Extrakt z olivových listů (OLE) narušuje vazopresinem indukovaný přenos aquaporinu-2 prostřednictvím aktivace receptoru citlivého na vápník

Pro více informací Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopresin (AVP) zvyšuje propustnost vody vledvinovésběrné potrubí prostřednictvím regulace obchodování s aquaporin{0}} (AQP2). Několik poruch, včetně hypertenze a nepřiměřené sekrece antidiuretického hormonu (SIADH), je spojeno s abnormalitami v homeostáze vody. Bylo prokázáno, že některé fytosloučeniny jsou prospěšné pro lidské zdraví. Zde byly účinky extraktu z olivových listů (OLE) hodnoceny pomocí modelů in vitro a in vivo. Konfokální studie ukázaly, že OLE zabraňuje vasopresinem indukované translokaci AQP2 na plazmatickou membránu v buňkách MCD4 a potkanechledviny. Inkubace s OLE snižuje AVP-dependentní zvýšení koeficientu propustnosti osmotické vody (Pf). K objasnění možných efektorů OLE byl hodnocen intracelulární vápník. OLE zvyšuje intracelulární vápník prostřednictvím aktivace Calcium Sensing Receptor (CaSR).NPS2143 , selektivní inhibitor CaSR, zrušil inhibiční účinek OLE na AVP-dependentní propustnost vody. Experimenty in vivo odhalily, že léčba OLE zvyšuje expresi CaSR mRNA a snižuje AQP2 mRNA paralelně se zvýšením AQP 2-cílící miRNA-137. Společně tato zjištění naznačují, že OLE antagonizuje působení vazopresinu prostřednictvím stimulace CaSR, což naznačuje, že tento extrakt může být prospěšný pro zmírnění poruch charakterizovaných abnormální signalizací CaSR a ovlivněním renální reabsorpce vody.

Olivovníkové listy byly široce používány jako tradiční prostředky k léčbě několika nemocí, zejména ve středomořských zemích. Listy se běžně konzumují v lidské stravě jako extrakt nebo prášek k přípravě nálevů nebo bylinkového čaje. Analýza chemické charakterizace odhalila, že listy olivovníku obsahují několik bioaktivních sloučenin, které mohou mít příznivé účinky u určitých chorob, jako je metabolický syndrom, dyslipidémie a hypertenze. U pacientů s esenciální hypertenzí OLE snížil krevní tlak a mírně snížil glykémii a kalcémii. Byly nalezeny četné polyfenoly, jako je oleuropein, hydroxytyrosol a tyrosol, obohacené extraktem z listů zelených oliv (OLE)5 a je známo, že se podílejí na prevenci určitých onemocnění charakterizovaných oxidačním stresem. Proto v posledních několika letech roste zájem o zkoumání potenciálních prospěšných účinků extraktu z olivových listů mezi vědci v různých oblastech výzkumu. OIE vykazovala významný antiproliferativní účinek v buňkách maligního mezoteliomu změnou intracelulární dynamiky vápníku, možná zaměřením na T- kanály typu Ca2 plus. Je zajímavé, že bylo zjištěno, že OLE má antihypertenzní účinky na genetickou hypertenzi u spontánně hypertenzních potkanů ​​(SHR), související se zlepšením vaskulární funkce*. Nadměrná reabsorpce vody hraje důležitou roli v patogenezi zvýšeného krevního tlaku. U hypertoniků léčených extraktem z olivových listů bylo zjištěno významné snížení několika zánětlivých faktorů spojených s poklesem krevního tlaku. Kromě toho nadměrné zadržování vody charakterizuje několik poruch, jako je cirhóza jater, srdeční selhání a nepřiměřená sekrece antidiuretického hormonu (SIADH). Homeostáza tělesné vody je přísně kontrolována antidiuretickým hormonem vasopresinem (AVP), který se uvolňuje v dehydratovaném stavu. AVP se váže na svůj příbuzný receptor V2R lokalizovaný na bazolaterální membráněledvinovéhlavní buňky, čímž aktivují signální dráhu cAMP, která vede k translokaci vezikul nesoucích aquaporin-2(AQP2) z intracelulární zásoby do apikální plazmatické membrány, kde dochází k reabsorpci vody. Na molekulární úrovni může několik faktorů modulovat vodní rovnováhu ledvin. Zvýšená hladina luminálního vápníku downregulovala krátkodobý vasopresin-dependentní transport AOP2 prostřednictvím aktivace receptoru citlivého na vápník (CaSR)1,12. Na druhé straně aktivace CaSR v podmíněně imortalizovaných renálních proximálních tubulárních epiteliálních buňkách, izolovaných z lidské moči, vyvolala významné zvýšení cytosolického vápníku a významně snížila zvýšení cAMP vyvolané forskolinem (FK), přímým aktivátorem adenylátové klasy3. v buňkách renálního sběrného kanálu MCD4, stabilně exprimujících vodní kanál AOP2, stimulace CaSR zmírnila cAMP-dependentní zvýšení fosforylace AQP2 na serinu 256, což je klíčová událost v signální transdukční kaskádě aktivované vasopresinem a která nakonec zvýšila propustnost vody4 ,15 Dále vledvinařezy z vnitřní medulla myší ledviny, aktivace CaSR kalcimimetickým NPS-R568 způsobila významné zvýšení AQP2-cílící miRNA-137, což potvrzuje těsnou souhru mezi signální dráhou CaSR a AQP{ {4}}závislá propustnost vody.17.V této studii byly účinky extraktu z olivových listů, získaného z místního kultivaru Coratina, hodnoceny na vasopresinem indukovanou funkci AQP2 v buňkách MCD4 sběrného kanálu ledvin stabilně exprimujících AOP2 a v dDAVP ošetřeným krysám, kterým byl injikován extrakt. Poskytujeme důkazy, že léčba OLE působí proti vazopresinové odpovědi v renálních buňkách, což by mohlo částečně vysvětlit její diuretický účinek. Je zajímavé, že se zdá, že tento účinek souvisí s OLE-indukovanou aktivací CaSR, receptoru, o kterém je známo, že má negativní souhru s vazopresinovým receptorem12.

Zjistěte více o účincích cistanche na ledviny

Výsledek

Účinky OLE na funkci AQP2 indukovanou vasopresinem v buňkách MCD4. Chcete-li prozkoumat možné zapojení OLE do funkce AQP2 závislé na vasopresinu,ledvinovéjako experimentální model byl použit sběrný kanál MCD4 buněk, stabilně exprimujících vazopresinový receptor 2 (V2R) a lidský AQP218. Konfokální studie (obr. 1A) odhalily, že ve srovnání s buňkami ošetřenými dDAVP, ve kterých se barvení AQP2 lokalizovalo na apikální plazmatickou membránu, léčba OLE zabránila membránové lokalizaci AOP2 indukované stimulací dDAVP. V souladu s těmito pozorováními léčba OLE narušila dDAVP-indukované zvýšení časové osmotické odpovědi (označené jako 1/t na obr. 1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 procent, n=292 buněk vs. dDAVP=206,8±5,49 procent ,n=186 buněk;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Účinky OLE v ledvinách krys injikovaných OLE.

Pro další zkoumání účinků OLE byly provedeny studie in vivo. Konkrétně krysám byl injekčně podáván OLE (250 mg/kg/den) jednou denně po dobu tří dnů. Alternativně byly krysy současně léčeny OLE po dobu 3 dnů a dDAVP po dobu 30 min. Hodnocení CaSR mRNA, která byla izolována z renálního sběrného kanálku krys a zpracována pro PCR v reálném čase (obr. 6), odhalilo významný nárůst CaSR mRNA v OLE(OLE=1,87±0,29, n{{ 10}} krys vs. CTR=1,02±0,17, n=5 krys; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">ledvinabyla provedena analýza western blotting a konfokální studie (obr. 9). U potkanů ​​s injekcí OLE/dDAVP byla fosforylace AQP2 na serinu 256 významně snížena ve srovnání s renálními tkáněmi zvířat léčených dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 krys vs. dDAVP=2.16±0.25,n{12}} krys; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskuse

Vápník je důležitý intracelulární posel, který moduluje množství buněčných funkcí2. Abnormální signalizace vápníku může vést k několika nemocem, včetně srdečního selhání, rakoviny a hypertenze23. Specifická kontrola exprese a aktivity proteinů řídících mnohočetné intracelulární vápníkové signály se ukázala jako úspěšná při řešení mnoha poruch, a proto je atraktivní pro vývoj léčiv. Tato studie poskytuje nový pohled na mechanismus účinku OLE tím, že ukazuje jeho schopnost modulovat intracelulární vápníkovou signalizaci prostřednictvím stimulace CaSR, která se podílí na jemném ladění vasopresinem indukovaného přenosu AQP2 a exprese. Za fyziologických podmínek hraje AQP2 důležitou roli při kontrole homeostázy tělesné vody25. Stimulace intracelulárního aparátu, vedoucí k lokalizaci AQP2 na apikální plazmatické membráně, má za následek abnormální retenci vody a následnou hyponatrémii jako u syndromu nepřiměřené sekrece antidiuretického hormonu (SIADH), jaterní cirhózu a městnavé srdeční selhání – u myši modelu SIADH, spojeného s haploinsuficiencí polycystického onemocnění ledvin 1, byla bazální intracelulární hladina vápníku významně snížena ve srovnání s hladinou naměřenou ve sběrných kanálcích myší divokého typu. Nízká hladina intracelulárního vápníku snižovala aktivitu určitých enzymů včetně proteinové fosfatázy PP2A, což vedlo k upregulaci fosforylace AOP2 na serinu 2561. Naproti tomu. aktivace CaSR kalcimimetickým NPS-R568 zvýšila intracelulární koncentraci vápníku a snížila hladinu cAMP v buňkách s deficitem PKD1. Důležité je, že cytosolový vápník může downregulovat vápníkem inhibovatelnou adenylovanou cyklázu3, a tím jemně vyladit intracelulární hladinu cAMP. V buňkách MCD4 skutečně stimulace CaSR pomocí NPS-R568 snížila AQP2-pS256 prostřednictvím inhibice adenylátu cykláza4. V této studii léčba OLE zabránila na vasopresinu závislému zvýšení cAMP a AOP2-pS256, pravděpodobně sekundárně ke zvýšení intracelulární koncentrace vápníku. Za zmínku stojí, že vystavení externímu zdroji cAMP pomocí propustného 8-Br-cAMP významně působilo proti inhibičnímu účinku OLE na dráhu V2R.

Zvýšená hladina cytosolického vápníku může vést k buněčné smrti a apoptóze. Trvalé zvýšení intracelulárního vápníku z 250 nM na více než 600 nM však podpořilo přežití neuronů4. U buněk MCD4 se léčba OLE v koncentraci 0,1 mg/ml neprojevuje cytotoxický účinek. Při této koncentraci OLE (0,1 mg/ml) mírně zvýšil intracelulární hladinu vápníku. Zobrazování vápníku odhalilo, že akutní stimulace pomocí OLE způsobila přechodné zvýšení intracelulárního vápníku prostřednictvím aktivace CaSR, která je zrušena, když byly buňky preinkubovány se selektivním antagonistou CaSR NPS2143, v buňkách proximálního tubulu ledvin alosterická aktivace CaSR pomocí I-ornithinu snížil produkci ROS, čímž se snížil mitochondriální oxidační stres, který způsobil buněčnou apoptózu356. Naše předchozí studie navíc ukázala, že exprese variant zesílení funkce CaSR snížila uvolňování ROS a S-glutathionylaci AQP237. Inkubace s OLE snížila tvorbu ROS v buňkách MCD435, což ukazuje jeho antioxidační schopnost. Nicméně v tuto chvíli není jasné, zda OLE ovlivňuje AOP2-S-glutathionylaci. Četné studie odhalily, že OLE nebo oleuropein, který je hlavní složkou OLE, může mít protektivní roli tím, že inhibuje buněčnou smrt,39 U potkanů ​​dostávajících OLE však byly popsány účinky závislé na dávce. Příznivé odpovědi byly získány při dávkách 250 a 500 mg/kg. Naproti tomu při vyšších koncentracích může mít ošetření OLE škodlivé účinky, pravděpodobně v důsledku prooxidačních účinků několika fytosloučenin. V této studii byl potkanům injikován OLE v dávce 250 mg/kg po dobu tří dnů, což ukazuje na upregulaci CaSR. Úroveň exprese CaSR je zvýšena určitými sloučeninami, které působí jako alosterické aktivátory receptoru. Kalcimimetika skutečně snížila vaskulární kalcifikace zvýšením biosyntézy CaSR v lidských buňkách hladkého svalstva cév0. V této soutěži nelze vyloučit možnost, že určité sloučeniny v OLE mohou fungovat jako alosterické modulátory CaSR. Na druhé straně může stimulace vasopresinem vést k uvolnění IL-6, což může přispět ke zvýšení hladiny exprese CaSR42.

V ledvinách je stimulace signalizace CaSR spojena s downregulací exprese AQP2 pravděpodobně prostřednictvím generace miR-137. miRNA jsou klíčové posttranskripční modulátory. Bylo také popsáno několik miRNA závislých na vasopresinu zacílených na expresi AQP243. Transfekce miR-32 a miR-137 významně snížila hladinu exprese AOP2 v buňkách mpkCCDc14. Je zajímavé, že OLE může zeslabit zánětlivé signály a vyvinout ochranné účinky modulací úrovně exprese několika miRNA." Zejména v buňkách multiformního glioblastomu OLE podporoval expresi různých miRNA včetně miR-13745, která se účastní downregulace signální dráha Akt/mTOR 46. Za zmínku stojí, že léčba oleuropeinem zabraňuje signalizaci Akt/mTOR prostřednictvím aktivace kalciem indukované CAMK a AMPK“. Aktivace CaSR pomocí NPS-R568 aktivuje AMPK a snižuje aktivitu mTOR v lidských proximálních tubulárních buňkách3. V souladu s těmito zjištěními inkubace s OLE zvyšuje cytosolický vápník, snižuje aktivitu PKA a snižuje velikost cysty v modelu 3D buněčné kultury48. Společně tato zjištění naznačují, že OLE může být užitečný při léčbě poruch charakterizovaných dysregulací dynamiky intracelulárního vápníku související s downregulací signalizace CaSR.

Extrakt z olivových listů se skládá z několika bioaktivních složek, včetně polyfenolů, vlákniny a minerálů49. V tuto chvíli není jasné, zda jedna sloučenina nebo synergická kombinace fytosloučenin v OLE může být prospěšná při modulaci intracelulárních odpovědí. Extrakt použitý v této studii byl použit jako možná potravinová přísada, a proto je důležité definovat fyziologický dopad samotného extraktu s ohledem na to, že několik fenolů, včetně hydroxytyrosolu, může být filtrováno ledvinami a získáno v moči50. Další studie poskytnou účinnost specifických složek, které mohou aktivně regulovat intracelulární vápníkovou signalizaci prostřednictvím CaSR. Závěrem lze říci, že tato studie poskytuje důkaz, že OLE lze považovat za nové potenciální adjuvans užitečné ke zmírnění poruch charakterizovaných snížením exprese CaSR, jakož i signalizací a ovlivněním propustnosti ledvinové vody.

Materiály a metody

Chemikálie a protilátky.Všechny chemikálie a antibiotika byly zakoupeny od společnosti Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Calcein-AM, Fura-2-AM, buněčná kultivační média, fetální bovinní sérum (FBS) a chemiluminiscenční substráty Super Signal West Pico byly zakoupeny od společnosti Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Aquaporin{ {2}} (AQP2) byl detekován pomocí specifických protilátek (C-tail Ab) vytvořených proti syntetickému peptidu odpovídajícímu posledním 15 C-koncovým aminokyselinám lidského AQP2!. Protilátky AQP2-pS256 byly laskavě darovány profesorem Peterem Deenem. Sekundární kozí protilátky proti králičí křenové peroxidáze byly získány od společnosti Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Sekundární kozí-anti-králičí protilátka navázaná na Alexa{14}} byla zakoupena od Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Výroba extraktu bohatého na fenoly a chemická charakterizace.Výroba extraktu bohatého na fenoly z olivových listů byla provedena tak, jak je popsáno v Ranieri et al.35. Po mletí v mixéru (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA) byla přidána voda ddH2O (poměr 1/20, w/y) a poté třikrát podrobena ultrazvuku (CEIA, Viciomaggio, Itálie). , pokaždé po dobu 30 minut při 35±5 stupních. Nakonec byly extrakty filtrovány přes filtrační papír, lyofilizovány a skladovány při -20 stupni C. Získané extrakty byly filtrovány nylonovými filtry 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Německo) a použity pro chemickou charakterizaci. Celkový obsah fenolu, antioxidační aktivita a identifikace jednotlivých fenolických sloučenin byly provedeny podle Difonza et al.. OLE vykázal obsah polyfenolů stanovený Folin-Ciocalteu na 195 mg. ekvivalenty kyseliny gallové (GAE) a antioxidační aktivitu, stanovenou ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-diamonná sůl kyseliny sulfonové）), odpovídající 750 μmol TE (ekvivalenty Trolox) .

Buněčné kultury a ošetření.Jako experimentální model byly použity buňky myšího kortikálního sběrného kanálku MCD4, stabilně exprimující lidský AQP2 a chimérický V2R-Rluc18. Buňky byly pěstovány ve směsi 1:1 Dalbec-cos modifikovaného Eagleova média a F-12 doplněného 5 procenty (y/y) fetálního bovinního séra. 1 procento (y/y) L-glutaminu a 1 procento penicilin/streptomycin, 5 μM dexamethason, 400 ug/ml G418（pro rezistenci AQP2） a 1 ug/ml puromycin (pro rezistenci V2R-Rluc) ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO, při 37 stupních. Buňky MCD4 byly ponechány v bazálních podmínkách (CTR) nebo byly dlouhodobě ošetřeny OLE při 0,1 mg/ml O/N, dDAVP při 100 nM po dobu 30 minut nebo byly současně ošetřeny OLE a dDAVP nebo NPS2143 při 1 μM O/N Alternativně byly buňky vystaveny 8-Br-cAMP při 500 μM po dobu 45 minut, krátkodobé experimenty byly prováděny s OLE při 1 mg/ml po dobu 5 minut a NPS2143 při 10 uM po dobu 15 minut. Experimenty byly provedeny 3-5 nezávisle na sobě s použitím buněk z různých pasáží.

Zvířecí model a léčba.Všechny postupy byly provedeny v souladu s dánskými národními směrnicemi pro péči a zacházení s pokusnými zvířaty a publikovanými směrnicemi Národního institutu zdraví. Protokoly byly schváleny Institutem klinické medicíny. Aarhus University, podle licencí pro použití pokusných zvířat vydaných dánským ministerstvem spravedlnosti (číslo schválení 2015-15-0201-00658). Studie byly provedeny na dospělých samcích potkanů ​​Wistar s počáteční hmotností 200-225 g. Zvířata byla udržována na standardní stravě pro hlodavce (Altromin, Lage, Německo) a měla volný přístup k vodě z vodovodu. Během experimentů byly krysy umístěny ve skupinách po dvou na klec, s cyklem světlo-tma 12:12 h, teplotou 21 ± 2 °C a vlhkostí 55 ± 2 procenta. Pět krys bylo ošetřeno subkutánní injekcí 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Dánsko) ve 200 ul fyziologického roztoku/zvíře a pět krys ošetřených vehikulem sloužilo jako kontroly. Po 30 minutách byly krysy usmrceny a ledviny byly zpracovány, jak je popsáno níže.

Buňky a IMCD lyzáty.Buňky byly pěstovány na {{0}}mm miskách a resuspendovány v pufru obsahujícím 220 mM mannitol, 70 mM sacharózu, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0, 0,5 M EDTA pH 8,0, 1 M Tris-HCl pH 7,4 v přítomnosti proteáz (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptinu a 2 mg/ml pepstatinu A) a fosfatáz (10 mM NaF a 1 mM inhibitory orthovanadičnanu sodného). Alternativně byly připraveny řezy ledvin o velikosti přibližně 0,5 mm a ekvilibrovány po dobu 10 minut v pufru obsahujícím 1 až 8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukózu, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgS04 a M 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Renální papily byly rozsekány nůžkami ve stejném pufru v přítomnosti proteáz (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptinu a 2 mg/ml pepstatinu A) a fosfatáz (10 mM NaF a 1 mM sodíku orthovanadate) inhibitory. Po sonikaci (60 kHz po dobu 5 s) byly lyzáty centrifugovány při 12,000×g po dobu 10 minut. Supernatanty byly shromážděny a použity pro imunoblotovací studie'8.

Konfokální mikroskopie.Konfokální studie byly provedeny, jak bylo popsáno dříve1. Stručně, buňky byly pěstovány na vložkách PET pro buněčnou kulturu a ošetřeny, jak je popsáno výše. Alternativně byly řezy ledvin získané z kontrolních, OLE, dDAVP a OLE s dDAVP ošetřených potkanů ​​podrobeny imunofluorescenčním experimentům, jak bylo popsáno dříve. Snímky byly získány pomocí konfokálního laserového skenovacího fluorescenčního mikroskopu Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Švýcarsko). Gelová elektroforéza a imunoblotování. Proteiny byly separovány na 12% bezbarvých polyakrylamidových gelech (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) za redukčních podmínek, jak bylo popsáno dříve=5,52. Stručně, proteinové pásy byly přeneseny na membrány Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Německo) a imunoblotovány pomocí anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) a anti-AQP2-pS256 protilátek. Imunoreaktivní signály byly získány pomocí chemiluminiscenčních substrátů Super Signal West Pico se systémem Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Pásy byly normalizovány na celkový protein pomocí technologie bez skvrn (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Denzitometrická analýza byla provedena pomocí ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a analyzována pomocí GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Test propustnosti vody.Propustnost osmotické vody byla měřena, jak bylo popsáno dříve43. Stručně, buňky MCD4 byly pěstovány na 40-mm skleněných krycích sklíčkách. Po ošetření byly buňky naplněny 10 μM membránou propustným Calceinem-AM po dobu 45 minut při 37 °C, 5 % CO, v DMEM/F-12. Krycí sklíčka byla upevněna v perfuzní komoře (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Měření byla provedena pomocí inverzního mikroskopu TE{11}}S (Nikon Eclipse microscope, Tokio, Japan) vybaveného pro měření fluorescence jednotlivých buněk a zobrazovací analýzy. Vzorky naplněné Calceinem-AM byly excitovány při 490 nm. Fluorescenční měření po izoosmotickém (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl.. 1 mM CaCl., 10 mM Hepes sulfonové kyseliny, 5 mM glukóze, pH 7,4) nebo hyperosmotickém (izosmotický roztok s přidaným 135 mM mannitolu) . byly provedeny pomocí softwaru Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Kanada). Byly zaznamenány údaje o časovém průběhu fluorescence po perfuzi buněk iso- a hyperosmotickými roztoky. Časový průběh smršťování buněk byl měřen jako časová konstanta (Ki, vyjádřeno jako 1/r, s), parametr korelovaný s propustností pro vodu, získaný proložením dat s exponenciální funkcí analyzovanou pomocí GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, USA).

Měření přenosu energie fluorescenční rezonancí.K vyhodnocení intracelulárních změn cAMP byla použita technologie fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET). Pro experimenty FRET byly buňky transfekovány plazmidem kódujícím senzor H96 obsahujícím cAMP-vazebný konsenzuální motiv EPAC1 vložený mezi azurový fluorescenční protein (CFP) a cp173Venus-Venus, jak bylo uvedeno dříve32.33.54. Plazmid kódující sondu H96 byl darem od Dr.K. Jalink. Vizualizace buněk exprimujících ECFP a/nebo EYFP a detekce FRET byla provedena pomocí invertovaného mikroskopu TE2000-S (Nikon Eclipse microscope, Tokio, Japan). Každý snímek byl opraven a analyzován, jak bylo uvedeno dříve55.

Měření intracelulárního vápníku. Měření intracelulárního vápníku bylo provedeno tak, jak bylo uvedeno dříve56. Stručně, buňky MCD4 byly naneseny 4 μM Fura-2 AM po dobu 15 minut při 37 stupních v DMEM/F-12. Ringerův roztok byl použit k perfuzi buněk během experimentu obsahujícího 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM glukózu, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Při fluorescenčních měřeních byla krycí sklíčka s přetíženými buňkami upevněna do perfuzní komory (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA). Měření byla provedena pomocí invertovaného mikroskopu TE2000-S (Nikon Eclipse microscope, Tokyo. Japan). Poměr intenzit fluorescence při 340 a 380 nm byl vynesen do grafu a vypočten jako změna fluorescence. Zejména stimulace pomocí OLE (1 mg/ml) nebo NPS2143 (10 μM) byla porovnána u stejného typu buněk se stimulacemi získanými po stimulaci maximální dávkou vápníkem zprostředkovaného agonisty ATP (100 μM), který byl použit jako vnitřní kontrola (100 procent).

Hladina intracelulárního vápníku byla měřena v ustáleném stavu a kalibrována, jak je popsáno Grynkiewiczem57. OLE a NPS2143 byly používány dlouhodobě při 0,1 mg/ml a 1 uM, v daném pořadí, a každý vzorek byl kalibrován přidáním 5 μM ionomycinu v přítomnosti 1 mM EGTA（Rm.） a následně 5 μM ionomycin v 5 mM CaCl, (RMA).

Analýza PCR AQP2 a CaSR mRNA v reálném čase u kontrolních a léčených potkanů.Pro měření relativní exprese mRNA ve vnitřním sběrném kanálku dřeně (IMCD) izolovaném z kontrolních a ošetřených krysích ledvinových papil byly provedeny experimenty PCR v reálném čase. Byly vyrobeny řezy ledvin o velikosti přibližně 0,5 mm a ekvilibrovány po dobu 10 minut v pufru obsahujícím 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukózu, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgS04 a 1,8 mM KH2P04 (pH 7,4). Renální papila byla izolována pod stereomikroskopem. Vzorky od kontrolních a ošetřených krys byly poté nasekány nůžkami přímo v Trizolu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Reverzní transkripce byla provedena na 2,5 ug celkové RNA pomocí SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), v souladu s doporučeními výrobce (25 °C po dobu 10 minut; 42 °C po dobu 60 minut; 85 °C po dobu 5 minut). Amplifikace PCR v reálném čase byla provedena pomocí TagMan Fast Advanced Master Mix s testy CaSR, AOP2 a GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) v systému StepOne Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), nastavení podmínek tepelného cyklování podle specifikace výrobce (95 °C po dobu 20 s; 40 cyklů alternativně při 95 °C po dobu 1 s a 60 °C po dobu 20 s). Výsledky byly vyjádřeny jako 2- hodnoty (relativní kvantifikace) s △ACT=(Ct cíl-Ct GAPDH) ošetřené-(Ct cíl-Ct GAPDH)Sham1.

hodnocení miRNA{0}} u kontrolních a léčených potkanů.Obsah miRNA{{0}} v kontrolním a ošetřeném sběrném kanálku vnitřní dřeně potkana byl hodnocen pomocí TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), který umožnil vysoce citlivou a specifickou notifikaci zralé miRNA pomocí kvantitativní PCR. Byly vyrobeny řezy ledvin o velikosti přibližně 0,5 mm a ekvilibrovány po dobu 10 minut v pufru obsahujícím 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukózu, 3,2 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgS14 a mM MgS04 KH2P04 (pH 7,4). Ledvinová papila byla izolována pod stereomikroskopem. Vzorky z kontrolních a ošetřených krys byly poté rozdrceny nůžkami přímo v Trizolu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), aby se extrahovala celková RNA. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Katalog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) byl použit k získání syntézy cDNA podle protokolu poskytnutého výrobcem (Poly(A)tailing reakce; ligační reakce; reakce reverzní transkripce; miR-Amp reakce). Syntetická RNA (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) s 59-fosforem byla syntetizována společností Thermo Fisher Scientific a použita k provedení kalibrační křivky k interpolaci hodnot vzorku miRNA a k získání přesného vyhodnocení (v nanogramech) obsahu miR-137 v sample16, pomocí GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Statistická analýza.Všechny hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM Statistická analýza byla provedena jednosměrnou ANOVA následovanou Newman-Keulsovým vícenásobným srovnávacím testem s *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Prohlášení, etické schválení a souhlas s účastí.Studie na zvířatech byly provedeny v souladu s dánskými národními směrnicemi pro péči a zacházení s pokusnými zvířaty a publikovanými směrnicemi Národního institutu zdraví. Etická komise pro péči o zvířata Institutu klinické medicíny Univerzity Aarhus schválila protokoly studie v souladu s licencemi pro použití experimentálních zvířat vydaných dánským ministerstvem spravedlnosti (číslo schválení 2015-15-0201-00658). Autoři potvrzují, že všechny metody byly provedeny v souladu s příslušnými směrnicemi a předpisy. Autoři navíc potvrzují, že studie byla provedena v souladu s pokyny ARRIVE.

Reference

1. El, SN & Karakaya, S. Olivovník (Olea europaea) zanechává potenciální příznivé účinky na lidské zdraví. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Účinky extraktu z olivových listů na metabolickou odpověď, funkce jater a ledvin a zánětlivé biomarkery u pacientů s hypertenzí. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive polyfenoly a metabolický syndrom. Molekuly

4. Cherif, S. a kol. Klinická studie titrovaného extraktu Olea při léčbě esenciální arteriální hypertenze. J. Pharm. Belg. 51, 69-71 (1996).

5. Difonzo, GRA a kol. Zelené extrakty z kultivaru oliv cortina zanechávají antioxidační charakterizaci a biologickou aktivitu. J. Funct. Jídlo 31, 8.

6. Herrero, M. a kol. Nové možnosti zhodnocení vedlejších produktů olivového oleje. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. a kol. Extrakt z olivových listů obohacený oleuropeinem ovlivňuje dynamiku vápníku a zhoršuje životaschopnost buněk maligního mezoteliomu. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. a kol. Antihypertenzní účinky extraktu z olivových listů obohaceného oleuropeinem u spontánně hypertenzních potkanů. Funkce jídla 7, 584–593.

9. Hall, JE Renální dysfunkce spíše než nonrenální vaskulární dysfunkce. Zprostředkovává hypertenzi vyvolanou solí. Náklad 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin a regulace aquaporinu-2. Clin. Exp. Nephrol. 17, 751–764.