Metabolomická analýza založená na NMR pro účinky suplementace -ketoglutarátem na myoblasty C2C12 v různých energetických stavech

Kliknutím sem získáte doplňky proti stárnutí a únavě Cistanche

1. Úvod

Kosterní sval je největším orgánem v lidském těle a udržuje normální životní aktivity.Prodloužený cvičební tréninknebo patologiel procesy chorob vyvolávají poškození svalůnebonedostatečné zásobení svalů energií, v této době je zvláště důležitá obnova svalové síly a funkce. K podpoře hypertrofie kosterního svalstva a zvýšení sportovního výkonu se používají různé doplňky výživy [1]. -Ketoglutarát (AKG) jako průsečík metabolismu organického uhlíku a dusíku a současně kritický meziprodukt v cyklu TCA prokázal pleiotropní účinky na zlepšení svalové výkonnosti v klinických experimentech a experimentech na zvířatech [2–9]. Například AKG může snížit poškození střevní sliznice [8] a zánět [9], zmírnitrozvoj kolorektálního karcinomu[4] a jaterní fibróza [5], podporují růst [6] a snižují morbiditu aoddálit stárnutí[7]. Předchozí práce prokázaly, že suplementace AKG může zmírnit svalovou ztrátu parenterálním podáním v modelu traumatu pacientů podstupujících totální náhradu kyčelního kloubu [2] a podpořit svalovou hypertrofii a syntézu proteinů prostřednictvím signálních drah Akt/mTOR [10,11]. V případě Duchennovy svalové dystrofie může suplementace AKG zabránit svalové atrofii a dysfunkci prostřednictvím dráhy zprostředkované PHD3/ADRB2- [12]. Naše předchozí práce také ukázala, že suplementace AKG může výrazně usnadnit proliferaci myoblastů C2C12 a zmírnit atrofii myotubulů C2C12 kultivovaných v médiu bez glukózy [13]. Vzhledem k tomu, že glukóza je hlavním zdrojem energie pro udržení normálních fyziologických funkcí kosterního svalstva, účinky suplementace AKG na zlepšení svalového výkonu jsou značně závislé na hladině glukózy v kosterním svalu. Rozdíly v účincích vyvolaných AKG v kosterním svalstvu mezi různými energetickými stavy jsou nejasné.

AKG se podílí na syntéze aminokyselin, vitamínů aorganické kyselinyaenergetický metabolismusv těle, což zahrnuje přeměnu AKG na glutamát pomocí glutamátdehydrogenázy a následnou amidaci glutamátu amoniakem pomocí glutaminsyntetázy. AKG poskytuje energii pro růst buněk prostřednictvím cyklu TCA a oxidativní fosforylace a podporuje buněčný metabolismus a signalizaci interakcí s jeho receptorem OXGR (receptor spřažený s G proteinem) na buněčné membráně [14,15]. Kromě toho může AKG regulovat mitochondriální oxidativní metabolismus a podporovat permisivní epigenetický stav zprostředkováním časného přechodu embryonálního buněčného stavu a vývoje zárodečných buněk [16]. Cvičením indukovaný AKG navíc může stimulovat svůj receptor OXGR1 v nadledvinách, aby řídil termogenezi a rozklad triglyceridů v tukové tkáni a měl příznivé účinky na metabolismus [17].

Bylo však provedeno jen málo studií, které by odhalily AKG-indukované metabolické změny kosterního svalstva v různých energetických stavech a základní metabolické mechanismy. Nedávno byla metabolomická analýza použita k systematickému objasnění molekulárních mechanismů, které jsou základem prospěšných účinků nutričních doplňků. Střídání metabolitů působících jako následné produkty genové transkripce může intuitivně odrážet celkové metabolické změny. Jako zvláště vhodné techniky pro kvantitativní detekci změn hladin metabolitů v biologických tekutinách, tkáních a buňkách se v metabolomických analýzách široce používá 1H nukleární magnetická rezonanční (NMR) spektroskopie s vysokým rozlišením. Je významné, že metabolomické profilování založené na NMR má několik výhod, jako je vysoká reprodukovatelnost, kvantitativní měření bez předsudků a pohodlná příprava vzorku [18,19]. Dříve jsme prováděli metabolomické analýzy založené na NMR, abychom objasnili jak účinky suplementace kreatinem na myoblasty C2C12 [20], tak účinky suplementace alanyl-glutaminu na myoblasty poškozené energetickou deprivací [21].

2. Výsledky

2.1. Proliferace a diferenciace myoblastů C2C12 se suplementací AKG

Myoblastové buňky C2C12 kultivované v normálním růstovém médiu s a bez suplementace AKG byly seskupeny jako Nor-A a Nor, zatímco buňky v nízkoglukózovém růstovém médiu s nebo bez suplementace AKG byly seskupeny jako Low-A a Low. V souladu s předchozí studií [10] vykazovaly Nor-A buňky s AKG suplementací v koncentraci 2 mm významně zvýšenou životaschopnost buněk ve srovnání s Nor buňkami (obrázek S1).

Proto byla v experimentech použita koncentrace AKG 2 mm pro hodnocení změn v proliferaci a diferenciaci myoblastů vyvolaných AKG. Ve srovnání s buňkami Nor vykazovaly nízké buňky výrazně sníženou rychlost proliferace v důsledku nedostatku energie (obrázek 1A). I když suplementace AKG nezpůsobila významně odlišnou morfologii myoblastů ve dvou energetických stavech, nejen zvýšila rychlost proliferace buněk Low kultivovaných v médiu s nízkým obsahem glukózy, ale také zvýšila rychlost proliferace buněk Nor kultivovaných v normálním médiu v souladu s předchozí studie [10,12]. Počet buněk na danou oblast byl spočítán pro čtyři skupiny myoblastů (n=4 pro skupinu): Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Nízká, 493,8 ± 14,5; Nízká A, 547,0 ± 11,7 (obrázek 1B). Stojí za zmínku, že buňky Low-A nevykazovaly statisticky odlišné počty buněk od buněk Nor, což naznačuje, že suplementace AKG by mohla obnovit počty buněk pro myoblasty za podmínek kultivace s nízkým obsahem glukózy (obrázek 1B).

Obrázek 1, Schopnosti proliferace a diferenciace myoblastů C2C12 za podmínek normální kultury a nízké. glukózová kultura. (A) Morfologie myoblastů. (B) Čísla buněk odpovídající panelu A (n=4). (C) Životaschopnost buněk vzhledem k buňkám Nor analyzovaná testem proliferace buněk MTS (n=5). (D) Exprese MyoD1 v myoblastech analyzované pomocí western blotu. Anti-GAPDH protilátka byla použita ke standardizaci množství proteinu v každé dráze. (E) Statistická analýza odpovídající panelům (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Kromě toho byl proveden test MTS, aby se kvantitativně porovnaly rychlosti proliferace čtyř skupin buněk (obrázek 1C). Nízké buňky měly zřetelně sníženou rychlost proliferace ve srovnání s buňkami Nor, což ukazuje, že médium s nízkým obsahem glukózy znevýhodňuje proliferaci buněk. Suplementace AKG významně zvýšila rychlost proliferace buněk Nor-A a Low-A vzhledem k buňkám Nor a Low. Všimněte si, že buňky Low-A vykazovaly proliferační schopnost nižší než buňky Nor, což znamená, že suplementace AKG pouze částečně obnovila proliferaci buněk kultivovaných v médiu s nízkým obsahem glukózy

.Exprese proteinu myogenní diferenciace 1 (MyoD1) se obvykle používá k charakterizaci diferenciační schopnosti buněk. Kvantitativně jsme tedy porovnali exprese MyoD1 mezi čtyřmi skupinami buněk (obrázek 1D). Nízké buňky vykazovaly hluboce sníženou schopnost diferenciace ve srovnání s buňkami Nor. Suplementace AKG významně zvýšila diferenciační schopnosti buněk kultivovaných jak v normálním médiu, tak v médiu s nízkým obsahem glukózy, jak ukazuje přibližně 30procentní zvýšení exprese MyoD1 v buňkách Nor-A a Low-A. Je pozoruhodné, že Low-A buňky nevykazovaly statisticky významně odlišnou expresi MyoD1 od buněk Nor, což naznačuje vysokou účinnost suplementace AKG pro obnovení diferenciační schopnosti buněk kultivovaných v médiu s nízkým obsahem glukózy.

Dále jsme analyzovali diferenciační schopnosti myotube pro čtyři skupiny myoblastů C2C12. Myotuby byly vytvořeny fúzí myoblastů kultivovaných v normálním a nízkoglukózovém diferenciačním médiu s nebo bez suplementace AKG Obrázek S3). Morfologie myotubiček C2C12 ukázala, že kultura s nízkým obsahem glukózy narušila diferenciační schopnost buněk myotube a suplementace AKG by mohla podporovat diferenciaci myotube myoblastů kultivovaných jak v normálním médiu, tak v médiu s nízkou glukózou.

2.2. NMR spektra vodných extraktů myoblastů C2C12

Typická 850 MHz1H NMR spektra byla zaznamenána na vodných extraktech odvozených ze skupin Nor, Nor-A, Low a Low-A myoblastů C2C12 (obrázek 2A). Bylo přiřazeno celkem 34 metabolitů, které jsou shrnuty v tabulce S1. Rezonanční přiřazení metabolitů bylo potvrzeno použitím spekter 2D 1H-13C HSOC a 1H-H TOCSY (obrázky S4 a S5). Vizuální kontrola NMR spekter ukázala, že kultivace myoblastů se suplementací AKG vedla k významné akumulaci intracelulárního AKG v Nor-A a Low-A buňkách (obrázek 2B).

Obrázek 2, Průměrné 850 MHz spektrum 1H nukleární magnetické rezonance (NMR) zaznamenané na vodných extraktech odvozených ze skupin Nor, Nor-A, Low a Low-A myoblastů C2C12. (A) Porovnání průměrných NMR spekter čtyř skupin. Vertikální měřítka byla udržována konstantní ve všech 'H NMR spektrech. Oblast vody (4,2 ppm) byla odstraněna (B) Lokální amplifikované oblasti píku a-ketoglutarátu (AKG). Modrá/zelená/žlutá/červená čára: spektrální oblasti ze skupin Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-ketoglutarát; PC, O-fosfocholin; GPC, sn-glycero-3-fosfocholinUDP-glukóza, uridindifosfát-glukóza: CTP, sn-glycero-3-fosfocholin; NAD plus, nikotinamid adenindinukleotid AXP adenin mono/di/trifosfát.

2.3. Vícerozměrná analýza dat pro zkoumání buněčných metabolických profilů

Dále jsme provedli multivariační analýzu dat na NMR spektrálních datech pro metabolické profilování čtyř skupin C2C12 myoblastů. Nejprve jsme vytvořili tři modely PCA bez dozoru s prvními dvěma složkami (PC1, PC2), abychom získali přehled o trendech seskupování a odhalili metabolické rozdíly mezi skupinami myoblastů. Grafy skóre ThePCA ukazují, že metabolický profil buněk kultivovaných v médiu s nízkým obsahem glukózy se zřetelně odlišoval od profilu kultivovaného v normálním médiu (obrázek 3A) a suplementace AKC významně změnila metabolické vzorce buněk kultivovaných jak v normálním médiu, tak i v médiu s nízkým obsahem glukózy (obrázek 3B,C). Metabolický rozdíl mezi skupinami Nor-A a Nor byl však větší než mezi skupinami Low-A a Low, což znamená, že účinky suplementace AKG na metabolický profil myoblastů jsou značně závislé na energetickém stavu buněk.

Obrázek 3. Multivariační analýzy 'HNMR spekter byly zaznamenány na vodných extraktech odvozených z C2C12 myoblastů ze skupin Nor, Nor-A, Low a Low-A. (AC) PCA skóre grafů skupin Low a Nor, skupin Low-A a Low skupin Nor-A a Nor; (DF) Grafy skóre OPIS-DA pro skupiny Low a Nor (R2: 0,999, 02: 0,996), skupiny Low-A a Low (R2: 0.918: 02: 0.761), skupiny Nor-A a Nor (R2: 0,927: 02: 0,838). Elipsy označují 95procentní hranici spolehlivosti.

Dále jsme vytvořili tři kontrolované modely OPLS-DA pro ilustraci metabolických separací mezi čtyřmi skupinami myoblastů (obrázek 3D-F). Jak se očekávalo, modely OPLSDA maximalizovaly metabolické rozdíly mezi čtyřmi skupinami tím, že vyhradily informace o korelovaných ortogonálních proměnných a odfiltrovaly informace o nekorelovaných ortogonálních proměnných. Dále jsme provedli náhodné permutační testy (n=200), abychom vyhodnotili spolehlivost modelů OPLS-DA (obrázek S6), které ukazují validitu zavedených modelů OPLS-DA.

2.4. Identifikace diferenciálních a důležitých metabolitů

Abychom kvantitativně porovnali hladiny metabolitů mezi čtyřmi skupinami myoblastů C2C12, vypočítali jsme relativní hladiny identifikovaných metabolitů na základě jejich relativních integrálů (tabulka S2). Suplementace AKG dramaticky zvýšila intracelulární hladiny AKG ve skupinách Nor-A a Low-A, ale významně nezměnila hladiny ve skupině Nor a Low. Provedli jsme Studentův t-test k identifikaci rozdílných metabolitů s kritériem p < 0,05 (obrázek 4). Srovnání Nor vs. Low identifikovalo 29 rozdílných metabolitů (obrázek 4A), včetně 18 zesílených metabolitů (leucin, isoleucin, valin, acetát, glutamát, glutamin, methionin, aspartát, lysin, kreatin, PC (O-fosfocholin),taurin, tyrosin fenylalanin, histidin, NAD plus, formiát, AXP) a 11 odmítli Metabo. lites (glutathion, pyroglutamát, fosfokreatin, beta-alanin, GPC, glukóza, glycin, acetát, threonin, GTP, UDP-glukóza). Srovnání Low-A vs. Low-identifikovaných diferenciálních metabolitů (obrázek 4B), včetně 7 zvýšených metabolitů (etanol, AKGbeta-alanin, PC, taurin, glycin a GTP) a 3 snížených metabolitů (glutamin, lysin a myoinositol). Srovnání Nor-A vs. Nor identifikovalo 18 rozdílných metabolitů (obrázek 4C), včetně 6 up-regulovaných metabolitů (AKG, pyroglutamát, glutamin, lysin, glukóza, laktát) a 12 downregulovaných metabolitů (alanin, acetát, glutathion methionin, fosfokreatin, PC, myoinositol, glycin, threonin, GTP, UDP-glukóza a AXP).

Obrázek 4. Relativní intenzity různých metabolitů byly identifikovány z párových srovnání mezi čtyřmi skupinami myoblastů C2C12. (A) Nízká vs. Nor; (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} pro každou skupinu.

Dále jsme použili modely OPLS-DA k identifikaci důležitých metabolitů s kritériem VIP > 1 (obrázek 5). Celkem bylo identifikováno 12, 10 a 10 důležitých metabolitů z OPLS-DA modelů Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low.

Obrázek 5. VIP skóre důležitých metabolitů byla identifikována z párových srovnání mezi čtyřmi skupinami C2C12myoblastů. (A) Nízká vs. Nor; (B) Low-A vs. Low; (C) Nor-A vs. Nor. Červené/modré písmo označuje zvýšené/snížené hladiny metabolitu.

Kombinace identifikovaných důležitých metabolitů a rozdílných metabolitů poskytla charakteristické metabolity (tabulka 1). Párové srovnání Low vs. Nor, Low-A vs. Low a Nor-A vs. Nor identifikovalo 10, 6 a 10 charakteristických metabolitů, v tomto pořadí, což ukazuje, že účinky suplementace AKG na myoblasty byly úzce spojeny s energií stav buněk.

2.5. Identifikace významně změněného metabolismu

Dráhy Provedli jsme analýzu metabolických drah, abychom identifikovali významně změněné metabolické dráhy (významné dráhy) na základě hladin metabolitů identifikovaných z párových srovnání mezi čtyřmi skupinami myoblastů C1C12 (obrázek S7; tabulka 2 a tabulka S3). Analýza Nor vs. Low identifikovala 11 významných drah: (1) metabolismus alaninu, aspartátu a glutamátu; (2) metabolismus glycinu, serinu a threoninu; (3) metabolismus glutathionu; (4) metabolismus D-Glutaminu a D-glutamátu; (5) metabolismus škrobu a sacharózy; (6) metabolismus beta-alaninu; (7) metabolismus taurinu a hypotaurinu; (8) metabolismus fenylalaninu; (9) biosyntéza fenylalaninu, tyrosinu a tryptofanu; (10) metabolismus nikotinátu a nikotinamidu; (11) Metabolismus histidinu. Tato významná dráha byla spojena s energetickým metabolismem, oxidačním stresem a anaplerotickým tokem cyklu TCA.

Analýza Nor-A vs. Nor identifikovala pouze prvních pět významných cest 1–5 s vyloučením dalších šesti cest 6–11. Na rozdíl od toho analýza Low-A vs. Low identifikovala pouze šest významných cest: první čtyři cesty 1–4 sdílené srovnáním Low vs. Nor, Nor-A vs. dvě cesty 6–7 sdílené srovnáním Low vs. Nor. Všimněte si, že suplementace AKG významně nezměnila dráhu 5 (metabolismus škrobu a sacharózy) v buňkách kultivovaných v médiu s nízkým obsahem glukózy, ale interferovala se dvěma dalšími cestami (metabolismus beta-alaninu a metabolismus taurinu a hypotaurinu). Abychom vizualizovali změny v charakteristických metabolitech vyvolané AKG, promítli jsme tyto metabolity do metabolické mapy založené na databázi Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (obrázek 6). KEGG byl široce používán jako jeden z hlavních zdrojů dat pro rekonstrukci metabolických sítí a zdůrazňuje významné metabolické dráhy. Jak změněné charakteristické metabolity, tak významně změněné metabolické dráhy poskytují nový pohled na molekulární mechanismy, které jsou základem účinků suplementace AKG na myoblasty C2C12.