Norwogonin zmírňuje hypoxií indukovaný oxidační stres a apoptózu v buňkách PC12

Další informace:{0}}

Abstraktní

Pozadí: Norwogonin je přírodní flavon se třemi fenolickými hydroxylovými skupinami ve struktuře skeletu a má vynikajícíantioxidační aktivitu. Neuroprotektivní účinek norwogoninu však zůstává nejasný. Zde jsme zkoumali ochrannou kapacitu norwogoninu proti oxidativnímu poškození vyvolanému hypoxií v buňkách PC12. Metody: Životaschopnost buněk a apoptóza byly zkoumány testem MTT a barvením Annexin V-FITC/PI, v daném pořadí. Obsah reaktivních forem kyslíku (ROS) byl měřen pomocí testu DCFH-DA. Laktátdehydrogenáza (LDH), malondialdehyd (MDA) aantioxidační enzymhladiny byly stanoveny pomocí komerčních souprav. Exprese příbuzných genů a proteinů byla měřena kvantitativní PCR v reálném čase a Western blottingem. Výsledky: Zjistili jsme, že norwogonin zmírnil poškození vyvolané hypoxií u buněk PC12 zvýšením životaschopnosti buněk, snížením uvolňování LDH a zlepšením změn v morfologii buněk. Norwogonin také působil jako anantioxidantntvychytáváním ROS, snížením produkce MDA, zachováním aktivit superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT) a glutathionperoxidázy (GPx) a snížením úrovní exprese HIF-1 a VEGF. Kromě toho wogonin zabránil apoptóze buněk prostřednictvím inhibice úrovní exprese kaspázy-3, cytochromu c a Bax a zároveň zvýšil úrovně exprese Bcl-2 a poměr Bcl-2/Bax. Závěry: Norwogonin zmírňuje hypoxií indukované poškození v buňkách PC12 zhášením ROS, udržováním aktivity antioxidačních enzymů a inhibicí mitochondriální apoptózy.

Klíčová slova: Norwogonin,Antioxidační aktivita, hypoxie, oxidační stres,Apoptóza

Pozadí

Aerobní organismy potřebují k výrobě energie kyslík (O2). Hypoxie je definována jako nedostatečný přísun O2 k udržení buněčné funkce ve tkáni a často se vyskytuje v některých fyziologických situacích, jako je vysoká nadmořská výška [1], a v mnoha patologických situacích, jako je mrtvice [2]. Mozek je zvláště citlivý na poškození způsobené hypoxií kvůli vysoké spotřebě kyslíku, bohatému na nenasycené mastné kyseliny a nízkéantioxidační kapacita[3]. Stále více důkazů ukazuje, že hypoxie může vyvolat nepříznivé účinky na mozek [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia a Huiping Ma

Department of Pharmacy, 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA, Lanzhou 730050, Gansu, China

Oxidační stres a apoptóza jsou považovány za dva faktory přispívající k poškození způsobenému hypoxií [7, 8]. Bylo hlášeno, že expozice hypoxii zvyšuje produkci intracelulárních reaktivních forem kyslíku (ROS), což usnadňuje oxidační stres. Nadměrné ROS, jako je superoxidový anion (O2−˙), peroxid vodíku (H2O2) a hydroxylový radikál (HO•), vede ke strukturálním a funkčním buněčným změnám napadením lipidů, membrán, proteinů a DNA a následně způsobuje poškození buněk [ 9].

Klikněte pro cistanche NZ pro antioxidant

Současně nadprodukovaný ROS také usnadňuje otevření mitochondriálního permeabilního přechodového póru (mPTP) [10] a přenos proapoptózních proteinů na vnější mitochondriální membránu, což indukuje depolarizaci mitochondriálních membrán a uvolňování cytochromu c [11]. Tyto změny nakonec způsobují mitochondriálně závislou apoptózu [12]. Předpokládá se tedy, že antioxidanty se schopností inhibovat nebo eliminovat nadměrné ROS mohou uplatnit svůj ochranný účinek prostřednictvím zmírnění oxidačního stresu a apoptózy vyvolané hypoxií. Mnoho studií prokázalo, že antioxidační doplňky, jako je vitamín C [13], isoflavon [8] a nitroxidové radikály [14], mohou omezit poškození způsobené hypoxií in vitro a in vivo. Flavonoidy jsou velkou a různorodou třídou všudypřítomných rostlinných sekundárních metabolitů. Jsou vždy považovány za vynikající přírodní antioxidant se schopností vychytávat volné radikály a inhibovat peroxidaci lipidů.

V současné době se této třídě sloučenin věnuje stále více pozornosti kvůli jejich příznivým účinkům na lidské zdraví. Bylo prokázáno, že flavonoidy mají širokou škálu farmakologických účinků, jako je protizánětlivá, antinociceptivní a neuroprotektivní aktivita atd., z nichž všechny lze přičíst jejich antioxidačním aktivitám [15]. Mnoho studií ukázalo, že flavonoidy vykazují vynikající ochranné účinky na selhání vyvolané hypoxií. Rutin má například silný neuroprotektivní účinek proti smrti gangliových buněk sítnice vyvolané hypoxií [16]. Nedávná studie také ukazuje, že rutin může zmírnit poškození způsobené hypoxií způsobenou chloridem kobaltnatým inhibicí oxidačního stresu a apoptózy v buňkách H9c2 [17]. Liu et al navíc naznačují, že nobiletin (3′,4′,5,6, 7,8-hexamethoxyflavon) zmírňuje I/R poškození myokardu aktivací Akt/GSK-3 dráhy v buňce H9c2 [18]. Acacetin navíc může chránit potkaní kardiomyocyty a kardiomyoblasty H9C2 před poškozením vyvolaným hypoxií/reoxygenací prostřednictvím aktivace signální dráhy Nrf2 zprostředkované AMPK [19].

Norwogonin (5,7,8-trihydroxyflavon, obr. 1) je farmakologicky aktivní flavon oddělený od kořene Scutellaria baicalensis Georgi (čínsky „Huang Qin“), tradiční čínské byliny používané k léčbě chřipky a rakoviny [20, 21]. Byly však hlášeny omezené studie o biologických aktivitách norwogoninu kvůli jeho nízkým hladinám v přírodních rostlinách. K vyřešení tohoto problému je popsáno několik metod syntézy norwogoninu [22, 23].

Naše předchozí studie také stanovila jednoduchou metodu pro získání norwogoninu z chrysinu ve čtyřech krocích [24]. Tyto výzkumy pozitivně ovlivnily další hodnocení biologických aktivit norwogoninu. Studie odhalily, že norwogonin má antioxidační [25], protirakovinné [26, 27], antivirové [28] a antimikrobiální účinky [29] a také inhibuje kyanidem stimulovanou produkci ROS [30]. Nicméně, zda má norwogonin ochranné schopnosti proti poškození způsobenému hypoxií, zůstává neznámé. Cílem této studie bylo prozkoumat ochranné účinky norwogoninu proti hypoxií indukovanému oxidativnímu stresu a apoptóze v buňkách PC12.

Metody

Materiály a činidla

Norwogonin (čistota větší nebo rovna 98 procentům) byl syntetizován podle dříve popsané metody [24]. Rutin (čistota větší nebo rovna 96 procentům) byl zakoupen od Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Čína). Norwogonin a rutin byly rozpuštěny ve sterilním dimethylsulfoxidu (DMSO), skladovány při -20 stupních a bezprostředně před použitím zředěny v buněčném kultivačním médiu. Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), fetální bovinní sérum (FBS), streptomycin a penicilin byly zakoupeny od Solarbio co., Ltd. (Peking, Čína).

Soupravy malondialdehydu (MDA), laktátdehydrogenázy (LDH), superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT) a glutathionperoxidázy (GPx) byly získány od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Čína). 2',7′-dichlorid-hydrofluorescein diacetát (DCFH-DA) a (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazolium bromid) tetrazolium (MTT) byl získán od Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Primární protilátky pro hypoxií indukovatelný faktor-1 (HIF-1), vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), B buněčný lymfom-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} asociovaný protein X (Bax), kaspáza-3, cytochrom C a -aktin byly zakoupeny od společnosti Abcam (Cambridge, Spojené království). Sekundární protilátky byly získány od společnosti ZsBio Company (Peking, Čína).

Souprava pro analýzu apoptózy byla získána od Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Čína). Všechny chemikálie a rozpouštědla byly analytické kvality a byly získány od komerčního dodavatele v Číně. Buněčná kultura Buňky PC12 byly zakoupeny od Cell Bank Čínské akademie věd (TCR 9, Shanghai, Čína) a udržovány v DMEM s 10 procenty (obj./obj.) FBS, 100 U/ml penicilinu a 100 U/ml streptomycinů. při 37 stupních ve zvlhčeném inkubátoru obsahujícím 5 procent CO2. Pro hodnocení cytotoxicity norwogoninu byly buňky PC12 (pasáž 4 ~ 6) preinkubovány s různými koncentracemi (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 mol/l) norwogoninu pro 1 h a poté kultivace po dobu 24 h. Vystavení hypoxii Pro indukci modelu poškození buněk hypoxií byly buňky PC12 vystaveny hypoxickému prostředí (1 procento O2, 5 procent CO2 a 94 procent N2) při 37 stupních po dobu 24 hodin ve zvlhčené komoře. Normoxické kontrolní buňky byly kultivovány při 37 stupních v inkubátoru s 5% CO2 po dobu 24 hodin.

K vyhodnocení ochranného účinku norwogoninu proti poškození způsobenému hypoxií byly buňky PC12 preinkubovány s různými koncentracemi (10−8, 10−7, 10−6, 10−5 mol/ L) norwogoninu po dobu 1 hodiny před léčbou hypoxie. Životaschopnost buněk Životaschopnost buněk byla měřena testem MTT, jak bylo popsáno dříve [31]. Stručně řečeno, buňky PC12 (1 x 105 buněk/ml) byly nasazeny na 96jamkové kultivační destičky. Poté byly do jamek přidány různé koncentrace norwogoninu. Do kontrolních jamek byl přidán stejný objem DMSO. Konečná koncentrace DMSO v buněčném kultivačním médiu je 0,1 procenta. Po inkubaci za normoxických nebo hypoxických podmínek bylo do každé jamky přidáno 10 μl MTT (5,0 mg/ml) a následovala inkubace při 37 stupních po dobu 4 hodin. Poté byl supernatant s MTT odstraněn a formazanový produkt byl rozpuštěn ve 100 ul DMSO. Absorbance byla měřena na čtečce mikrodestiček SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) při 570 nm. Výsledky byly vyjádřeny jako relativní procento kontrolní skupiny. Hematoxylinem a eosinem (HE) barvené buňky PC12 nasazené na skleněná krycí sklíčka byly inkubovány po dobu 24 hodin, než byly ošetřeny norwogoninem stejným způsobem, jak je popsáno výše.

Médium bylo odstraněno a skleněná krycí sklíčka byla promyta studeným PBS, následovala fixace methanolem po dobu 10 minut při teplotě místnosti a poté třikrát promyta studeným PBS po dobu 5 minut. Nakonec byly buňky obarveny podle protokolu barvení HE [32]. Analýzy buňky byly provedeny pomocí mikroskopu OLYMPUS IX73 (100×) za účelem ověření morfologických změn buněk. Digitální snímky byly získány pomocí digitálního fotoaparátu DXM 1200 C (Nikon) spojeného s mikroskopem. Obsah ROS Intracelulární hladina ROS v buňkách PC12 byla stanovena pomocí testu DCFH-DA [33]. Stručně, buňky PC12 (1 x 105 buněk/ml) byly nasazeny na 6-jamkové destičky. Po ošetření hypoxií byly buňky PC12 promyty PBS a poté byly inkubovány v kultivačním médiu obsahujícím 10 uM DCFH-DA po dobu 30 minut ve tmě při 37 stupních. Buňky byly pozorovány invertovaným fluorescenčním mikroskopem Olympus (Tokio, Japonsko) a analyzovány průtokovým cytometrem Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) s vlnovou délkou excitace 488 nm a vlnovou délkou emise 525 nm. Hladina ROS byla vyjádřena jako relativní procento kontroly. Únik LDH, obsah MDA a antioxidační enzymová aktivita Buňky PC12 (1 x 105 buněk/ml) byly naočkovány do misky o průměru 90 mm. Po ošetření hypoxie, jak je popsáno výše, bylo odebráno 50 ul supernatantu kultury z každé misky a aktivita LDH v médiu byla detekována pomocí komerčních testovacích souprav (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Čína) a byla vyjádřena jako U/ml. Buňky PC12 byly sklizeny a homogenizovány po dvojnásobném promytí studeným PBS. Koncentrace celkového proteinu byla měřena soupravou pro stanovení BCA proteinu. Obsah MDA a antioxidační enzymová aktivita byly stanoveny pomocí komerčních testovacích souprav (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Čína).

Obsah MDA byl prezentován jako nmol/mg proteinu. Aktivity SOD, CAT a GPx byly prezentovány jako U/mg proteinu. Apoptóza buněk (barvení Annexin-V/PI) Po ošetření hypoxií byly buňky PC12 sklizeny, dvakrát promyty studeným PBS a poté suspendovány ve vazebném pufru. Buňky byly ošetřeny roztokem Annexin V-FITC a PI podle protokolu výrobce (Beyotime, Shanghai, Čína). Sběr dat byl prováděn pomocí průtokového cytometru Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA). Kvantitativní analýza PCR v reálném čase Celková RNA buněk PC12 byla extrahována pomocí činidla Trizol (Takara, Dalian, Čína) a převedena na cDNA pomocí soupravy činidel PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, Čína). cDNA kódující HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, kaspázu-3, cytochrom C a gen glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) byl amplifikován kvantitativním reálným time PCR s použitím detekčního systému 7300 v reálném čase (Applied Biosystems, CA, USA). Použité primery jsou uvedeny v tabulce 1. Podmínky cyklování PCR byly 95 stupňů po dobu 30 s, následovalo 40 cyklů 95 stupňů po dobu 5 s a 60 stupňů po dobu 31 s. Hladiny mRNA byly vypočteny pomocí 2-ΔACt metody a normalizovány na GAPDH, což je referenční gen. Western blot PC12 buňky byly sklizeny a homogenizovány v RIPA činidlech. Koncentrace celkových proteinů byla kvantifikována pomocí soupravy pro stanovení proteinů BCA. 30 ug vzorků bylo rozděleno na 12% SDS-PAGE elektroforézu a poté přeneseno na polyvinylidenfluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Billerica, MA, USA).

Membrány byly blokovány 5% odtučněným sušeným mlékem v TBST pufru po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a inkubovány s primárními protilátkami: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Spojené království), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, Spojené království), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, Spojené království), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Spojené království), anti kaspáza{21}} (1:300, ab44976, Abcam, Spojené království), anti cytochrom C (1:1000, ab13575, Abcam, Spojené království) a anti{28}}aktin (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) při 4 stupních přes noc. Poté byly membrány promyty a inkubovány se sekundárními protilátkami (1:2000, ZsBio, Peking, Čína;) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány pomocí činidel se zesílenou chemiluminiscencí (ECL). Relativní intenzity pásů byly normalizovány k vnitřní kontrole -aktinu a analyzovány pomocí Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Statistická analýza

Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SD odvozený z alespoň tří nezávislých experimentů. Rozdíl mezi skupinami byl analyzován pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA) následované Student-Newman-Keulsovým post hoc testem. P-hodnota < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">

Výsledek

Norwogoninové ochranné buňky PC12 proti poškození vyvolanému hypoxií

Za prvé, aby se zabránilo proliferativní aktivitě norwogoninu, byla stanovena jeho cytotoxicita na normální buňky PC12 pomocí testu MTT. Jak je vidět na obr. 2a, buněčná proliferace se významně nezměnila po léčbě norwogoninem v koncentracích 1 × 10- 8 -1 × 10-5 mol/l (P > 0,05 ). Životaschopnost buněk se však významně snížila, když byla koncentrace norwogoninu zvýšena na 1 × 10− 4 mol/l (P < 0,05).="" výsledky="" ukázaly,="" že="" norwogonin="" nevykazoval="" toxicitu="" ani="" proliferační="" aktivitu="" na="" buňkách="" pc12="" v="" koncentracích="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Poté jsme zkoumali ochranný účinek norwogoninu proti poškození buněk PC12 vyvolanému hypoxií. Jak je znázorněno na obr. 2b, ve srovnání s kontrolní skupinou byla životaschopnost buněk ve skupině s hypoxií snížena na 58,71 procent (P < 0.01).="" ve="" srovnání="" s="" léčbou="" hypoxie,="" předem="" ošetřené="" 1="" ×="" 10−8,="" 1×10−7="" a="" 1×10−6="" mol/l="" norwogoninem="" chráněným="" pc12="" v="" závislosti="" na="" dávce="" buňky="" proti="" poškození="" vyvolanému="" hypoxií,="" obnovující="" životaschopnost="" buněk="" z="" 58,71="" na="" 62,79="" procent="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" procent="" (p="">< 0,01)="" a="" 69,88="" procent="" (p="">< 0,01),="" v="" daném="" pořadí.="" předléčení="" rutinem="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" také="" vykazovalo="" ochranný="" účinek,="" významně="" zvýšilo="" životaschopnost="" buněk="" na="" 63,78="" procenta="" ve="" srovnání="" s="" léčbou="" hypoxie.="" životaschopnost="" předem="" ošetřená="" 1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" norwogoninu="" byla="" snížena="" na="" 63,43="" procenta,="" což="" je="" stále="" významně="" vyšší="" hodnota="" než="" ve="" skupině="" s="" hypoxií="" (p="">< 0,05).="" tyto="" výsledky="" ukázaly,="" že="" norwogonin="" vykazoval="" významnou="" cytoprotekci="" v="" koncentracích="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" a="" nejúčinnější="" koncentrace="" je="" 1="" x="" 10−="" 6="" mol/l.="" poté="" byla="" tato="" dávka="" použita="" jako="" optimální="" dávka="" v="" následujících="">

Ochranná kapacita norwogoninu byla ověřena také morfologickými změnami. Jak je znázorněno na obr. 2c, buňky PC12 bez ošetření hypoxií dobře rostly s pravidelnými tvary (vřetenovitými), jednotnými velikostmi. Po vystavení hypoxii buňky PC12 vykazovaly smrštění, zaoblený tvar, deskvamaci a sníženou hustotu buněk. Buňky předem ošetřené norwogoninem nebo rutinem před vystavením hypoxii lépe rostly, počet deskvamačních buněk se snížil a tvar buněk se obnovil normálně. Kromě toho byla ochranná schopnost norwogoninu potvrzena únikem LDH, který je spojen se ztrátou integrity buněčné membrány. Jak je znázorněno na obr. 2d, aktivita LDH v kultivačním médiu byla výrazně zvýšena po vystavení hypoxii (P <>

Předběžné ošetření norwogoninem nebo rutinem dramaticky snížilo únik LDH, což naznačuje, že norwogonin a rutin obnovily integritu buněčné membrány. Norwogonin inhibuje oxidační stres vyvolaný hypoxií v buňkách PC12 ROS a MDA jsou dva důležité indikátory buněčného oxidačního stresu vyvolaného hypoxií. Jak je znázorněno na obr. 3a a b, po expozici hypoxii byl v buňkách PC12 pozorován významně zvýšený obsah ROS a MDA. Předběžná léčba norwogoninem nebo rutinem významně inhibovala produkci ROS a MDA.

Antioxidační enzymy, jako je SOD, CAT a GPx, jsou považovány za hlavní obranný systém proti oxidativnímu stresu v buňkách. Jak je znázorněno na obr. 3c-e, vystavení hypoxii významně inhibovalo aktivity SOD, CAT a GPx v buňkách PC12. Léčba norwogoninem nebo rutinem tyto změny zvrátila a obnovila činnost antioxidačních enzymů. Všechny tyto výsledky ukázaly, že norwogonin chránil buňky PC12 proti oxidativnímu stresu vyvolanému hypoxií.