Nové zobrazovací nástroje pro měření počtu nefronů in vivo: Příležitosti pro vývojovou nefrologii

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní

Savecledvinaje složitý orgán, který vyžaduje společnou funkci až milionů nefronů. Počet nefronů je po nefrogenezi během vývoje konstantní a ztráta nefronů v průběhu života může vést k náchylnosti k akutnímu, popř.chronické onemocnění ledvin. Vyvíjejí se nové technologie pro počítání jednotlivých nefronů v ledvinách in vivo. Tento přehled nastiňuje tyto technologie a zdůrazňuje jejich význam pro studie vývoje a onemocnění lidských ledvin.

Kliknutím sem se dozvíte o použití herba cistanches

Úvod

Ledvina savců je komplexní orgán, který se vyvinul tak, aby řídil širokou škálu fyziologických procesů. Tyto procesy zahrnují objem krve, krevní tlak, osmotický tlak, odstraňování odpadu a homeostázu metabolitů. Normální vývoj ledvin vyžaduje reciproční tvorbu ureterického pupenu a metanefrického mezenchymu. Poté následuje iterativní proces větvení a kaskáda signalizace pro udržení obnovitelného fondu progenitorových buněk, které produkují diferencované buňky, které plní různé funkce ledvin.

Trvání a konec nefrogeneze se u různých druhů liší. U lidí a nehumánních primátů nastává narození a konec lidské nefrogeneze v podobných časových bodech; nefrogeneze u lidí končí přibližně ve 35. týdnu těhotenství. Druhy, které přinášejí vrhy potomků, mají často různé období přirozené postnatální nefrogeneze. Liší se počet nefronů podle druhu, kmene,sexa environmentální a genetické faktory? Počet lidských nefronů je velmi variabilní (200,000 až 2,7 milionu) na základě studií při pitvě. Široký rozsah počtu nefronů byl také pozorován při pitvě lidských novorozenců, což naznačuje, že tento rozsah je stanoven během nefrogeneze.

Počet nefronů může určovat náchylnost k četným renálním patologiím a ztráta nefronů může urychlit rozvoj chronického onemocnění ledvin (CKD). Je proto důležité zvážit příčiny nízkého počtu nefronů a jejich ztráty a pochopit, proč u lidí zůstává tak široký rozsah počtu nefronů. Přibývá důkazů, že genetika a epigenetické faktory určované zdravím a výživou matek jsou kritickými determinanty nefrogeneze. Vývoj plodu je omezen energií dostupnou od matky, regulovanou placentární funkcí. Evoluční selekční tlak řízený reprodukční zdatností upřednostnil růst mozku před fetálním a časným postnatálním vývojem ledvin, přičemž více než 50 procent klidové rychlosti metabolismu je přidělováno mozku během prvního roku života. Podvýživa matky, environmentální stres nebo infekce tedy vedou k omezení intrauterinního růstu nebo předčasnému porodu a downregulaci metylace DNA v progenitorových buňkách nefronu. Molekulární mechanismy nezbytné pro vývoj zdravých ledvin byly studovány především na modelech hlodavců. Donedávna však bylo jen málo přímých srovnání mezi vývojem ledvin u hlodavců a u lidí.

Ztráta nefronů je typicky překonána hypertrofií a hyperfiltrací zbývajících nefronů, o čemž svědčí udržení GFR celé ledviny. Hypertrofie je krátkodobá adaptace k udržení metabolické homeostázy během reprodukčních let. Existují však fyzikální omezení adaptivní hypertrofie, omezená povrchovou plochou trubice nezbytnou pro transport a odporem vůči toku vyplývajícím ze zvětšující se délky trubic. Toto omezení je u největších savců (velryb) překonáno zabalením 100 milionů nefronů do malých unipapilárních jednotek, které obsahují krátké tubuly. Po reprodukčních letech zvyšující se buněčné oxidační poškození v důsledku hromadění stresorů (ischémie, hypoxie, infekce) podporuje pokračující úbytek nefronů, který se překrývá se stárnutím, což se odráží v 50% snížení počtu nefronů u normální stárnoucí populace.

Navzdory našemu rostoucímu chápání vývoje ledvin a role gestačního prostředí při ustavování zdraví ledvin nám stále chybí integrovaný pohled na jednotlivé nefrony v kontextu intaktního fungujícího orgánu. Současné neobjektivní metody pro odhad glomerulárních čísel vyžadují destrukci ledvin, což omezuje jejich potenciál v longitudinální analýze a použití in vivo. Vývoj neinvazivních zobrazovacích technik pro sledování počtu funkčních nefronů v průběhu životního cyklu by poskytl klíčové informace pro předpovědi progrese chronického onemocnění ledvin a pro měření účinnosti nových intervencí.

Vyvíjejí se nové radiologické nástroje pro řešení těchto problémů a poskytují neinvazivní prostředky pro sledování a měření hmoty nefronů in vivo. Tato technologie má potenciál poskytnout nový pohled na vývoj ledvin a její roli v progresi onemocnění později v životě. Pozorování dostupná prostřednictvím této technologie zahrnují počet nefronů, glomerulární objem a hypertrofii a možná i funkci jednoho nefronu. Tento přehled nastíní současný stav této nové technologie a poskytne pohled na její potenciální aplikace v preklinické vědě a klinických výzkumech.

Ex vivo přístupy k měření počtu nefronů a velikosti glomerulů

Nejrozsáhlejší přístupy k měření počtu nefronů a velikosti glomerulů jsou založeny na stereologii založené na designu. Tkáň se připraví a nařeže pro mikroskopii a analyzují se velikosti struktur, jako jsou glomeruly, pozorované na sklíčkách, aby se odvodily průměrné objemy struktur v původní tkáni. To lze provést v excidovaných orgánech nebo z bioptické tkáně systematickým a náhodným odběrem vzorků tkáně. Technika disektor-frakcionátor odhalila populační rozdíly v počtu nefronů a hyperfiltraci u lidí25 a byla široce používána ke studiu zvířecích modelů lidských nemocí.

Aby se předešlo krájení požadovaných stereologií, byly nedávno vyvinuty nové zobrazovací přístupy k doplnění bioptických dat a k měření počtu nefronů. Zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) je nejčastěji založeno na detekci protonů vody ve tkáni, především z vody, pomocí magnetických polí. Subjekt nebo vzorek je umístěn uvnitř velkého magnetického pole. Typické intenzity magnetického pole používané pro klinické MRI se pohybují od 1,5T do 7T. Preklinické systémy MRI často využívají mnohem větší intenzity pole pro vysoký poměr signálu k šumu a zlepšený kontrast a rozlišení obrazu. MRI poskytuje širokou škálu obrazových kontrastních technik pro zobrazení měkkých tkání a nevyžaduje ionizující záření. MRI také poskytuje vysoké rozlišení v preklinických i klinických systémech.

Kationtový feritin (CF) byl zaveden jako intravenózně injikovaná kontrastní látka k detekci a zobrazení glomerulů v celé ledvině pomocí MRI. Nabité nanočástice, včetně feritinu, byly po desetiletí používány ke zkoumání struktury a funkce bazální membrány pomocí elektronové mikroskopie (EM). . Molekula feritinu je detekována v EM díky svému elektronově hustému jádru oxidu železa. Toto stejné jádro z oxidu železa je často magnetické, takže je detekovatelné MR. Tato technika, kationtovým feritinem-enhanced MRI (CFE-MRI), byla použita k počítání každého glomerulu v ledvinách zdravých potkanů30 ex vivo a byla použita k měření intrarenální distribuce glomerulárních objemů. CFE-MRI byla také použita k počítání a měření každého glomerulu v myších ledvinách3] a glomerulární objemy byly mapovány, aby se odhalily prostorové variace ve velikosti glomerulů. Tato zjištění byla potvrzena několika skupinami. Měření na krysách i myších pomocí CFE-MRI byla ověřena stereologií disektor-frakcionátor.

CFE-MRI byla také provedena u intaktních ledvin lidského dárce, kde byla CF injikována přímo do renální tepny a ledvina byla před fixací a zobrazením propláchnuta fyziologickým roztokem. CFE-MRI v lidských ledvinách poskytla trojrozměrný pohled naledvinový glomerulárnímorfologie, ukazující heterogenní glomerulární hypertrofii a oblasti ztráty nefronu pravděpodobně spojené s neléčenou hypertenzí pacienta. Oblasti ztráty nefronů byly korelovány s histologií ze stejných oblastí, což prokázalo vaskulární i glomerulární sklerózu.

Tyto počáteční studie se zaměřily na změny v počtu nefronů a glomerulární morfologii s chronickým i akutním onemocněním ledvin. V Bennett et al-26 byla distribuce CF v ledvinách redistribuována v důsledku časné glomerulární patologie u potkaního modelu fokální a segmentální glomerulosklerózy, před projevem proteinurie. U myší byla CFE-MRI použita k detekci a mapování glomerulární hypertrofie v modelu oligosyndaktylismu (Os/plus) snížení nefronů31. Nedávno jsme to ukázaliakutní poškození ledvinna novorozeneckém modelu králíka způsobily detekovatelnou ztrátu glomerulů s vaskulární reorganizací35 Sledování změn ve značení CF pomocí MRI může být tedy důležitým nástrojem k pochopení dopadu poškození během vývoje a jeho dopadu na zdraví ledvin v pozdějším věku.

Při validaci CFE-MRI pomocí jiných technik, jako je direktorská-frakcionační stereologie používaná v těchto raných studiích, existuje několik důležitých úvah. CFE-MRI může měřit pouze glomeruly, které jsou perfundované, zatímco histologické přístupy detekují také glomeruly, které nejsou. Pokud jsou tyto dva přímo porovnány, když jsou glomeruly nedostatečně prokrvené nebo neperfundované, budou hodnoty MRI nižší. Strukturální a funkční faktory, jako je onkotický tlak, rychlost kapilární perfuze a struktura GBM, které ovlivňují akumulaci CF v GBM, nejsou dostatečně pochopeny, takže je možné, že glomerulární vychytávání je modulováno chorobnými procesy, které modulují CFE-MRI způsoby. které nebyly popsány. A konečně, poškození GBM nebo proteinurie mohou způsobit únik CF do tubulů, což vede k difuznímu spíše než tečkovanému značení glomerulů pozorovanému pomocí MRI. Ve studiích vývoje se struktura náboje GBM a glomerulární filtrace mění s gestačním věkem. Ve všech těchto případech je důležité porozumět parametrům zahrnutým do značení CF prostřednictvím pokračujícího vyšetřování. Je také důležité stanovit toxikologii CF, která se u zdravých zvířat jeví jako minimální, ale musí být zkoumána s každým novým modelem.

Xray-CT bylo nedávno prokázáno pro měření renální mikrostruktury a mapování počtu nefronů v intaktní ledvině ex vivo. Primární výhodou CT je jeho jednoduchost a rychlost použití a nízká cena ve srovnání s MRI. Nevýhodou je použití ionizujícího záření, které může omezit jeho použití in vivo nebo v klinických aplikacích. Nicméně C nabízí zobrazování značených struktur s vysokým rozlišením ex vivo, které pak mohou být registrovány společně s anatomií měkkých tkání pomocí jiných zobrazovacích modalit.

K měření glomerulárního počtu a velikosti kapilárních chomáčů v intaktních myších ledvinách byla použita mikroskopie se světelnou vrstvou po optickém čištění celého orgánu. Tento atraktivní přístup má výhodu v automatizaci a vizualizaci celého glomerulu v mikroskopickém rozlišení v celém orgánu nebo ve vzorcích velkých orgánů.

In vivo přístupy k přímému měření počtu nefronů a velikosti glomerulů

Zavedené a nově vznikající nástroje pro měření počtu nefronů ex vivo umožnily odvodit inter- a intra-subjektovou heterogenitu v počtu nefronů a glomerulárním objemu. Tyto nástroje začínají řešit kritické mezery v našich znalostech o struktuře ledvin a o tom, jak souvisí s funkcí v ledvinách, in vivo. Mezi tyto otázky patří: 1) Jaký je vztah mezi počtem a velikostí glomerulů s individuální filtrací nefronů?,2)Jaká je prostorová distribuce počtu nefronů a velikostí glomerulů a její vztah k patologii? a 3)Odpovídá rychlost glomerulární senescence změna zdravotního stavu a onemocnění ledvin? Klinicky je možné odhadnout počet nefronů in vivo pomocí kombinace rentgenu/CT a biopsie. Tento typ práce začíná poskytovat kritické spojení mezi počtem nefronů a funkcí ledvin. Několik publikací prokázalo, že MRI lze použít k detekci jednotlivých glomerulů u živého zvířete. První práce v této oblasti s použitím CFE-MRI byla omezena na specifické oblasti ledvin. V jedné zprávě byl vyvinut bezdrátový zesilovač, který lokálně zvyšuje signál v ledvině, aby umožnil společnou registraci jednotlivých nefronů během filtrace a funkce4. Nedávno dvě publikace uváděly měření jednotlivých glomerulů in vivo v celé ledvině pomocí CFE-MRI jak u potkanů, tak u myší. Tento přístup byl také použit v longitudinálním experimentu, který prokázal, že CFE-MRI může být potenciálně použito k monitorování změn počtu nefronů v průběhu času v reakci na terapii nebo ke sledování vývoje ledvin.

Primárním problémem s CFE-MRI in vivo je citlivost. Deoxyhemoglobin v krvi je paramagnetický a může způsobit artefakt magnetické susceptibility v kapilárách, který snižuje dynamický rozsah pro detekci glomerulů označených CF. K vyřešení tohoto problému může být feritin modifikován tak, aby obsahoval více železa, a jádro oxidu kovu CF může být upraveno tak, aby bylo snadněji detekovatelné bez artefaktu citlivosti. Jiné detekční strategie však přicházejí s kompromisy ve výtěžnosti produktu nebo rychlosti zobrazování, takže první demonstrace CFE-MRI tyto přístupy nepoužívala. Klíčem k CFE-MRI je řídit pohyb a zajistit, aby radiofrekvenční (RF) cívka byla dostatečně citlivá po celé ledvině.

Výhled pro vývojovou nefrologii: Struktura a funkce Zde jsme popsali vznikající nástroje pro přímé měření vybavení nefronu, a to jak ex vivo, tak in vivo. Rentgenové CT poskytuje rychlé získání obrazu a fenotypizaci ex vivo. Nástroje jako rentgenové CT kombinované s biopsií mají výhodu rychlého nasazení na klinice, nevýhodou je invazivita, použití ionizujícího záření a možnost zkreslení vzorku. Přístupy založené na MRI překonávají potřebu ionizujícího záření a poskytují kombinovaný kontrast měkkých tkání a mohou být použity ex vivo i in vivo. CFE-MRI vyžaduje injekci kontrastní látky, která musí být před použitím na klinice považována za bezpečnou. Zatímco in vivo měření počtu nefronů je v plenkách, nové sekvence získávání obrazu pro rychlé zobrazování mají kromě vylepšeného hardwaru a zpracování obrazu potenciál učinit tyto nástroje MRI praktickými pro rutinní použití. Jak tato technika vyzraje, budou nasazeny další pulzní sekvence, aby se snížila citlivost na artefakt susceptibility vyvolaný CF, a fyzika místního magnetického prostředí bude lépe pochopena, aby mohla odhalit ještě více informací. Existují také jedinečné příležitosti kombinovat glomerulární a tubulární morfologii s jinými strategiemi získávání snímků, aby se poskytl úplný pohled na mikrostrukturu, celkovou anatomii a fyziologii ledvin in vivo. Tyto kombinované informace lze použít ke studiu vývoje ztráty nefronů v průběhu času, což je primární rys akutních i chronických onemocnění ledvin a progresivních onemocnění ledvin během vývoje.

Nedávné zdokonalení vizualizace a segmentace obrazu pomocí analytických nástrojů nebo umělé inteligence umožňuje extrahovat velké množství informací z trojrozměrných obrazů tkáně. Některé nově se objevující techniky, jako je zobrazování tenzorů citlivosti, slibují poskytnout nové informace, které lze použít jako náhradu za mikrostrukturu tkáně. V ledvině to může usnadnit kombinované mapy glomerulů, tubulů, vaskulatury a intersticia z kombinace společně registrovaných snímků. Může být také možné přímo registrovat tyto obrazy k optickému zobrazování nebo k informacím získaným jinými radiologickými zobrazovacími modalitami. V každém případě je důležité tyto nové nástroje rozsáhle ověřit a případně standardizovat některé akviziční protokoly napříč institucemi, aby byla zajištěna vysoká úroveň reprodukovatelnosti. Dostupnost a snadnost použití nových nástrojů pravděpodobně podpoří nové přístupy ve vědě o datech k integraci informací ze všech těchto kontrastních mechanismů a modalit s cílem nabídnout nový, kvantitativní pohled na ledviny u velkého počtu subjektů. Ve vývoji mohou být tyto nástroje případně kombinovány v longitudinálních studiích. Pro toto úsilí bude zásadní přijetí a vytvoření nového strojového učení.

Zbývající výzvou je převést měření počtu nefronů pro in vivo zobrazování u lidí49. Klinické měření počtu nefronů nebo glomerulárního objemu by potenciálně umožnilo individualizované terapie přizpůsobené pozorování u konkrétních pacientů a mohlo by poskytnout zcela nový pohled na lidské ledviny. rozvoj.