Nefrotoxický potenciál domnělých 3,5-metabolitů dichloranilinu (3,5-DCA) a biotransformace 3,5-DCA v izolovaných buňkách ledvin z potkanů ​​Fischer 344

Chcete-li se dozvědět více, kontaktujte:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní:Současná studie byla navržena tak, aby prozkoumala in vitro nefrotoxický potenciál čtyř 3,5-dichloranilin(3,5-DCA)metabolitů(3,5-dichloracetanilidu,3,5- DCAA;3,5-dichlorfenylhydroxylamin,3,5-DCPHA;2-amino-4,6-dichlorfenol,2-A-4 ,6-DCP;3,5-dichlornitrobenzen,3,5-DCNB) a určit renální metabolismus 3,5-DCA in vitro. Při testování cytotoxicity,izolované ledvinové buňky(IKC) od samců krys Fischer 344 (~4 miliony/ml, 3 ml) byly vystaveny metabolitu (0-1,5 mM; až 90 minut) nebo vehikulu. Z těchto metabolitů byl 35-DCPHA nejsilnější nefrotoxický, s 35-DCNB středním nefrotoxickým potenciálem.2-A-4,6-DCP a 3,2- {12}}DCAA nebyly cytotoxické. V samostatných experimentech byla 35-cytotoxicita DCNB snížena předběžnou úpravou IKC antioxidanty a cytochromem P450, flavinmonooxygenázou a inhibitory peroxidázy, zatímco 3,{16}}cytotoxicita DCPHA byla oslabena dvěma nukleofilnímiantioxidanty(glutathion a N-acetyl-L-cystein). Inkubace IKC s 3,5-DCA(0.5-1.0 mm,90 min) vytvořila pouze 3,5-DCAA a 3,{{12 }}DCNB jako detekovatelné metabolity. Tyto údaje naznačují, že 3,5-DCNB a 3,{16}}DCPHA jsou potenciální nefrotoxické metabolity a mohou přispívat k nefrotoxicitě indukované 35-DCA in vivo. Kromě toho mohou ledviny bioaktivovat3,5-DCNB na toxické metabolity, a 3,5-DCPHA zřejmě vytváří reaktivní metabolity, které přispívají k3,{24}}nefrotoxicitě DCA. In vitro se N-oxidace 3,5-DCA zdá být primárním mechanismem biologické aktivace 3,5-DCA na nefrotoxické metabolity.

klíčová slova:nefrotoxicita; in vitro; krysa;3,5-dichloranilin;35-dichlorfenylhydroxylamin;3,5-dichloracetanilid;2-amino-4,6-dichlorfenol;3,{{ 9}}dichlornitrobenzen

kliknutím se dozvíte více informací.

1. Úvod

Chloraniliny jsou chemické meziprodukty běžně používané ve výrobním procesu mnoha barviv, zemědělských chemikálií, léků a průmyslových chemikálií. K expozici chloranilinům dochází v pracovních podmínkách prostřednictvím jejich uvolňování nebo tvorby během metabolismu mnoha sloučenin [1-3] savců nebo degradací pesticidů v životním prostředí[1,4-6]. Detekce chloranilinů v lidské moči nebo krvi byla použita jako biomarker pro expozici pesticidům na bázi chloranilinu [7-10]. Toxicita spojená s expozicí chloranilinům zahrnuje hematotoxicitu (např. anémii nebo methemoglobinémii)[11-13], splenotoxicitu [11,14], hepatotoxicitu [14-17], endokrinní narušení [18] a nefrotoxicitu [16,19 ,20]. Chloraniliny jsou také považovány za prioritní znečišťující látky ve studiích hodnocení rizik pro životní prostředí kvůli jejich potenciálním nepříznivým účinkům na zdraví a uvolňování po degradaci pesticidů do životního prostředí v zemědělských oblastech [21,22].

Ze tří monochlorovaných a šesti dechlorovaných anilinů je 3,5-dichloranilin (3,5-DCA) nejúčinnějším nefrotoxickým in vivo ain vitro[16,19,23]. In vivo expozice 3,{4}}DCA ve Sprague-Dawley nebo Fischer, 344 potkanů ​​vedlo ke zvýšené koncentraci dusíku močoviny v krvi (BUN), snížení transportu organických iontů v buňkách proximálních tubulárních buněk, snížení hmotnosti ledvin, proteinurii a hematurii [23,24]. Nejzávažnější morfologické změny se vyskytují v renálních proximálních tubulárních buňkách, ale distální tubulární buňky a sběrné kanálky jsou také ovlivněny 3,{10}}expozicí DCA [23]. Další studie s využitímizolované ledvinové buňky(IKC) od samců potkanů ​​Fischer 344 prokázaly, že koncentrace 1.0 mm nebo vyšší 3,5-DCA po dobu 90 minut vedou ke zvýšenému uvolňování laktátdehydrogenázy (LDH), což je míra cytotoxicity [25 ].

Toxicita anilinových sloučenin in vivo je způsobena především tvorbou toxických metabolitů. Na základě studií s anilinem a některými jeho chlorovanými deriváty byly biotransformační cesty pro tyto anilinové sloučeniny jasně stanoveny a zahrnují N-oxidaci, N-acetylaci a oxidaci fenylového kruhu [13, 26-28]. Ačkoli in vivo metabolismus 35-DCA nebyl podrobně studován, tyto biotransformační cesty by mohly produkovat řadu potenciálně toxických metabolitů (obrázek 1), jak je tomu u jiných chloranilinů, kde byly provedeny biotransformační studie [26, 29,30]. Nedávné studie Racina et al. [25] prokázali, že 35-DCA se metabolizuje na toxické metabolity prostřednictvím řady renálních enzymatických systémů. Není však jasné, které metabolity jsou produkoványledviny.

Jeden potenciální 3,5-metabolit DCA,4-amino-2,6-dichlorfenol (4-A-2,6-DCP) , byl hodnocen na nefrotoxický potenciál a je silně nefrotoxický in vivo a in vitro u samců potkanů ​​Fischer 344 [31-33]. Srovnávací in vitro studie nefrotoxického potenciálu často mono-, di- a trichlornitrobenzenů v renálních kortikálních řezech zjistila, že 3,5-dichlornitrobenzen (35-DCNB) je nejméně potentní nefrotoxický mezi dichlornitrobenzeny [34] . V současné době neexistují žádné studie, které by zkoumaly nefrotoxický potenciál jiných domnělých 3,5-metabolitů DCA.

Tato studie byla navržena tak, aby určila nefrotoxický potenciál tří dalších domnělých 3,5-DCA metabolitů, které vznikají N-acetylací, (3,5-dichloracetanilid;

3.5-DCAA), N-oxidace (3,5-dichlorfenylhydroxylamin; 35-DCPHA) nebo oxidace fenylového kruhu (2-amino-4, {{ 8}}dichlorfenol;2-A-4,6-DCP)(obrázek 1) po extrarenální biotransformaci 35-DCA. Byl zkoumán nefrotoxický potenciál 3,5-DCNB v modelu IKC a jeho potenciální mechanismus(y) bioaktivace. Kromě toho byl stanoven potenciál volných radikálů/reaktivních metabolitů přispívat k 35-DCPHA cytotoxicitě. Nakonec byla provedena biotransformační studie s cílem zjistit, do jaké míry je 35-DCA biotransformována v IKC ze samců potkanů ​​Fischer 344, a určit, které metabolity se tvoří.

2. Výsledky

2.1. Vztahy cytotoxicity v čase a koncentraci pro 3,5-metabolity DCA

Ke stanovení nefrotoxického potenciálu každého 3 5-předpokládaného metabolitu DCA, koncentrace a studie časového průběhu byly provedeny v IKC. Expozice 3,5-DCAA významně nezvýšila uvolňování LDH, markeru cytotoxicity, v žádném okamžiku (60 nebo 90 min) nebo koncentraci (0-1). 5 mM) testováno (obrázek 2A). Kromě toho expozice 2-A-4,6-DCP nevedla k významnému zvýšení uvolňování LDH v žádné testované koncentraci (až 1,5 mM) po 60 nebo 90 minutách expozice ( Obrázek 2B). Inkubace IKC s 3,5-DCNB nebo 3,5-DCPHA měla za následek zvýšení uvolňování LDH u obou sloučenin v závislosti na čase a koncentraci, ačkoli 3,5-DCPHA vyvolalo největší zvýšení Uvolnění LDH. Významné uvolňování LDH bylo pozorováno při 3,5-koncentracích DCNB 1,0 nebo 1,5mM nebo vyšších po 90 minutách, ale pouze 1,5 mM po 60 minutách (obrázek 2C). Naproti tomu35-DCPHA vyvolal významný nárůst v uvolňování LDH při 0,25 mM nebo vyšší po 60 a 90 minutách, přičemž zvýšení uvolňování LDH pozorované po 90 minutách bylo významně zvýšeno ve srovnání s příslušnými 60minutovými zvýšeními uvolňování LDH (obrázek 2D). Z testovaných metabolitů byly tedy 35-DCPHA nejvíce nefrotoxické.

2.2. Renální biotransformace a 3,5-DCNB Cytotoxicita

Vzhledem k tomu, že aniliny a nitrobenzeny mohou být navzájem metabolizovány, byly navrženy další studie, aby prozkoumala úlohurenální biotransformacea volné radikály v cytotoxicitě po expozici 1.0 mM 3,5-DCNB po dobu 60 min. K určení potenciální role volných radikálů v 3,{6}}DCNBcytotoxicitě byl IKC předem ošetřen antioxidantem. Předběžné ošetření všemi antioxidanty (-tokoferol, glutathion, askorbát a N-acetyl-L-cystein; obrázek 3) významně zmírnilo 3,5-DCNB-indukovanou cytotoxicitu.

K prozkoumání role renální biotransformace v 3,5-toxicitě DCNB u IKC byla využita předúprava inhibitory cytochromů P450 (CYPs), monooxygenázy obsahující flavin (FMO) a peroxidázy. Použití inhibitorů CYP (obrázek 4) ukázalo, že dva obecné inhibitory CYP (piperonylbutoxid [PiBx]; metyrapon) významně zmírnily 3,5-DCNB cytotoxicitu. Předběžné ošetření inhibitory FMO (n-oktylamin; methimazol) a inhibitorem peroxidázy merkaptosukcinátem významně zmírnilo 3,5-DCBN cytotoxicitu (obrázek 5). Indomethacin, který inhibuje peroxidázovou aktivitu cyklooxygenázy, měl tendenci snižovat 3,{12}}DCNB-indukované uvolňování LDH, ale nedosáhl významného rozdílu (obrázek 5).

2.3. Antioxidanty a 3,5-DCPHA Cytotoxicita

Abychom mohli začít zkoumat roli volných radikálů v 35-cytotoxicitě indukované DCPHA, byly IKC předem ošetřenyantioxidanty(glutathion, askorbát nebo N-acetyl-L-cystein) před expozicí 3,5-DCPHA (0,5 mM). Výsledky ukazují, že na rozdíl od 3,5-DCNB, 3,{{1{16}}}}DCPHA indukovaná cytotoxicita byla částečně oslabena N-acetyl-L-cysteinem a plně chráněna glutathionem (obrázek 6 ).Askorbát(1.0 nebo 2,0mM) nebyl účinný při snižování 3,{20}}cytotoxicity DCPHA.

2.4.3,5-DCA Metabolismus od IKC

Předchozí srovnávací studie cytotoxicity byly navrženy tak, aby prozkoumaly nefrotoxický potenciál domnělých 3,5-DCA metabolitů produkovaných externě. Zkoumali jsme také, jak IKC metabolizuje 3,5-DCA, abychom zjistili, které metabolity byly přímo produkovány ledvinovými buňkami. V těchto experimentech byly IKC inkubovány buď s netoxickou koncentrací 3, 5-DCA (0,5 mM) nebo s cytotoxickou koncentrací (1.0 mM) po dobu 90 minut a vzorky médií a buňky analyzovány pomocí HPLC na 3,5-DCA a její metabolity. Retenční časy pro 3,5-DCA a jeho metabolity, limity detekce a extrakční koeficienty jsou uvedeny v tabulce 1 pro autentické standardy 3,5-DCA a každého metabolitu (4-A{{ 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA a 3 ,5-DCNB).

Při obou koncentracích byla hlavní sloučeninou v médiu a buňkách na konci inkubační doby mateřská sloučenina 3, 5-DCA. Méně než 5 procent z 3,5-DCA bylo metabolizováno na 3,5-DCAA a 3,5-DCNB (tabulka 2). Nebyly nalezeny žádné důkazy o tvorbě nekonjugovaných aminochlorfenolových metabolitů 2-A-46-DCP nebo 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA nebyl detekován, což nebylo překvapivé vzhledem k vysoce reaktivní povaze tohoto metabolitu, ale zjištění, že 3,5-DCNB byl přítomen v médiích a buňkách, podporuje závěr, že se vytvořil 3,{19}}DCPHA a poté se dále oxiduje na 3,5-DCNB.

Existovala možnost, že aminochlorfenoly byly vytvořeny, ale metabolizovány na sulfátové nebo glukuronidové konjugáty. Aby se určilo, zda byly vytvořeny konjugáty, 3,5-DCA (1.0 mM) se inkubovalo s IKC po dobu 45 nebo 90 minut. Ošetření médií nebo buněčných lyzátů arylsulfatázou nebo -glukuronidázou však neodhalilo žádné volné 2-A-4,6-DCP nebo 4-A-2,{ {12}}DCP (data nejsou zobrazena). Tyto výsledky naznačují, že tyto dva metabolity nevznikly na detekovatelné úrovni nebo byly dále oxidovány na reaktivní metabolity (obrázek 1). Protože však došlo v podstatě k úplnému obnovení 35-ekvivalentů DCA, je nepravděpodobné, že by velká část těchto metabolitů, pokud vůbec nějaké, byla vytvořenaledvinové buňky.

2.5. Účinek kyseliny diethyldithiokarbamové (DEDTCA) na metabolismus 3,5-DCA

Předchozí studie prokázaly, že předléčení IKC inhibitory CYP2C výrazně snížilo 3,5-DCA cytotoxicitu [25]. Jedním z nejúčinnějších inhibitorů toxicity 35-DCA byl inhibitor CYP2C DEDTCA. Aby se zjistilo, jak DEDTCA ovlivnila 3,{7}}metabolismus DCA, byly IKC předem ošetřeny DEDTCA (0,1 mM) a následně {{10}}DCA (1,0 mM) po dobu 90 min inkubace. Stanovení hladin metabolitu 35-DCA a 3,5-DCA odhalilo, že celková hladina 3,5-DCA v médiích a buňkách byla jen mírně zvýšena, zatímco tvorba 3,{{ 20}}DCAA a 3,5-DCNB byly sníženy (tabulka 3). Nebylo zjištěno žádné 2-A-4.{26}}Zjištěno DCP 4-A-2,6-DCP nebo 3,5-DCPHA, což souhlasí s dřívějšími studiemi (tabulka 2).

3. Diskuse

Důležitým aspektem této studie bylo stanovení nefrotoxického potenciálu domnělých externě produkovaných metabolitů 3,5-DCA na renálních cílových buňkách. Předpokládá se, že tyto metabolity vzniknou na základě metabolismu anilinu a chloranilinů (obrázek 1)[13.26,28,29]. Již dříve jsme vypočítali, že nefrotoxická dávka 3,5-DCA u potkana Fischer 344 by poskytla maximální hladinu v krvi ~1,25 mM [25]. Koncentrace metabolitů pod touto koncentrací by tedy mohly být fyziologicky relevantní. Výsledky současné studie ukazují, že metabolit vznikající N-acetylací 3,5-DCA, 3,5-DCAA měl značně snížený nefrotoxický potenciál ve srovnání s 3,5-DCA. Tento výsledek není překvapivý a je v souladu s dřívějšími studiemi s monochloraniliny a jejich metabolity, které ukazují, že N-acetylace vede k metabolitům chloracetanilidu se sníženým nefrotoxickým potenciálem ve srovnání s mateřskou sloučeninou [35,36]. Zdá se tedy, že N-acetylace je detoxikační cestou nefrotoxicity vyvolané chloranilinem, včetně 3,5-DCA. Kromě toho je IKC schopen metabolizovat 3,5-DCA na 3,{{30} }DCAA (tabulka 2). Ale vzhledem k slabému nefrotoxickému potenciálu 3,5-DCAA je nepravděpodobné, že by tento metabolit přispíval k nefrotoxicitě indukované 35-DCA in vitro.

Na rozdíl od 3,5-DCAA, alespoň jeden metabolit, který je výsledkem oxidace fenylového kruhu 3,5-DCA, vyvolává nefrotoxicitu. Oxidací 3,5-DCA v poloze 4- vzniká 4-A-2,6-DCP (obrázek 1), který je silně nefrotoxický in vivo a in vitro [31-33]. In vivo 4-A-2,6-DCP(0,38 mmol/kg,ip) vyvolává výraznou nefrotoxicitu u samců potkanů ​​Fischer 344 charakterizovaných proteinurií, glukosurií, zvýšeným koncentrace močovinového dusíku v krvi (BUN) aledvinahmotnost a proximální tubulární nekróza v segmentu S3 [3132]. In vitro,4-A-2,6-DCP snížilo vychytávání p-aminohippurátu (PAH) a tetraethylamonia (TEA) u krysyledvinové kortikální řezyv koncentracích 5 μM a 50 μM, v daném pořadí 【31】 a zvýšené uvolňování LDH při 50 μM nebo vyšší po 2 hodinách expozice 【33】. V IKC jsou pro 4-A-2,6-DCP ke zvýšení uvolňování LDH vyžadovány koncentrace 250 μM nebo vyšší a 90minutová expozice. Vyšší koncentrace potřebné k indukci cytotoxicity v tomto modelu jsou s největší pravděpodobností způsobeny přítomností albuminu v inkubačním médiu pro IKC, ale ne v Krebs-Ringerově roztoku používaném ve studiích inkubace plátků ledvinové kůry. V této studii2-A-4,6-DCP, která je výsledkem oxidace v 2-poloze 35-DCA, nezvýšila uvolňování LDH při koncentracích až 1,5 mM a expozici až 90, což naznačuje, že 4-A-2,6-DCP byl jako nefrotoxický účinnější než 2-A-4, 6-DCP. Toto zjištění je v souladu se srovnáním nefrotoxických potenciálů jiných 4-amino- a 2-aminofenolů[37,38]. Tedy 4-A-2.6-Zdá se, že DCP pravděpodobněji než 2-A-4,6-DCP přispěje ke 3,{{38 }} DCA-indukovaná nefrotoxicita in vivo.

Ve studiích IKC3,5-metabolismu DCA, ani 2-A-4,6-DCA ani 4-A-2,6- DCA byly detekovány jako volné metabolity nebo jako glukuronidové nebo sulfátové konjugáty (tabulka 2). I když je možné, že byla produkována malá množství těchto aminodichlorfenolů, byla úplná izolace 3,{10}}DCA přidaného do inkubace IKC detekovaný jako mateřská sloučenina plus další metabolity (tabulka 2). Tyto výsledky naznačují, želedvinanetvoří dostatečné množství aminodichlorfenolových metabolitů, které by přispěly k 3,5-DCA nefrotoxicitě in vitro.

Ukázalo se, že N-oxidace je důležitou biotransformační cestou metabolismu anilinu a chloranilinu, která může přispívat k hepatotoxicitě a potenciálně dalším toxicitám vyvolaným těmito sloučeninami [11, 39-41]. N-oxidací anilinu vzniká fenylhydroxylaminový metabolit, který je dále oxidován na nitrosobenzenový metabolit [39] (obrázek 1). Metabolity fenylhydroxylaminu a nitrosobenzenu mohou v redoxním cyklu vytvářet volné radikály a oxidovat železité železo v hemoglobinu a další proteiny obsahující železnaté železo na železité železo. Tento cyklus přeměňuje hemoglobin na methemoglobin v erytrocytech, ale může také ovlivnit biologickou aktivitu jiných proteinů a enzymů, které pro biologickou aktivitu vyžadují molekulu železnatého železa. Metabolity nitrosobenzenu jsou také reaktivní a mohou se kovalentně vázat na nukleofily na makromolekulách v buňce [42,43]. Nitrososkupina může být dále oxidována za vzniku nitrobenzenových metabolitů (obrázek 1). Předchozí studie prokázaly, že 3,5-DCA může vyvolat methemoglobinémii in vivo a že za tuto toxicitu je primárně odpovědná 3,{13}}DCPHA (obrázek 1) [40,44,45]. Tyto nálezy naznačují, že 3,{19}}DCPHA je produkován externě, pravděpodobně v játrech, a přechází do krve, aby vyvolal methemoglobinemii, jako je tomu u anilinu [44,45]. Tato zjištění také naznačují, že ledviny jsou vystaveny 3,{23}}DCPHA produkovaným mimo ledviny.

Tvorba 3,5-DCNB pomocí IKC (tabulka 2) ukazuje, že ledviny mohou tvořit 3,5-DCPHA z 3,5-DCA. Ledviny tak mohou být vystaveny 3,5-DCPHA z intrarenální i extrarenální tvorby.3,5-DCPHA se ukázal jako nejtoxičtější testovaný metabolit a je pravděpodobné, že 3,{ {13}}DCPHA je hlavním přispěvatelem k 3,{15}}nefrotoxicitě DCA, přímo k buňkám ledvin a/nebo nepřímo prostřednictvím hematotoxicity. Je také pravděpodobné, že více enzymových systémů je schopno tvořit 35-DCPHA z 3,5-DCA, a tyto enzymové systémy mohou také vytvářet další 3,{20}}DCA nefrotoxické metabolity [46, 47]. Bylo prokázáno, že N-oxidace anilinových sloučenin je katalyzována CYP, flavinmonooxygenázami (FMO),

peroxidázy a prostaglandinsyntetázy [48-51]. Předchozí studie z naší laboratoře ukázaly, že 3,{2}}nefrotoxicitu DCA u IKC lze v různé míře zeslabit inhibitory těchto různých rodin enzymů [25], což naznačuje, že inhibice jedné rodiny enzymů umožní 35- DCA bude nadále bioaktivována jinými systémy metabolizujících enzymů. Pro stanovení, zda inhibitory používané Racinem et al. [25] měnili N-oxidaci 3,5-DCA, byla zkoumána schopnost diethyldithiokarbamátu (DEDTCA), inhibitoru CYP2C a v menší míře CYP2E1, snižovat tvorbu DCNB. DEDTCA byla vybrána pro studii, protože výrazně snížila 3,{13}}DCA cytotoxicitu u IKC [25]. Zjištění, že DEDTCA snížila tvorbu 3,5-DCNB v IKC, podporuje závěr, že DEDTCA zmírnila 3,{18}}DCA nefrotoxicitu, alespoň částečně, inhibicí N-oxidace 3,{{21} }DCA. Vzhledem k tomu, že inhibitor CYP2E1 isoniazid neměl žádný účinek na cytotoxicitu 3,5-DCA, zdá se, že enzymy CYP2C jsou bioaktivací 3,5-DCA na toxické metabolity prostřednictvím tvorby 35-DCPHA.

Cytotoxicita může být produkována in vitro v IKC pomocí 3,5-DCPHA prostřednictvím dvou potenciálních mechanismů; redoxní cyklování k produkci volných radikálů (např. superoxidový aniontový radikál) a oxidační stres nebo produkce alkylačního metabolitu (metabolitů). Racine a kol. [25] zjistili, že 3,5-DCA-indukovaná cytotoxicita u IKC nebyla způsobena oxidačním stresem. Snížené i celkové hladiny glutathionu byly sníženy o3,5-expozice DCA naznačující tvorbu reaktivního metabolitu. V současné studii byla 35-cytotoxicita DCPHA snížena nukleofilními antioxidanty (glutathion a N-acetyl-L-cystein), ale nikoli nenukleofilním antioxidantem askorbátem (obrázek 6). Tyto výsledky podporují jeden nebo více reaktivních, alkylačních metabolitů 3,5-DCPHA jako cytotoxických druhů.

Chlorované nitrobenzeny jsou nefrotoxické látky in vivo a in vitro [34,52,53]. Rickert a Held [3] zjistili, že jaterní mikrozomy samců krys Fischer 344 metabolizují 3-chlornitrobenzen redukcí nitroskupiny za vzniku 3-chloranilinu, což naznačuje, že metabolismus mezi 3,5-DCA a 3,5-DCNB je reverzibilní. Redukce 3,5-DCNB tedy vytvoří 3,5-dichlornitrosobenzen a 3,{16}}DCPHA, stejně jako oxidace 3,5-DCA produkuje tyto dva metabolity. Nicméně potenciální příspěvek 3,{20}}DCNB k 3,5-nefrotoxicitě DCA byl nejasný. Pokud byl 35-DCNB nefrotoxický metabolit, nebylo také jasné, zda je k produkci toxických chemických látek nutná biotransformace. Současné výsledky podporují 3,5-DCNB jako toxický3,5-DCA metabolit, který potenciálně přispívá k 3,5-DCA nefrotoxicitě po biotransformaci.

Současná studie ukazuje, že 3,5-DCNB je u IKC silnější nefrotoxická látka než 35-DCA [25]. Kromě toho schopnost antioxidantů a inhibitorů oxidativní biotransformace zeslabit 3,5-cytotoxicitu DCNB odráží účinky těchto předléčení při snižování cytotoxicity 3,5-DCA u IKC [25]. Tyto výsledky naznačují, že jakýkoli 3,{11}}DCNB vzniklý během 35-biotransformace DCA má potenciál přispět k 3,{15}}nefrotoxicitě DCA prostřednictvím metabolismu 3,5- DCNB se převádí zpět na 3,5-dichlornitrsobenzen a 3,5-DCPHA. Nicméně slabá aktivita inhibitorů CYP na 3,{23}}DCNB cytotoxicitu naznačuje, že jiné enzymové systémy (např. non-CYP nitroreduktáza) mohou být zodpovědné za redukci nitroskupiny v tomto modelovém systému nebo k ní přispívat. . Kromě toho schopnost antioxidantů výrazně zeslabit 3.5-Cytotoxicita DCNB podporuje roli volných radikálů odvozených od nitroskupiny a/nebo reaktivních sloučenin kyslík/dusík v nefrotoxickém mechanismu této sloučeniny. Vzhledem k výraznému zeslabení 3,5-nefrotoxicity DCNB některými inhibitory oxidativního metabolismu (např. n-oktylaminem a merkaptosukcinátem) je nepravděpodobné, že 35-DCNB je přímo toxický pro ledvinové buňky, ale produkuje jeho cytotoxicita prostřednictvím metabolitů. Studie metabolismu 3,{33}}DCA in vitro navíc naznačují, že ledvinové buňky nemusí produkovat dostatečné množství 3,{35}}DCNB, aby byly zodpovědné za 3,{37}}DCA cytotoxicitu in vitro. Je možné, že extrarenální metabolismus 3,5-DCA produkuje dostatek 3,5-DCNB, aby přispěl k 3,5-DCA-indukované nefrotoxicitě in vivo, ale celkový příspěvek 3,{{ 46}}DCNB až 3,5-nefrotoxicita DCA bude vyžadovat další studii.

Stručně řečeno, výsledky těchto studií naznačují, že externě generované metabolity amin-dichlorfenolu a metabolity vznikající při N-oxidaci mají potenciál přispívat k 3.5-nefrotoxicitě DCA in vivo, zatímco N-acetylaci {{5} }DCA je detoxikační mechanismus. In vitro je N-oxidace 3,5-DCA hlavním mechanismem biologické aktivace 3,5-DCA na cytotoxické metabolity a toxicita je s největší pravděpodobností zprostředkována 3,5-dichlornitrobenzenem a /nebo 3,5-DCPHA. Kromě toho 3,5-nefrotoxicita vyvolaná DCNB je způsobena tvorbou metabolitů a nefrotoxicita 3,5-DCNB je také s největší pravděpodobností zprostředkována 3,5-dichlornitrobenzenem a/nebo 35-DCPHA.

4. Materiály a metody

4.1.Zvířata

Samci krys Fischer 344 (200-250 g) byli získáni od Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, USA). Zvířata umístila dvě krysy na klec s potravou a vodou dostupnou ad libitum, s řízenou teplotou (21-23 stupeň), vlhkostí (40-55 procent) a světlem (12 h zapnuto/12 h vypnuto). Před použitím byla všechna zvířata ponechána alespoň jeden týden aklimatizovat se v akreditovaných zvířecích zařízeních American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Veškeré použití na zvířatech bylo schváleno Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití na Marshallově univerzitě (protokoly 447 (5. srpna 2010) a 531 (1. února 2013)) a experimenty s použitím zvířat byly prováděny v souladu s Pokynem pro péči a použití laboratorních zvířat , kterou přijal Státní zdravotní ústav.

4.2. Chemikálie

Všechny chemikálie byly zakoupeny v nejvyšší dostupné čistotě od Fischer Scientific (Pittsburgh, PA, USA) nebo Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), kromě 3,5-dichlorfenylhydroxylaminu(3,{{3} }DCPHA), 35-dichloracetanilid (3.5-DCAA) a 2-amino-4,6-dichlorfenol (2-A{{11 }},6-DCP), které byly syntetizovány v naší laboratoři. 3,5-DCPHA byla syntetizována redukcí 3,5-DCNB s použitím hydrazinu-palladia na uhlíku dříve popsanou metodou Rondestvedta a Johnsona [54] a purifikována, jak je popsáno v Valentovic et al. [55]. Syntéza a čištění 3,5-DCAA byly provedeny za použití metody Newell et al. [56]reagováním stejných množství 3,5-dichloranilinu a acetanhydridu v přítomnosti octanu sodného. K přípravě 2-A-4,6-DCP,2,4-dichlorfenolu byl nitrován pomocí metody McMillana et al.[29,57] s následnou redukcí nitro skupinu na aminoskupinu s hydrosiřičitanem sodným v 10% vodném hydroxidu sodném podle Newell et al. [56].

4.3. Příprava a ošetření izolovaných buněk ledvin

Izolované ledvinové buňky(IKC) byly získány od neléčených samců krys Fischer 344. Samci krys Fischer 344 byli vybráni jako model pro získání izolovaných ledvinových buněk, protože většina našich předchozích údajů o toxicitě s 3,{3}}DCA byla získána v tomto modelu. Krysy byly anestetizovány pentobarbitalem (75 mg/kg, ip) a IKC byl připraven metodou Jones et al.[58] za použití perfuze kolagenázy, jak je popsáno v Racine et al. [25]. Ledvinové buňky izolované touto technikou jsou obohaceny v renálních kortikálních buňkách na základě biochemické charakterizace a jsou často používány při hodnocení renální toxikologie [59-63]. Počáteční životaschopnost buněk byla stanovena jako ~85-90 procent uvolněním laktátdehydrogenázy (LDH) a vyloučením trypanové modři (2 procenta w/o). Před inkubací byly IKC spočítány a resuspendovány v Krebs-Henseleitově pufru (pH 7,37; 25 mM Hepes; 2 % w/o hovězí sérový albumin) v koncentraci ~4,2 milionů buněk/ml. IKC (3 ml) byly předem inkubovány v 25 ml polykarbonátových Erlenmeyerových baňkách po dobu 5 minut při 37 stupních v atmosféře 95 procent kyslíku/5 procent oxidu uhličitého. Po předinkubaci byly buňky vystaveny různým koncentracím 3,5-DCNB (0.5-1,5 mM), 3.5-DCAA({{32} }.5-1,5 mM),3.5-dichlorfenylhydroxylamin (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A-4,6-DCP （0.5-1,5 mM） nebo vozidlo （30 μL DMSO） až 90 Na konci přidělené inkubační doby byly odebrány vzorky (0,5 ml) pro test uvolňování LDH, jak bylo popsáno dříve [20,25].

K určení rolerenální biotransformacev 3, 5-cytotoxicita DCNB a volné radikály v 35-nefrotoxicitě DCPHA, byly IKC předem ošetřeny buď antioxidantem, nebo inhibitorem biotransformačních enzymových systémů (tabulka 4) nebo vehikulem (30ul DMSO) před vystavením 1.0mM35-DCNB (60 min) nebo 0,5 mM3,5-DCPHA (60 min). Všechny koncentrace a doby předúpravyantioxidantyainhibitory renálních enzymůbyly založeny na dříve publikovaných studiích [20,25].

4.4. Metabolismus IKC 3,5-DCA

4.4.1.Inkubace IKC a izolace metabolitů

IKC (~4,2 milionů buněk/ml; 3 ml) byly inkubovány s 3,5-DCA (0,5 nebo 1.0mM) v Krebs-Henseleitově (KH) pufru ( pH 7,4) po dobu 90 min v třepací vodní lázni v atmosféře 95 procent kyslíku/5 procent oxidu uhličitého, jak je popsáno výše. Koncentrace 0,5 mM 3,5-DCA je necytotoxická koncentrace při 90 min, zatímco koncentrace 10 mM indukuje cytotoxicitu, jak dokazuje zvýšené uvolňování LDH. Na konci inkubační doby byly odebrány 1,{30}} ml vzorky a média a buňky byly odděleny centrifugací. Peletované buňky byly promyty KH pufrem (bez hovězího sérového albuminu) a oplach byl přidán do média. Buňky byly lyžovány pomocí sonikace a protein byl vysrážen přidáním methanolu (1,0 ml) ke všem vzorkům. Vzorky byly odstředěny (3000 g; 10 min 4 stupně ） a supernatant byl zfiltrován přes 0,45μ injekční filtr a skladován při -20 stupni až do analýzy pomocí HPLC, jak je popsáno níže).

4.4.2. Stanovení sulfátových a glukuronidových konjugátů

Aby se určilo, zda se vytvořily sulfátové nebo glukuronidové konjugáty, v některých experimentech byly média a frakce buněčného supernatantu získané tak, jak je popsáno výše, ošetřeny ß-glukuronidázou (6500 jednotek/ml, konečná koncentrace) nebo arylsulfatázou (200 jednotek/ml, konečná koncentrace) plus saccaharolakton (20 mM, konečná koncentrace) po dobu 18 hodin (37 stupňů) v 0,1 M acetátovém pufru (pH 5,0), aby došlo k hydrolýze jakýchkoli glukuronidových nebo sulfátových konjugátů, v daném pořadí, které se vytvořily 26] . Hydrolýza byla zastavena přidáním studeného methanolu (2,4 ml). Frakce byly poté filtrovány a skladovány až do analýzy, jak je popsáno výše.

4.4.3. Inhibice metabolismu CYP2C pomocí DEDCTA

V samostatném experimentu byly buňky předem ošetřeny kyselinou diethyldithiokarbamátovou (DEDTCA, 0,1 mM, 30minutová předúprava), inhibitorem CYP2C, před přidáním 3,{5}}DCA ke stanovení, které metabolity byly sníženy pomocí DEDTCA předúprava. Po 90minutové inkubační době byly buňky a média ošetřeny a skladovány, jak je popsáno výše, pro stanovení koncentrací 3,5-DCA a koncentrací vytvořených 3,{10}}metabolitů DCA.

4.4.4. HPLC stanovení metabolitů

Vzorky (75 ul) média a lyžovaného IKC byly analyzovány na systému Waters Alliance e2695 HPLC (Waters Co., Milford, MA, USA), za použití detektoru Waters 2489 s variabilním UV/Vis při 254 nM. Chromatogramy byly shromážděny a integrovány pomocí softwaru Empower 3 (Waters Co., Milford, MA, USA）. Kolona Waters X Select HSS T3 C18 （3,5 μm; 4,6×150 mm²）vybavená Waters XSelect HSS T3 K separaci sloučenin byla použita VanGuard Cartridge (3,5 um; 3,9 × 5 mm2). Mobilní fáze se skládala z 50:50 methanolu, vody s průtokem 0,75 ml/min. Standardní křivky byly stanoveny limity detekce a extrakční koeficienty pro 3,5-DCA a domnělé metabolity. Extrakční koeficienty byly stanoveny porovnáním integrace 1,0 mM3,5-DCA nebo vzorku metabolitu, který byl podroben vzorku zpracování (tj. přidání methanolu a centrifugace) k nezpracovanému 1,0 mM 35-DCA nebo vzorku metabolitu.

4.5. Statistika

Data jsou prezentována jako průměr ± SEM s N z {{0}} samostatných experimentů na zvířatech, s výjimkou N=3 v experimentu metabolismu netoxického 0,5 mM 3,5-DCA. Data mezi ošetřeními byla analyzována jednocestnou analýzou variance (ANOVA) následovanou Tukey testem. Význam byl stanoven na str<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Autorské příspěvky: CRR: revize literatury, provedení práce, analýza dat a interpretace přispěly k napsání článku; MAV: návrh experimentu a interpretace dat, DKA: pomoc při provádění práce a přípravě příspěvku; GOR:přehled literatury, experimentální design, interpretace dat, napsal a upravil článek. Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Financování: Tento výzkum byl zčásti podporován Národním institutem všeobecných lékařských věd Národního institutu zdraví pod číslem P20GM103434 udělený GOR Obsah je výhradně v odpovědnosti autorů a nemusí nutně představovat oficiální názory National Institutes of Health .

Prohlášení institucionální revizní rady: Veškeré použití na zvířatech bylo schváleno Institucionálním výborem pro péči a použití zvířat Marshall University (Protokoly 447 (5. srpna 2010) a 531 (1. února 2013)) a experimenty s použitím zvířat byly provedeny v souladu s Příručkou pro péči a použití Laboratorní zvířata, přijatá Státním zdravotním ústavem.

Prohlášení o dostupnosti dat: Údaje uvedené v této studii jsou k dispozici na vyžádání u příslušného autora.

Střet zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Aizawa, H. Metabolické mapy pesticidů; Academic Press, Inc.: Londýn, Spojené království, 1989; Svazek 2.

2. Ehlhardt, WJ Metabolismus a dispozice protirakovinného činidla síry u myši, potkana, opice a člověka. Drug Metab. Dispos. 1991, 19, 370–375. [PubMed]

3. Rickert, DD; Held, SD Metabolismus chlornitrobenzenů izolovanými potkaními hepatocyty. Drug Metab. Dispos. 1990, 18, 5–9. [PubMed]

4. Lee, JB; Sohn, HY; Shin, KS; Kim, JS; Jo, MS; Jeon, CP; Jang, JO; Kim, JE; Kwon, GS Mikrobiální biodegradace a toxicita vinclozolinu a jeho toxického metabolitu 3,5-dichloranilinu. J. Microbiol. Biotechnol. 2008, 18, 343–349. [PubMed]

5. Santos, TCR; Rocha, JC; Alonsa, RM; Martinez, E.; Ibanez, C.; Barcelo, D. Rychlá degradace propanilu v polních plodinách rýže. Environ. Sci. Technol. 1998, 32, 3479-3484. [CrossRef]

6. Marlett, VL; Martyniuk, CJ Biologické odezvy na fenylmočovinové herbicidy u ryb a obojživelníků; nové směry pro charakterizaci mechanismů toxicity. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2017, 194, 9–21. [CrossRef]

7. Lindh, CH; Littorin, M.; Amilon, A.; Jonsson, BA Analýza 3,5-dichloranilinu jako biomarkeru vinclozolinu a iprodionu v lidské moči pomocí kapalinové chromatografie/trojnásobné kvadrupólové hmotnostní spektrometrie. Rychlá komunikace. hmotnostní spektrum. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]

8. Kutting, B.; Goen, T.; Schwegler, U.; Fromme, H.; Uter, W.; Angerer, J.; Drexler, H. Monoarylaminy v obecné populaci – Průřezová populační studie zahrnující 1004 bavorských subjektů. Int. J. Hyg. Environ. Zdraví 2009, 212, 298–309. [CrossRef]

9. Turci, R.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Stanovení dichloranilinů v lidské moči plynovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií: Validační protokol a stanovení referenčních hodnot v populační skupině žijící ve střední Itálii. Rychlá komunikace. hmotnostní spektrum. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]

10. Vitelli, N.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Somaruga, C.; Turci, R.; Minoia, C.; Brambilla, G.; Colombi, A. Pracovní a environmentální expozice anilidovým a dikarboximidovým pesticidům. G. Ital. Med. Lav. Ergon. 2007, 29 (Suppl. 3), 276–277.

11. Chhabra, RS; Thompson, M.; Elwell, MR; Gerken, DK Toxicita p-chloranilinu u potkanů ​​a myší. Food Chem. Toxicol. 1990, 28, 717–722. [CrossRef]

12. Guilhermino, L.; Soares, AM; Carvalho, AP; Lopes, MC Akutní účinky 3,4-dichloranilinu na krev samců krys Wistar. Chemosphere 1998, 37, 619-632. [CrossRef]

13. Pizon, AF; Schwartz, AR; Shum, LM; Rittenberger, JC; Dolní, DR; Giannoutsos, S.; Virji, MA; Krasowski, MD Toxikologická laboratorní analýza a expozice člověka p-chloranilinu. Clin. Toxicol. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]

14. Koenig, CM; Beevers, C.; Pant, K.; Young, RR Hodnocení mutagenního potenciálu para-chloranilinu a anilinu v játrech, slezině a kostní dřeni potkanů ​​Big Blue® s mikronukleární analýzou v periferní krvi. Environ. Mol. Mutagen. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]

15. Valentovič, MA; Ball, JG; Anestis, DK; piva, KW; Madan, E.; Hubbard, JL; Rankin, GO Akutní renální a jaterní toxicita 2-haloanilinů u potkanů ​​Fischer 344. Toxikologie 1992, 75, 121–131. [CrossRef]

16. Valentovič, MA; Ball, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Srovnání in vitro toxicity strukturních izomerů dichloranilinu. Toxicol. In Vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]

17. Valentovič, MA; Lo, HH; Brown, PI; Rankin, GO 3,5-Toxicita dichloranilinu u potkanů ​​Fischer 344 předem ošetřených inhibitory a induktory cytochromu P450. Toxicol. Lett. 1995, 78, 207–214. [CrossRef]

18. Bhuiyan, MNH; Kang, H.; Kim, JH; Kim, S.; Kho, Y.; Choi, K. Endokrinní narušení několika anilinovými deriváty a souvisejícími mechanismy v lidské adrenální buněčné linii H295R a dospělých samcích zebrafish. Ekotoxikol. Environ. Saf. 2019, 180, 326–332. [CrossRef]

19. Hong, SK; Anestis, DK; Henderson, TT; Rankin, GO Nefrotoxicita in vitro indukovaná haloanilinem: Účinky 4-haloanilinů a 3,5-dihalogenanilinů. Toxicol. Lett. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]

20. Racine, C.; Ward, D.; Anestis, DK; Ferguson, T.; Preston, D.; Rankin, GO 3,4,5-Trichloranilinová nefrotoxicita in vitro: Potenciální role volných radikálů a renální biotransformace. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]

21. Boehncke, A.; Kielhorn, J.; Konnecker, G.; Pohlenz-Michel, C.; Mangelsdorfer, I. Stručný dokument mezinárodního hodnocení chemických látek 48—4-chloranilin; Světová zdravotnická organizace: Ženeva, Švýcarsko, 2003.

22. Vangnai, AS; Kataoka, N.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Tajima, T.; Kato, J. Konstrukce a aplikace bioreportéru Escherichia coli pro detekci anilinu a chloranilinu. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]

23. Lo, HH; Brown, PI; Rankin, GO Akutní nefrotoxicita vyvolaná izomerními dichloraniliny u krys Fischer 344. Toxikologie 1990, 63, 215–231. [CrossRef]

24. Rankin, GO; Yang, DJ; Teets, VJ; Lo, HH; Brown, PI 3,5-Dichloranilinem indukovaná nefrotoxicita u potkanů ​​Sprague-Dawley. Toxicol. Lett. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]

25. Racine, ČR; Ferguson, T.; Preston, D.; Ward, D.; Ball, J.; Anestis, D.; Valentovič, M.; Rankin, GO Role biotransformace a oxidačního stresu v nefrotoxicitě indukované 3,5-dichloranilinem (3,5-DCA) v izolovaných renálních kortikálních buňkách od samců potkanů ​​Fischer 344. Toxikologie 2016, 341–343, 47–55. [CrossRef] [PubMed]

26. Hong, SK; Rankin, GO Biotransformace 2-chloranilinu u krys Fischer 344: Identifikace metabolitů v moči. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [CrossRef] [PubMed]

27. Rankin, GO; Racine, C.; Sweeney, A.; Kraynie, A.; Anestis, DK; Barnett, JB In vitro nefrotoxicita vyvolaná propanilem. Environ. Toxicol. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]