Nové deriváty benzochinonu proti stárnutí z Onosma Bracteatum Wall, část 2
May 17, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
2.3. Aktivita proti stárnutí v kvasinkovém kmeni K6001
Aktivita proti stárnutí izolovaných benzochinonů (1-5) byla hodnocena pomocí kvasinkového replikačního biologického testu životnosti K6001. Resveratrol (Res), známá látka proti stárnutí, byla použita jako pozitivní kontrola pro kontrolu spolehlivosti systému biologických zkoušek. Nejúčinnější koncentrace Res byla 10 μM v kvasinkovém replikačním biotestovacím systému, jak je uvedeno v našich předchozích publikacích 【4-6】.cistanche herbaJak je znázorněno na obrázku 4, alomikrofylon (1) v 3 μM, ehretichinon （2） a ehretichinon C（4） v 1 a 3 μM a ehretichinon D （5） v 1 μM, vykazovaly replikativní významné prodloužení délky života K6001 kvasinkový kmen, zatímco ehretichinon B (3) byl neaktivní. Tento výsledek ukázal potenciál proti stárnutí benzochinonů (1, 2, 4 a 5) izolovaných z O. bracteatum.
3. Diskuse
V kontextu globálního stárnutí má velký význam výzkum a vývoj léků proti stárnutí pro zlepšení kvality života starých lidí a snížení prevalence nemocí souvisejících s věkem.cistanche růst penisuTato studie popisuje izolaci, objasnění struktury, biologickou aktivitu a krátkou studii SAR anti-aging benzochinonových derivátů z O.bracteatum1.
V této studii byly dva známé (1 a 2) a tři nové (3-5) benzochinonové deriváty izolovány ze vzorků ethylacetátové vrstvy O. bracteatum pod vedením replikativního biologického testu životnosti kvasinek K6001. Struktury nových benzochinonů (3-5) byly objasněny rozsáhlou spektroskopickou analýzou. Známé benzochinony, alomikrofylon(1) a ehretichinon(2) byly purifikovány a identifikovány porovnáním spektroskopických údajů s údaji uvedenými v literatuře [17-19]. Dříve se uvádělo, že obě sloučeniny mají antialergickou a protizánětlivou aktivitu [17,19]. Podle našich nejlepších znalostí nebyla pro tyto sloučeniny hlášena žádná studie týkající se stárnutí. Tyto izolované sloučeniny sdílely stejnou benzochinonovou kostru a jejich rozdíly byly v modifikacích v polohách C-11 a C{15}}.
Cistanche může proti stárnutí
Hodnocení biologických aktivit bylo provedeno pro studium vztahu mezi strukturou a aktivitou.výhody cistanche salsyVýsledky na obrázku 4 ukázaly, že izolovaný alomikrofylon (1), ehretichinon (2) a ehretichinon CD (4-5) významně prodloužily replikační životnost kvasinek. Nicméně ehretichinon B (3), který měl stejný benzochinonový skelet, ale různé modifikace byly neaktivní. Podle studie vztahu mezi strukturou a aktivitou (SAR) v rámci těchto izolovaných sloučenin jsme došli k závěru, že přítomnost methylových a exomethylenových skupin na C-9' je důležitá pro aktivitu proti stárnutí, jako u ehretichinonu (2) a ehretichinonu C (4). Modifikace, jako je hydroxylace C-11/methylové skupiny jako u ehretichinonu B (3), vedla ke ztrátě aktivity. Kromě toho srovnání ehretichinonu (2) a ehretichinonu C(4) s lepší aktivitou než u allomikrofylonu (1) a ehretichinonu D (5) ukázalo, že přítomnost exomethylenové skupiny na C-9' hrála důležitou roli. roli v anti-aging aktivitě těchto molekul. Ehretichinon C(4) vykazoval lepší aktivitu proti stárnutí než resveratrol, protože střední hodnota životnosti 4 při 1 uMis byla srovnatelná s resveratrolem při 10 uM, který vykazoval stejnou hodnotu.cistanche tubulosa dávkování redditProto lze ehretichinon C(4) považovat za slibnou hlavní sloučeninu a jeho mechanismus účinku proti stárnutí by měl být dále intenzivně studován. Kromě toho tyto výsledky také poskytují důležité strukturní informace pro návrh a syntézu nových léků proti stárnutí. Tato studie přispěje k prevenci a léčbě nemocí souvisejících s věkem. Výsledky také naznačují, že O.bracteatum obohacené o složky proti stárnutí lze použít jako lék nebo jako doplněk stravy.
4. Materiály a metody
4.1.Obecné
Pro měření optické rotace byl použit digitální polarimetr JASCO P{{0}}. Byla použita preparativní vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se systémem vybaveným čerpadly ELITE P-230 a UV detektorem. Hmotnostní spektra s vysokým rozlišením (HR-ESI-TOF-MS) byla získána přesným hmotnostním TOF LC/MS systémem Agilent Technologies 6224A. NMR spektra byla pozorována na spektrometru Bruker AVII-500 a chemické posuny NMR v 5(ppm) byly vztaženy k vrcholům rozpouštědla bc 77,0 a 6H7,26 pro CDCI. Sloupcová chromatografie byla provedena pomocí silikagelu (200-300 mesh, Yantai Chemical Industry Research Institute, Yantai, Čína) nebo reverzní fáze C18 (Octadecylsilyl, ODS) silikagelu (Cosmosil 75C18-OPN, Nacalai Tesque, Kjóto, Japonsko).
4.2. Přírodní materiál
Rostlinný materiál byl zakoupen od Mansehra, Khyber Pakhtunkhwa, Pákistán a identifikovaný jako Onosma bracteatum Wall Dr. Zafarem Ulahem Zafarem, docentem, Institut čisté a aplikované biologie, Bahauddin Zakariya University, Multan, Pákistán. Poukázkový exemplář (20170220) rostliny byl uložen v Institutu Materia Medica, Zhejiang University.
4.3. Extrakce1 a izolace1
Vysušený rostlinný materiál (1,5 kg) byl rozemlet na prášek a extrahován methanolem (CH30H) po dobu 3 dnů za stálého třepání při teplotě místnosti. Získaný surový extrakt (120} g) byl rozdělen mezi ethylacetát (EtOAc) a vodu (H,O). Vzorek aktivní ethylacetátové vrstvy (30} g) byl chromatografován na silikagelové otevřené koloně a eluováno směsí n-hexan/CH,Cl(100:0,80:20, 50:50,0:100) a CH,Cl/CH3OH (98:2,95: 5,90:10 a 0:100). Bylo získáno šest frakcí. Frakce 4 (8 g), která byla eluována CH,Cl,/CH3OH (95:5, 90:10), byla dále zpracována na koloně ODSopen. CH3OH/H,O(40:60,50:50,55:45,60:40,70:30,90:10 a 100:0) byl použit jako rozpouštědlo. Ze sedmi frakcí (Fr.{46} }Fr.7), Fr.{48}}Fr.4, byly dále rozděleny takto:
Fr.4 (500 mg) byl oddělen na silikagelové otevřené koloně a eluován CH2Cl2/CH3OH (100:0, 99:1, 98:2, 97:3,95:5 ,90:10 a 0:100). Bylo získáno devět vzorků (Fr.{19}}Fr.{20}}). Vzorek Fr.{21}} byl dále purifikován pomocí HPLC【C30- UG-5（φ10×250 mm, Nomura Chemical）, mobilní fáze∶ acetonitril (CH3CN)/H2O (40:60), průtok:3 ml/min a detektor:210nm] a poskytla sloučeninu (1) (65 mg, tR =21,2 min).
Fr.3 (113 mg) byl separován pomocí ODS otevřené kolony a eluován CH;OH/H20 (40:60, 45:55,50:50,55:45,60:40,80: 20 a 100:0). Bylo získáno deset frakcí (Fr.{17}}Fr.{18}}) a Fr{19}} byl dále čištěn pomocí HPLC【C30-UG{ {21}}（φ10×250 mm, Nomura Chemical）, mobilní fáze∶methanol (CH3OH)/HO (68:32), průtok: 3 ml/min a detektor:210nm] a poskytla sloučeninu (2) (20 mg, IR =20,3 min).
Fr.2 (450 mg) byl vystaven na silikagelové otevřené koloně a eluován CH2CI2:CH3OH (100:0, 99:1,98: 2,97:3,95:5,90:1{{105}},0:100).Devět byly získány frakce (Fr.{19}}Fr.{20}}) a Fr.{21}}(20 mg) byly podrobeny chromatografii na otevřené koloně ODS s CH3OH/H2O(30:70, 32:68,35:65,40:60 a 100∶O） a pátý zlomek （ 6,5 mg） bylo purifikováno pomocí HPLC 【C30-UG-5(φ10×250 mm, Nomura Chemical), mobilní fáze:acetonitril(CH3CN)/H,O(35:65), průtok: 3 ml/min, a detektor:210 nm], čímž se získá sloučenina (3) (3,5 mg, t=31,0). Fr.{50}}(70 mg) bylo separováno na otevřené koloně ODS za použití CH3OH/H20 (25:75,27:73,30:70, 32:68,34:66,36:64,40:60 a 100:0) a sedmá frakce （11 mg） byla purifikována pomocí HPLC 【C30-UG-5(φ10×250 mm, Nomura Chemical）, mobilní fáze∶acetonitril (CH,CN)/HO (32:68), průtok: 3 ml/min a detektor: 210 nm], čímž se získá sloučenina (4) (2,1 mg, tg=43.3).Fr.2-8(75 mg ) byla separována na ODS otevřené koloně za použití CH3OH/H20 (20:80, 22:78,24:76,25:75,26:74, 30:Z0,35:65,40:60 a 100:0) a sedmá frakce (10 mg) byla přečištěna pomocí HPLC 【C30-UG-5 （φ10×250 mm, Nomura Chemical）,mobilní fáze∶ acetonitril（CH3CN）/H2O (30:70), průtok: 3 ml/min a detektor : 210 nml k získání sloučeniny (5) (4,3 mg, tn=22.3). Allomicrophyllon (1). Žlutý prášek; []6 plus 0,02 (c 0,57, CHC13); ESI-TOF-MS s vysokým rozlišením m/z 389,1359, vypočteno pro C2H22O5Na（M plus Na） plus 389,1359;'H NMR（500 MHz- (CDC13）{1μ13） }},83 （1H,dI=10,5 Hz,H-5^),6,61(1H,d,J=8,6 Hz,H-6), 6,56(1H,d, J=2,8Hz,H-3), 6,51(1H, dd, J=2,8, 8,6 Hz,H-5),6,51 (1H,d, J=10,5 Hz, H-6'),5,76(1H, d,J=15,9 Hz,H-8'),5,67 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7),5,65(1H,d,J=7,1Hz,H-8), 3,77(1H, d,J=7,1Hz,H-7),2,73(1H,d, J=19,2Hz,Hb-10),2,50 (1H,d,J{ {206}},2 Hz,Ha-10),1,69 (3H,s,H-11),1,22(6H,s,H-10'& H-11 ');13CNMR(125 MHz,CDC13):6c=195,8(C-1'),193,1(C-4'),150,0(C-4), 145,0(C-1),143,3(C-8'),139,4(C-5'),138,6(C-6'),131,8(C{{245} }), 127,7(C-2), 122,5(C-8), 122,0(C-7'), 117,6(C-6), 114,9(C{{260 }}),114,4(C-3),80,7(C-3'),71,0(C-9),54,9 (C-2'),39,1(C{ {275}}), 36,2(C-10),29,8(C-10'),29,8(C-11'),22,6(C-11). Struktura re byl identifikován porovnáním spekter MS, 'H NMR a13C NMR a také specifickou rotací s literaturou [17,18]. Ehretichinon (2). Červený prášek;[]16 plus 1,01 (c 0,12, CH30H); ESI-TOF-MS s vysokým rozlišením m/z 371,1254, vypočteno pro C2.H20OANa（M plus Na） plus 371,1252;1H NMR（500MHz, CDC13）∶δμ=6,J{309}},83 (1H{d, 312}},5Hz,H-5'),6,62(1H,d, J=8,6Hz,H-6),6,58(1H,d,J=2 ,2 Hz,H-3),6,53(1H,m,H-5), 6,52(1H,d, J=10,5 Hz,H-6') ,6,25(1H,d,J=16.0Hz,H-8),5,65(1H,d,J=6,2Hz,H-8),5,50(1H ,d, J=16,0Hz,H-7),5,04(1H,s,Hb-10),4,97(1H,s,Ha-10'),3,83 (1H,d, J=6,2Hz,H-7),2,78(1H,d, I=19,1Hz,Hb-10),2,52(1H,d ,J=19,1 Hz,Ha-10),1,73(3H,s,H-11'),1,70(3H,s,H-11);13CNMR ( 125MHz,CDCI):6c=195,4(C-1),193,2(C-4),150,0(C-4),145,1(C-1 ),140,8(C-9),139,2(C-5),138,8 (C-6'),137,5(C-8'),131,9(C{{418 }}),127,7(C-2),124,1(C-7'),122,7(C-8),119,3(C-10'),117,6(C{ {433}}),114,9 (C-5),114,4(C-3),80,7(C-3'),55,3(C-2'),39,4( C-7),36,3(C-10),22,7(C-11),18,3(C-11). Struktura byla identifikována porovnáním MS,'H NMR a 13C NMR spekter a také specifická rotace s literaturou [19].
Ehretichinon B (3).Červený prášek; [ |6 plus 0,99(c 0,31, CH3OH); ESI-TOF-MS s vysokým rozlišením m/z 387,1208, vypočteno pro C22H20OsNa (M plus Na) plus 387,1203; Data pro1H NMR a13C NMR jsou popsána v tabulkách 1 a 2, v daném pořadí.
Ehretichinon C(4). Červený prášek; [ ] 16 plus 0,37 (c 0,12, CH,OH); ESI-TOF-MS s vysokým rozlišením m/z 387,1174, vypočteno pro C2H200;Na (M plus Na) plus 387,1174; Data pro1H NMR a13C NMR jsou popsána v tabulkách 1 a 2, v daném pořadí.
Ehretichinon D (5). Žlutý prášek; [ 15 plus 0.51(c 0.41, CHCI3); ESI-TOF-MS s vysokým rozlišením m/z 405,1300, vypočteno pro C2,H,O,Na (M plus Na) plus 405,1300; Údaje pro HNMR a 13CNMR jsou popsány v tabulkách 1 a 2, v tomto pořadí.
4.4. Životnost podle odhadu/
Metoda biotestu použitá pro studii proti stárnutí byla popsána dříve [4]. Kvasinkový kmen K6001 byl kultivován na YPGalaktózovém nebo YPGlukózovém médiu. YPGalaktózové médium bylo připraveno s 3 procenty galaktózy, 2 procenty hipypeptonu a 1 procentem kvasinkového extraktu, zatímco YPGlukózové médium obsahovalo 2 procenta glukózy místo galaktózy.cistanche แอ ม เว ย์Pro přípravu agarových ploten byla do média přidána 2 procenta agaru. Pro vyhodnocení vzorků pomocí biologického testu byl kmen kvasinek K6001 naočkován a inkubován po dobu 24 hodin v médiu s kvasinkovou pepton galaktózou za třepání. Po 24 hodinách bylo médium obsahující kvasinkový kmen odstředěno. Výsledné kvasinkové pelety byly třikrát promyty roztokem fosfátového pufru (PBS) a zředěny. Po zředění byly buňky vypočítány pomocí hemocytometru a přibližně 4000 buněk bylo naočkováno na agarové plotny obsahující vzorky o různých koncentracích. Poté byly destičky umístěny do inkubátoru při 28 stupních po dobu 2 dnů. Kvasinkové buňky na agarové plotně byly pozorovány pod mikroskopem po 48 hodinách. Celkem bylo náhodně vybráno 40 mikrokolonií z každé destičky a byl spočítán a analyzován počet dceřiných buněk.
4.5. Statistická analýza
Významné rozdíly mezi skupinami byly stanoveny jednocestnou ANOVA s Dunnettovým vícenásobným srovnávacím testem. Byl použit software GraphPad Prism 5.0. Hodnota Ap<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. Závěry
Tři nové a dva známé benzochinony byly izolovány a charakterizovány z O. bracteatum pod vedením K6001 kvasinkového replikativního testu životnosti. Struktura nových benzochinonů (3-5) byla objasněna spektroskopickou analýzou a známé (1-2) byly identifikovány porovnáním spektroskopických dat s údaji v literatuře. Všechny izolované benzochinony byly hodnoceny na aktivitu proti stárnutí pomocí kvasinkového replikačního testu životnosti a 1, 2, 4 a 5 vykazovaly významnou aktivitu proti stárnutí.kolik cistanche vzítEhretichinon C(4) vykazoval nejslibnější anti-aging aktivitu, a lze jej tedy považovat za potenciální hlavní sloučeninu. Jeho mechanismus proti stárnutí by měl být dále studován.
Doplňkové materiály:1D a 2D NMR spektra jsou dostupná online na http://www.mdpi.com/1420-3049/24/7/1428/s1.
Příspěvky autora:UF provedl chemickou studii a navrhl rukopis. YP provedl replikativní testy životnosti. DD se podílel na identifikaci sloučenin. JQ navrhl a dohlížel na tuto studii a revidoval rukopis.
Financování:Tato práce byla finančně podpořena Národním klíčovým programem výzkumu a vývoje Číny [č. 2017YFE0117200] a NSFC [č. grantu 21661140001, 21877098 a 21572204].
Poděkování:Jsme vděčni Michaelu Breitenbachovi ze Salcburské univerzity v Rakousku za dar kvasinkového kmene S. cerevisiae K6001. UF také oceňuje podporu doktorského studia ze strany Komise pro vysoké školství Pákistán.
Střet zájmů:Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Tento článek je převzat z Molecules 2019, 24, 1428; doi:10.3390/molecules24071428 www.mdpi.com/journal/molecules
