, 9 minut, 12 minut, 15 minut, 18 minut a 21 minut v daném pořadí a sušeny při různých teplotních gradientech včetně pokojové teploty (25 stupňů), 40 stupňů, 50 stupňů, 60 stupňů, 70 stupňů a 80 stupňů. Vysušené vzorky odvaru byly rozdrceny a prosety přes síto 40 mesh pro následnou detekci. Pro komplexní hodnocení byl přijat kompozitní bodovací vzorec: Složené skóre=obsah echinakosidu × 50 % + obsah akteosidů × 50 %.

2.3 HPLC Stanovení akteosidu a echinakosidu

Příprava roztoku vzorku: přesně odvažte 1,0 g práškového vzorku, přidejte 100 ml 50% roztoku methanolu. Po 30minutovém máčení byla provedena ultrazvuková extrakce po dobu 40 minut. Ztráta hmotnosti byla po ochlazení doplněna 50% methanolem. Supernatant byl před nástřikem HPLC přefiltrován přes 0,22 um mikroporézní membránu.

Smíšený referenční standardní roztok akteosidu a echinakosidu byl připraven s 50 % methanolem a naředěn na sériové koncentrace pro vynesení standardní křivky. Chromatografické podmínky: COSMOSIL C18 chromatografická kolona; systém mobilní fáze sestával z 0,1% vodného roztoku kyseliny fosforečné (A) a acetonitrilu (B); detekční vlnová délka byla nastavena na 330 nm; teplota kolony 35 stupňů; průtok 1 ml/min. Pro kvantitativní výpočet cílových sloučenin byla použita metoda externího standardu.

2.4 Experimentální design Box-Behnken Response-surface

Podle jednofaktorových experimentálních výsledků byly jako nezávislé proměnné vybrány tloušťka řezu (X1), doba paření (X₂) a teplota sušení (X₃). Jako hodnoty odezvy sloužil obsah akteosidů (Y1, %) a obsah echinakosidu (Y2, %). Software Design-Expert 13.0 byl použit k vytvoření třífaktorového tříúrovňového experimentálního schématu Box-Behnken s celkem 17 skupinami testů. Proložení modelu, analýza rozptylu a predikce parametrů byly dokončeny pomocí softwaru. Praktické ověřovací experimenty byly provedeny trojmo po úpravě teoretických optimálních parametrů tak, aby odpovídaly skutečnému výrobnímu provozu.

2.5 Buněčná kultura a příprava vzorku

Vzorek odvaru získaný za optimalizovaných podmínek zpracování byl připraven do extraktového prášku. Prášek byl rozpuštěn v DMSO a dále zředěn kompletním médiem DMEM obsahujícím 10 % FBS a 1 % penicilin-streptomycin pro buněčné experimenty. Buňky RAW264.7 byly kultivovány ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních s 5 % CO2.

2.6 MTT test na životaschopnost buněk

Buněčná suspenze byla naočkována do 96-jamkových destiček v buněčné hustotě 8 x 104 buněk/ml. Skupiny byly nastaveny jako kontrolní skupina s rozpouštědlem (0,1 % DMSO), modelová skupina LPS (1 ug/ml LPS) a skupiny s více koncentracemiCistanche tubulosaextrakt (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Po 2hodinové preinkubaci vzorků byl přidán LPS s konečnou koncentrací 1 ug/ml kromě jamek pro kontrolu rozpouštědla a inkubováno dalších 24 hodin. Po dobu 4 hodin byl přidán roztok MTT (5 mg/ml). Po odstranění supernatantu se přidal DMSO, aby se rozpustil krystal formazanu. Hodnota absorbance při 490 nm byla detekována čtečkou mikrodestiček, aby se vypočítala životaschopnost buněk. Pro následné funkční testy byl zvolen bezpečný rozsah koncentrací.

2.7 Intracelulární měření ROS

Buňky RAW264.7 byly nasazeny na 6-jamkové destičky v hustotě 4 x 105 buněk na jamku. Po přilnutí ke stěně byly buňky předem ošetřeny gradientovou koncentracíCistanche tubulosaextrakt (12,5, 25, 50, 100 ug/ml) po dobu 2 hodin, poté stimulován 1 ug/ml LPS po dobu 24 hodin. Intracelulární hladina ROS byla detekována pomocí soupravy fluorescenční sondy. Intenzita fluorescence byla zaznamenána při excitační vlnové délce 488 nm a emisní vlnové délce 525 nm.

2.8 Detekce NO, MDA, SOD, CAT, LDH a GSH

Supernatant buněčné kultury byl shromážděn k detekci obsahu NO pomocí Griessovy metody. Buňky byly promyty předem vychlazeným PBS a lyžovány na ledu. Buněčný lyzát byl centrifugován při 10 000 otáčkách za minutu při 4 stupních po dobu 5 minut, aby se získal intracelulární supernatant. Obsah MDA, enzymové aktivity SOD, CAT, LDH a hladina GSH byly měřeny přísně v souladu se specifikacemi soupravy. Pro normalizaci celkového proteinu byla použita metoda BCA.

2.9 ELISA Detekce prozánětlivých cytokinů

Buňky RAW264.7 byly ošetřeny vzorkem a LPS po dobu 16 hodin. Supernatant kultury byl shromážděn a centrifugován při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Sekreční koncentrace TNF‑, IL‑1 a IL‑6 byly kvantifikovány pomocí souprav ELISA.

2.10 Analýza Western Blot

Po 45minutové intervenci vzorků a LPS byl celkový buněčný protein extrahován pomocí RIPA lyzačního pufru. Koncentrace proteinu byla kvantifikována soupravou BCA. Stejné množství vzorku proteinu (50 ug na každou dráhu) bylo denaturováno, separováno elektroforézou SDS‑PAGE a přeneseno na membránu PVDF. Membrána byla blokována 5% roztokem TBST odstředěného mléka po dobu 1 hodiny, poté inkubována s primárními protilátkami přes noc při 4 stupních. Po opakovaném promytí TBST byla sekundární protilátka inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Pásy cílového proteinu byly vizualizovány pomocí ECL chemiluminiscenčního činidla. Pro výpočet poměru fosforylace-protein/celkový protein byla provedena pásová analýza ve stupních šedi.

2.11 Statistická analýza

Pro vykreslování grafů a statistickou analýzu byl použit software GraphPad Prism 8.0.2. Pro porovnání dat byly použity jednocestné ANOVA a t-test.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Výsledky

3.1 Jednofaktorové experimentální výsledky

Tloušťka řezu měla výrazný vliv na obsah cílového glykosidu. Plátky o tloušťce 0,2 cm se daly snadno přepařit, což způsobilo tepelný rozklad účinných látek. Příliš silné plátky bránily uvolňování vnitřních účinných látek. Když byla doba napařování fixována na 10 minut a teplota sušení na 60 stupňů, 0,4 cm byl optimální parametr tloušťky plátku v jednofaktorovém screeningu.

Nedostatečná doba napařování nemohla úplně zničit strukturu rostlinných buněk a vedla k nízkému výtěžku glykosidů. Když doba napařování přesáhla 6 minut, došlo k rozpadu tkáně a degradaci echinakosidu i akteosidu. Při pevné tloušťce plátku 0,4 cm a teplotě sušení 60 stupňů bylo 6 minut nejlepší dobou napařování.

V určitém rozmezí rostl obsah fenylethanoidních glykosidů spolu s nárůstem teploty sušení, přesto však došlo k degradaci při překročení teploty 60 stupňů . S tloušťkou řezu 0,4 cm a dobou napařování 6 minut vykazovalo 60 stupňů nejlepší komplexní výkon v jednofaktorovém třídění.

3.2 Test optimalizace a ověření povrchu odezvy

Analýza rozptylu ukázala, že regresní modely pro obsah akteosidů a echinakosidu byly významné (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), což znamená dobrý stupeň přizpůsobení modelu. Koeficient determinace R² se blížil 1, což prokázalo vysokou korelaci mezi předpokládanou hodnotou a skutečnými experimentálními daty.

Pořadí ovlivňujících faktorů pro obsah akteosidů bylo tloušťka řezu > teplota sušení > doba napařování. Pro obsah echinakosidu bylo pořadí v páře > teplota sušení > tloušťka plátku.

Teoretické optimální parametry vypočítané softwarem byly tloušťka plátku 0,600 cm, doba paření 5,685 min a teplota sušení 57,009 stupňů . S ohledem na praktické výrobní podmínky byly parametry upraveny na tloušťku plátku 0,6 cm, dobu paření 6 min a teplotu sušení 57 stupňů. Tři skupiny paralelních ověřovacích experimentů získaly obsah akteosidů 7,25 % a echinakosidu 31,62 %. Odchylka mezi praktickou hodnotou a teoretickou předpokládanou hodnotou byla 3,89 %, resp. 4,92 %, což prokázalo spolehlivost tohoto modelu odezvy na povrchu.

3.3 Výsledek screeningu buněčné životaschopnosti

V rozmezí koncentrací 0-100 ug/ml,Cistanche tubulosaextrakt z odvarových kousků neměl žádnou zjevnou cytotoxicitu na buňky RAW264.7 a vykazoval mírný účinek podporující proliferaci. Když koncentrace dosáhla 200 ug/ml a více, životaschopnost buněk se významně snížila. Proto byly jako pracovní koncentrace pro následující buněčné experimenty vybrány 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml a 100 ug/ml.

3.4 Účinek na intracelulární hladinu ROS

Ve srovnání s kontrolní skupinou s rozpouštědlem vykazovala modelová skupina LPS pozoruhodně zvýšenou intenzitu intracelulární fluorescence ROS (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Cistanche tubulosaextrakt redukoval nadměrnou akumulaci ROS způsobem závislým na dávce (P < 0.001 versus model group).

3.5 Nařízení o NO, MDA a indikátorech souvisejících s antioxidanty

LPS stimulace indukovala prudké zvýšení obsahu NO a MDA v buňkách RAW264.7. Ve srovnání s modelovou skupinou LPS intervence extraktu významně snížila hladinu NO s tendencí závislou na dávce. 12.5 ug/ml extrakt neměl zjevný účinek na obsah MDA, zatímco extrakt 25–100 ug/ml pozorovatelně snížil koncentraci MDA (P < 0.001).

Po léčbě LPS se aktivity SOD, CAT, LDH a intracelulárního obsahu GSH výrazně snížily. 12.5 ug/ml extrakt mohl zvýšit aktivitu SOD bez zlepšení aktivit CAT a LDH. Extrakt v koncentraci 25-100 ug/ml významně zvýšil aktivity enzymů SOD, CAT, LDH a obsah GSH v závislosti na koncentraci.

3.6 Inhibiční účinek na sekreci prozánětlivých cytokinů

LPS stimulace spustila masivní uvolňování TNF‑, IL‑1 a IL‑6 v makrofázích RAW264.7.Cistanche tubulosapředléčení extraktem z odvaru výrazně potlačilo sekreci výše zmíněných tří prozánětlivých cytokinů (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Modulace na signální dráze p38/AKT/JNK/NF‑κB

Ve srovnání s kontrolní skupinou s rozpouštědlem zvýšila intervence LPS fosforylační poměr p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK a p‑NF‑κB/NF‑κB. Skupiny se střední a vysokou dávkou extraktu významně snížily poměr p‑p38/p38 a p‑JNK/JNK. Všechny koncentrační skupiny snížily hladinu p‑AKT/AKT a p‑NF‑κB/NF‑κB (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Cistanche tubulosaextrakt z odvaru omezil aktivaci signální dráhy p38/AKT/JNK/NF‑κB inhibicí fosforylace proteinů.

4. Diskuse

Aktuální požadavky na zpracování proCistanche tubulosazaznamenané v čínském lékopisu popisují pouze kvalitativní kroky operace bez přesných kvantitativních parametrů. Předchozí výzkumy naznačovaly, že různé metody zpracování by způsobily velké rozdíly v chemickém složení a farmakologické aktivitě mezi surovou a zpracovanou surovinouCistanche tubulosavzorky. Zpracované produkty vykazují lepší antioxidační a imunoregulační výkon ve srovnání se surovinami.

V tomto výzkumu moderní zpracování napařování-sušení optimalizované pomocí metodologie odezvy povrchu získalo mnohem vyšší výtěžek echinakosidu a akteosidu než mnoho tradičních zpracovatelských technik. Naznačuje, že přesná kontrola tloušťky plátku, doby vaření v páře a teploty sušení může účinně zachovat a zlepšit obsah fenylethanoid-glykosidůCistanche tubulosa.

Oxidační stres a zánět jsou úzce propojené patologické procesy. Nadměrné ROS vede k peroxidaci lipidů a akumulaci MDA; mezitím aktivuje následné zánětlivé kaskády a podporuje tvorbu NO a více prozánětlivých cytokinů. Zánětlivé mediátory dále urychlují produkci ROS a tvoří začarovaný patologický cyklus. Naše buněčné experimentální výsledky ukázaly, že optimalizovánoCistanche tubulosaExtrakt z odvarových kousků by mohl eliminovat nadbytečné ROS, redukovat markery oxidativního poškození NO a MDA, obnovit aktivitu antioxidačního enzymového systému reprezentovaného SOD, CAT, LDH a doplnit intracelulární GSH, stejně jako inhibovat uvolňování prozánětlivých cytokinů se zřejmým vztahem mezi dávkou a účinkem.

p38, JNK patřící do rodiny MAPK a osa AKT‑NF‑κB jsou hlavní uzly přenosu signálu zprostředkovávající oxidačně-zánětlivou odpověď makrofágů. Stimulace LPS podporuje fosforylaci p38, JNK a AKT, dále aktivuje NF‑κB a indukuje transkripci řady prozánětlivých genů. Data Western blot to odhalilaCistanche tubulosaextrakt z odvaru blokoval aktivaci fosforylace p38, JNK, AKT a NF‑κB. Lze usuzovat, že vysoký obsah echinakosidu a akteosidu z optimalizovaného zpracování společně přispívají k potlačení signální kaskády p38/AKT/JNK/NF‑κB, aby se zmírnil oxidační stres způsobený LPS a zánětlivé poškození v makrofázích RAW264.7.

V této studii stále existují omezení. Všechna farmakologická hodnocení byla dokončena na buněčném modelu in vitro. Pro ověření in vivo účinnosti a metabolických charakteristik zpracovaného produktu jsou nutné další experimenty na úrovni zvířatCistanche tubulosakousky odvaru.

Závěrem lze říci, že tato studie stanovila kvantifikovatelnou a škálovatelnou moderní technologii zpracování proCistanche tubulosakousky odvaru. Při zpracovatelských parametrech tloušťka plátku 0,6 cm, doba paření 6 min a teplota sušení 57 stupňů se obsah hlavních fenylethanoidových glykosidů výrazně zlepšil. Zpracované kousky odvaru mohou zmírnit oxidační stres a zánětlivé poškození u LPS stimulovaných makrofágů RAW264.7 inhibicí signální dráhy p38/AKT/JNK/NF‑κB. Tento výzkum poskytuje praktickou technickou referenci pro průmyslovou výrobu a nabízí experimentální základnu pro vývoj funkčních potravin a potravinových doplňků pocházejících ze Xinjiangu.Cistanche tubulosa.

Poděkování

Tato práce byla podpořena projektem Mládežnické vědecké a technologické páteřní inovační kapacity kultivace Akademie zemědělských věd v Xinjiang (xjnkq‑2022022) a Xinjiang „Tianchi Doctor Program“ (2021).

Reference

[1] Lin J, Yu H, Zhao Y, a kol. Extrakce echinakosidu zCistanche tubulosaa zkoumání jeho ochranného účinku na poškození jater u potkanů ​​se sepsí.Věda a technologie potravin. 2023;43:e010523.

[2] Guo J, Tang S, Miao Y a kol. Protizánětlivé účinky lignanových glykosidů zCistanche tubulosapramení na LPS/IFN-indukovaných buňkách makrofágů RAW264.7 prostřednictvím dráhy PI3K/AKT.Současná farmaceutická biotechnologie. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Rani V, Deep G, Singh RK, a kol. Oxidační stres a metabolické poruchy: Patogeneze a terapeutické strategie.Vědy o živé přírodě. 2016;148:183‑193.

[4] Martínez‑de‑Toda I, Ceprián N, Díaz‑de‑Castro E. Role oxi‑inflamm‑aging v lidské patofyziologii.Buňky. 2021;10(11):2974.

[5] Chung YC, Song SJ, Lee A a kol. Isobavachin zmírňuje lipopolysacharidy indukované zánětlivé reakce u makrofágů a zebřiček potlačením signálních drah MAPK a NF‑κB.Journal of Ethnopharmacology. 2024;321:117501.