Nc886, nekódující RNA, je nový biomarker a epigenetický mediátor buněčného stárnutí ve fibroblastech

Abstraktní:

Funkční studie organismů a lidských modelů odhalily, že epigenetické změny mohou významně ovlivnit proces stárnutí. Nekódující RNA (ncRNA), jeden z epigenetických regulátorů, hraje důležitou roli při modifikaci exprese mRNA a jejich proteinů. Dokáže zprostředkovat fenotyp buněk. Bylo hlášeno, že nc886 (=vtRNA2-1 nebo pre-miR-886), dlouhá ncRNA, může potlačit tvorbu nádorů a fotopoškození keratinocytů způsobené UVB zářením. Cílem této studie bylo určit roli nc886 v replikativní senescenci fibroblastů a určit, zda látky schopné řídit expresi nc886 mohou regulovat buněčné stárnutí.

V replikativních senescenčních fibroblastech byla exprese nc886 snížena, zatímco methylovaný nc886 byl zvýšen. Došlo ke změnám v biomarkerech stárnutí včetně aktivity SA- -gal a exprese p16INK4A a p21Waf1/Cip1 v senescentních buňkách. Tato zjištění naznačují, že pokles nc886 spojený se stárnutím souvisí s buněčným stárnutím fibroblastů a že zvýšení exprese nc886 má potenciál potlačit stárnutí buněk. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) zvýšil expresi nc886 a zlepšil buněčné stárnutí fibroblastů inhibicí biomarkerů souvisejících s věkem. Tyto výsledky naznačují, že nc886 má potenciál jako nový cíl pro boj proti stárnutí a že ATC může být silnou epigenetickou složkou proti stárnutí.

Buněčné stárnutí je široký pojem, který zahrnuje jevy, jako je snížená buněčná funkce, snížená proliferační kapacita a poškození DNA způsobené mnoha faktory. Buněčné stárnutí není jediný, předvídatelný proces, ale kombinovaný účinek řady různých fyziologických, genetických a environmentálních faktorů. Při výzkumu bylo zjištěno, že Cistanche dokáže odolávat stárnutí, protože princip anti-agingu Cistanche souvisí především s různými aktivními složkami, které obsahuje. Cistanche je bohatá na celou řadu biologicky aktivních látek, jako jsou polysacharidy, flavonoidy, acetofenony atd. Mezi nimi je polysacharid jednou z hlavních účinných látek Cistanche, která má různé zdravotní funkce, jako je posílení imunity, antioxidační účinky, regulaci metabolismu atd. a může zmírnit stupeň stárnutí organismu.

Click cistanche tubulosa výhody

klíčová slova:

fibroblasty; replikativní senescence; epigenetická regulace; nc886; extrakt ze zeleného čaje.

1. Úvod

Senescence buněk v nevratném stavu po zastavení buněčné proliferace se ukázala jako potenciálně důležitý přispěvatel k dysfunkci tkání a stárnutí organismů [1]. Senescence je charakterizována vysokou aktivitou beta-galaktosidázy asociované se stárnutím (SA- -gal), zvýšenou expresí senescence biomarkerů, jako jsou p16INK4A a p21Waf1/Cip1, a sníženou expresí LaminB1 [2]. Existují dva základní typy buněčného stárnutí: replikativní stárnutí a stresem vyvolané předčasné stárnutí. Replikativní stárnutí je definováno jako jev, kdy se normální buňky přestanou dělit po dosažení omezeného počtu dělení. Souvisí s chronologickým stárnutím. Kontinuální akumulace poškození může vyvolat replikativní stárnutí fibroblastů, což vede ke ztrátě schopnosti remodelovat a organizovat extracelulární matrix (ECM). Hlavními rysy stárnoucí dermis jsou snížené množství kolagenových vláken a zvýšená produkce matrixových metaloproteináz (MMP), které přispívají k tenké a neorganizované struktuře dermis [3,4].

Epigenetické regulační mechanismy jsou klíčovými mediátory procesu stárnutí, adaptace na stresory a změny související s věkem v genomovém a molekulárním prostředí. Tyto epigenetické alterace se vyskytují na různých úrovních, včetně masivní redukce jádrových histonů, deformace histonu posttranslační modifikací a metylací DNA, nahrazení kanonických histonů variantami histonů a změněné exprese nekódující RNA (ncRNA) během organizmové a replikativní stárnutí [5 ,6]. nc886 je ncRNA dlouhá 101 nukleotidů, která se může vázat na cílový protein, a tak zprostředkovávat aktivitu proteinu a kontrolovat genovou expresi [7]. nc886 byl také navržen jako nádorový supresor do značné míry odvozený z jeho expresního vzoru a jeho genomového umístění na lidském chromozomu 5q31, lokusu nádorového supresorového genu. Rysem exprese nc886 je časté umlčování malignit methylací CpG DNA v promotorové oblasti [8]. Na základě předchozích studií jsme zjistili, že snížení exprese nc886 způsobené UVB zářením je spojeno se zvýšením COX-2 a MMP-9 prostřednictvím proteinkinázy RNA-aktivované (PKR) dráhy v keratinocytech a že podpora exprese nc886 může být užitečnou strategií pro vývoj UVB ochranných materiálů [9,10].

Zelený čaj byl studován jako léčba různých dermatologických stavů, jako je akné, rosacea, lupénka, virové bradavice a dokonce i rakovina kůže. Fenolové sloučeniny včetně kyseliny gallové (GC) a epigalokatechin galátu (EGCG) jsou dobře známé aktivní sloučeniny v zeleném čaji. (-)-Epigallocatechin-3-(3"-O-methyl)galát (3" Me-EGCG) je unikátní O-methylovaná forma EGCG a je obsažena v čaji oolong a zeleném čaji. Konkrétně Jangwon č. 3 (amorepacifické odrůdy zeleného čaje) obsahuje více 3" Me-EGCG než jiné odrůdy zeleného čaje [11]. 3" Me-EGCG vykazuje antioxidační a fotoprotektivní účinky na keratinocyty [12]. . V této studii jsme zkoumali roli nc886 v replikativní senescenci fibroblastů a zjišťovali, zda vysoce koncentrovaný přípravek ze zeleného čaje 3" Me-EGCG (AbsoluTea Concentrate 2.0), který by mohl zvýšit expresi nc886, může zlepšit buněčné stárnutí.

2. Výsledky

2.1. Chemický profil AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC)

Chemický profil koncentrátu AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) je znázorněn na obrázku 1B. Výsledky byly získány pomocí HPLC pro ATC připravené tak, jak je popsáno v části Metoda. ATC obsahoval 30 procent nebo více 3" Me-EGCG (obrázek 1B). Je známo, že extrakt ze zeleného čaje neobsahuje 3" Me-EGCG nebo nevykazuje koncentraci nižší než 6 procent [13,14]. Jak mladé, tak senescentní fibroblasty ošetřené ATC vykazovaly větší zvýšení exprese nc886 než ty, které byly ošetřeny 70% ethanolickým extraktem zeleného čaje (doplňkový obrázek S1A). Kromě toho hladiny exprese SA- -gal v senescentních fibroblastech ošetřených ATC byly sníženy více než u těch, které byly ošetřeny extraktem ze zeleného čaje (doplňkový obrázek S1B).

2.2. nc886 Reguluje buněčné stárnutí fibroblastů

K pozorování role nc886 v buněčné senescenci fibroblastů jsme použili replikativní senescentní model prostřednictvím pěstování a subkultivace. Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku S2, aktivita SA- -gal a hladiny exprese senescentních markerů p16INK4A a p21Waf1/Cip1 byly zvýšeny a exprese Lamin B1 byla snížena v senescentních fibroblastech ve srovnání s mladými buňkami. Mnoho předchozích studií uvádí, že stárnutí je způsobeno oxidačním stresem. Aby se potvrdilo, zda je tato série oxidačního stresu zapojena do buněčného stárnutí, byly měřeny hladiny ROS v mladých (p3) a senescentních fibroblastech (p30). Výsledky ukázaly, že hladiny ROS se zvyšovaly se stárnutím (doplňkový obrázek S2D).

Pro pozorování potenciálního dopadu nc886 na buněčné stárnutí ve fibroblastech byla stanovena hladina genové exprese nc886 v každém počtu pasáží. Úroveň exprese nc886 se snižovala se zvyšujícím se počtem pasáží (obrázek 2A). Bylo hlášeno, že exprese nc886 je snížena s methylací CpG ostrovů. Aby se určilo, zda downregulace nc886 v senescentních fibroblastech byla zprostředkována methylací nc886, byla provedena methylačně specifická PCR. Jak je znázorněno na obrázku 2A, methylace nc886 se zvyšovala se zvyšujícím se počtem pasáží (obrázek 2A). Tento výsledek ukazuje, že snížená exprese nc886 ve vysokém počtu pasáží fibroblastů je způsobena zvýšením methylace nc886 DNA. Pro ověření role nc886 v senescenci fibroblastů byly stanoveny změny v senescentních markerech v modelech nadměrné exprese nc886 a knock-down modelů. Výsledky ukázaly, že skupina senescentních fibroblastů s nadměrnou expresí nc886 vykazovala sníženou aktivitu SA-beta-gal, snížené hladiny exprese p16INK4A a p21Waf1/Cip1 a zvýšené hladiny laminB1.

Kromě toho bylo zvýšení ROS v senescentních fibroblastech sníženo nadměrnou expresí nc886 (obrázek 2B). Naopak ve skupině mladých fibroblastů s knock-down nc886 byla buněčná senescence urychlena a hladiny exprese buněčných senescentních markerů, jako jsou p16INK4A a p21Waf1/Cip1, byly zvýšeny (obrázek 2C). Tyto výsledky naznačují, že nc886 může regulovat buněčné stárnutí fibroblastů regulací exprese markerů stárnutí (obrázek 2B, C).

2.3. ATC zmírňuje stárnutí buněk regulací exprese nc886

Výsledky získané výše ukázaly, že zvýšení exprese nc886 by mohlo zlepšit buněčnou senescenci zprostředkováním senescentních markerů. Pro pozorování účinku ATC na expresi nc886 byla hodnocena hladina exprese a methylace nc886 v senescentních fibroblastech po ošetření ATC v necytotoxické koncentraci (obrázek 3A). Jak je znázorněno na obrázcích 3B a C, ATC významně zvýšilo expresi nc886 a snížilo methylaci nc886 způsobem závislým na koncentraci. Tento výsledek ukázal, že zvýšení exprese nc886 pomocí ATC bylo zprostředkováno prostřednictvím inhibice methylace nc886. Kromě toho jsme pozorovali, že ATC inhiboval aktivitu SA- -gal a snížil hladiny exprese senescentních markerů p16INK4A a p21Waf1/Cip1 v senescentních fibroblastech (obrázek 3D, E). Nicméně exprese LaminB1, o které je známo, že se snižuje se stárnutím, byla zvýšena u senescentních fibroblastů ošetřených ATC (obrázek 3E). Tyto výsledky ukazují, že ATC může zmírnit stárnutí buněk zvýšením exprese nc886.

Obrázek 2. nc886 reguluje buněčné stárnutí fibroblastů. (A) Exprese nc886 a methylovaného nc886 podle pasáže byla potvrzena PCR v reálném čase a normalizována pomocí 18s rRNA. (B) Fragment nc886 amplifikovaný a purifikovaný z lidské genomové DNA byl transfekován do senescentních buněk pomocí Lipofectamine 300}0. Nadměrná exprese byla potvrzena pozorováním exprese nc886 pomocí PCR v reálném čase a exprese SA{10}}gal pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. V modelu nadměrné exprese nc886 byla pozorována exprese markerového proteinu stárnutí a tvorba intracelulárního ROS. (C) Buňky byly transfekovány antioligy (si-ctrl a si-nc886) v koncentraci 250 ppm za použití činidla LipofectaminTM RNAiMAX. Knock-down nc886 byl potvrzen pozorováním exprese nc886 pomocí PCR v reálném čase a exprese SA- -gal pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie. Exprese markerů stárnutí byla potvrzena Western blotem. Měřítko: 200 µm. Data jsou prezentována jako průměr ± SD ze tří nezávislých testů. *, p < 0,05; **, p < 0,01 ve srovnání s kontrolou.

2.4. ATC reguluje změny ECM a SASP související s věkem

Charakteristickým znakem stárnutí fibroblastů je, že aktivita MMP-1, složky, která degraduje kolagen, je zvýšená, zatímco syntéza kolagenu je snížena [15,16]. Nárůst MMP-1 a pokles kolagenu byly potvrzeny u senescentních fibroblastů s vysokým počtem pasáží (obrázek 4A).

ATC však potlačila expresi MMP-1 a zvýšila syntézu kolagenu v senescentních fibroblastech. Tento výsledek ukazuje, že ATC může zlepšit změnu ECM související s věkem prostřednictvím regulace exprese MMP-1 a syntézy kolagenu v senescentních fibroblastech (obrázek 4B). Uvádí se, že senescentní sekreční fenotyp (SASP), ve kterém senescentní buňky vylučují specifické prozánětlivé faktory, růstové faktory a proteolytické enzymy, přispívá ke vzniku a progresi onemocnění souvisejících se stárnutím [17–19]. Pozorovali jsme účinek ATC na SASP, zejména na prozánětlivé cytokiny, jako jsou IL-1, IL_6 a IL-8. Jak je znázorněno na obrázku 4C, ATC downreguloval hladiny exprese IL-1, IL-6 a IL-8. To naznačuje, že ATC může vykazovat účinek proti stárnutí prostřednictvím potlačení SASP.

3. Diskuse

Senescentní buňky procházejí charakteristickými morfologickými změnami zahrnujícími zvětšenou a často nepravidelnou reorganizaci jádra a chromatinu. Když je stárnutí indukováno poškozením DNA, replikační deplecí nebo expresí onkogenu, dochází především ke ztrátě Lamin B1. Různé vnitřní nebo vnější stresory mohou spustit dráhu reakce na poškození DNA (DDR) k aktivaci dráhy p53 a/nebo p16INK4A. p16INK4A může inaktivovat Cdk4/6, vést k akumulaci fosforylovaného pRb, narušit regulaci transkripčního faktoru E2F a vyvolat zástavu buněčného cyklu nebo senescence [20,21]. Zvýšená produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) většinou produkovaných dysfunkčními mitochondriemi může vést k buněčné senescenci poškozením DNA a transaktivací senescence signálních drah, včetně p53, p16INK4A a p21Waf1/Cip1 [22].

V této studii jsme zjistili, že exprese nc886 se snižovala se zvyšujícím se počtem pasáží a že upregulace exprese nc886 zmírnila buněčné stárnutí prostřednictvím zprostředkování produkce LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 a ROS. nc886 je u mnoha malignit transkribován RNA polymerázou III (Pol III) a umlčen hypermetylací CpG DNA [8]. Pozorovali jsme, že exprese nc886 byla snížena s methylací CpG ostrůvků v senescentních fibroblastech. Tento výsledek ukazuje, že hypermethylace CpG ostrůvků zhoršuje funkčnost nc886 jako supresoru buněčného stárnutí.

Specifické dráhy genové exprese ovlivněné nc886 jsou nejasné. Pravděpodobně zahrnují dříve hlášené pro jiné ncRNA. nc886 může hrát kritickou roli v buněčném stárnutí prostřednictvím přímého nebo nepřímého zprostředkování signální dráhy senescence na úrovních struktury chromatinu, aktivity transkripčního faktoru, post-transkripční a posttranslační genové regulace [23]. Například nc886 může zprostředkovat senescentní dráhu progrese buněčného cyklu.

Bylo hlášeno, že AK156230 jako ncRNA je spojena s indukcí replikativního stárnutí fibroblastů prostřednictvím své role v autofagii a progresi buněčného cyklu. Downregulace AK156230 indukovala buňky, aby vykazovaly senescenční reakce aktivací p53 a p21 při současném snížení cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1) [24]. ncRNA1 související se stárnutím (SAL-RNA1), MALAT1 a MIAT jsou známé jako negativní regulátory buněčného stárnutí. U senescentních fibroblastů jsou sníženy. Downregulace těchto genů může vést ke zvýšení markerů stárnutí, jako je SAgal, p16, p21 a p53 [25]. Účinek MALAT1 na stárnutí buněk bylo dosaženo prostřednictvím poklesu onkogenního transkripčního faktoru b-Myb/Mybl2.

Ačkoli exprese různých ncRNA je ovlivněna během stárnutí, pouze několik z nich je funkčně zapojeno do stárnutí. Protože lokalizace ncRNA je důležitá pro pochopení mechanismů zapojených do funkce, jaderné a cytoplazmatické ncRNA jsou diskutovány odděleně při popisu molekulárních mechanismů ovlivňujících stárnutí [26]. ncRNA lokalizovaná v cytoplazmě může fungovat jako regulátor translace prostřednictvím párování bází s cílovou mRNA [27]. ncRNA může ovlivnit hladiny exprese proteinů zvýšením nebo snížením stability mRNA [28].

Například během stárnutí indukované RAS přispívá cytoplazmatický UCA1 ke stabilizaci mRNA p16 sekvestrací hnRNPA1 [29]. nc886 obsahuje vazebné místo aktivované RNA proteinkinázou (PKR). Vazba PKR–nc886 může inhibovat aktivitu PKR. PKR, cytoplazmatický receptor pro dvouvláknovou RNA (dsRNA), je regulován serin/threonin proteinkinázou, která je aktivována infekcí, cytokiny, oxidačním stresem a ozářením (včetně UV), což vede k následné indukci zánětu a apoptózy [20 ,21] [30,31]. nc886 se váže na PKR s afinitou srovnatelnou s dsRNA a brání aktivaci PKR. Knockdown nc886 vede k fosforylaci podjednotky eukaryotického iniciačního faktoru 2 (eIF2 ) prostřednictvím dráhy PKR, která způsobuje buněčnou smrt a inhibuje globální syntézu buněčného proteinu. Bylo hlášeno, že produkce COX-2, IL-8 a MMP prostřednictvím TNF- je zprostředkována PKR dráhou v lidských chondrocytech [32].

V předchozí studii jsme také prokázali, že zánět vyvolaný UVB může být regulován prostřednictvím nc886-PKR dráhy v keratinocytech [10]. Kromě toho PKR souvisí s poškozením vyvolaným oxidačním stresem u neonatálních srdečních myocytů. Inhibice PKR chrání před poškozením vyvolaným H2O2- tím, že zmírňuje apoptózu a zánět [33]. Zánět a oxidační stres jsou hlavními faktory, které vyvolávají proces stárnutí. PKR dráha tedy může zprostředkovat buněčnou senescenci fibroblastů indukovanou deplecí nc886. K objasnění podrobného regulačního mechanismu zapojeného do účinku nc886 na buněčnou senescenci fibroblastů jsou zapotřebí další studie.

Účinky extraktu ze zeleného čaje proti stárnutí byly široce popsány v předchozích studiích. Antioxidační a protizánětlivé aktivity zeleného čaje jsou dobře známé mechanismy, které přispívají k jeho účinku proti stárnutí. V předběžném testu jsme zjistili, že ATC významně zvýšilo expresi nc886 o více než 70 procent etanolového extraktu ze zeleného čaje (doplňkový obrázek S1A). Tento výsledek naznačuje, že koncentrované katechiny včetně 3" Me-EGCG mohou přisuzovat upregulaci exprese nc886. Abychom určili, zda by činidlo stimulující nc886 mohlo zabránit stárnutí buněk, pozorovali jsme účinek ATC na senescentní fibroblasty. ATC zvýšilo expresi nc886 inhibice úrovně methylace genu nc886 v senescentních fibroblastech (obrázek 3B, C). ATC také zmírnil stárnutí buněk zprostředkováním senescentních biomarkerů, jako je aktivita SA- -gal, LaminB1, p16INK4A a p21Waf1/Cip1 (obrázek 3E Kromě toho byla pomocí ATC obnovena zvýšená MMP-1 a snížená produkce kolagenu vyvolaná buněčným stárnutím (obrázek 4B). Faktory SASP se mírně liší v závislosti na typu buňky a typu stresu vyvolaného stárnutím. známé jako cílové geny pro NF-κB, které regulují prozánětlivé cytokiny, jako jsou IL-6 a IL-8.

V této studii jsme potvrdili, že zvýšená exprese IL-1, IL_6 a IL-8 v senescentních buňkách byla potlačena ATC (obrázek 4C). Nemůžeme vyloučit možnost, že zlepšujícího účinku zeleného čaje na stárnutí buněk je dosaženo několika mechanismy, včetně regulace nc886, antioxidace a protizánětu. Naše výsledky však naznačují, že zvýšený nc886 pomocí ATC hraje kritickou roli v potlačení buněčného stárnutí, což následně ovlivňuje produkci ECM fibroblastů.

4. Materiály a metody

4.1. Příprava ATC

Sušené listy zeleného čaje (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon č. 3) použité pro tuto studii byly získány z čajových rostlin pěstovaných v čajové zahradě Dolsongi (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Jižní Korea. Suché čajové lístky (170 g) byly extrahovány 70% EtOH (v/v) při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Extrakt byl poté práškován pomocí lyofilizátoru (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Čína). Pro přípravu ATC byl EtOH extrakt desetkrát koncentrován na rotační odparce a nanesen na kolonu naplněnou AB-8 pryskyřicí (vnitřní průměr 5 cm, délka 45 cm). Eluce rozpouštědlem z kolony byla provedena čtyřnásobným objemem lože (BV) 20 procent, 30 procent a 100 procent EtOH (obj./obj.). V této studii byla zbytková rozpouštědla v koloně před elucí odstraněna vzduchovým kompresorem. Eluát 30 procent EtOH byl dvacetkrát koncentrován a nanesen na polyamidovou kolonu (vnitřní průměr 2,5 cm, délka 40 cm). Polyamidová kolona byla eluována 5krát BV 10% a 100% EtOH. Eluát 100% EtOH byl pečlivě zakoncentrován a lyofilizován.

4.2. Buněčná kultura a ošetření buněk ATC

Lidské dermální fibroblasty (HDF) byly zakoupeny od ATCC (Manassas, VA, USA). Buněčná kultura byla prováděna za kontrolovaných podmínek při 37 ◦C s 5 procenty CO2 s použitím Dulbeccova modifikovaného Eagleova média (WELGENE, Daegu, Korea) doplněného 10 procenty fetálního bovinního séra (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a 1 procentem penicilinu -streptomycin (WELGENE, Daegu, Korea). Buňky byly nasazeny do 6-jamkových destiček v hustotě 2 x 105 buněk/destičku. Po dosažení 60% konfluence byly ošetřeny indikovanou koncentrací ATC po dobu 72 hodin.

4.3. SA- -barvení Gal a analýza průtokovou cytometrií

Buňky byly obarveny pomocí SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) podle pokynů výrobce. Buňky byly analyzovány pomocí EVOS® FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a průtokovým cytometrem BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.4. Intracelulární měření ROS

Produkce intracelulárního ROS byla monitorována pomocí C20,70 -dichlordihydrofluorescein diacetátu (H2DCFDA; Molecular Probes), fluorescenčního indikátoru ROS. Buňky byly inkubovány s H2DCFDA (5 uM) po dobu 30 minut při 37 °C. S buňkou asociovaná fluorescence byla detekována průtokovým cytometrem BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

4.5. PCR v reálném čase a PCR specifická pro methylaci

Celková RNA byla extrahována pomocí TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kvantitativní měření RNA bylo provedeno pomocí spektrofotometru Epoch microplate (BioTek, Winooski, VT, USA). cDNA byla syntetizována pomocí am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Genomová DNA byla extrahována pomocí AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Korea). Konverze hydrogensiřičitanu byla provedena pomocí methylačního kitu EZ DNA (Zymo Research, CA, USA). K provedení qRT-PCR byly použity AMPIGENE® cDNA Synthesis Kit (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, USA) a systém ABI7500 real-time PCR (Ambion Inc, Austin, TX, USA). Sekvence primerů použité v této studii jsou popsány v tabulce 1.

4.6. Laktátdehydrogenázový test

LDH test byl použit pro stanovení cytotoxicity měřením aktivity laktátdehydrogenázy (LDH) uvolněné z poškozených buněk. Test byl proveden pomocí soupravy LDH Cytotoxicity WST Assay kit (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) podle pokynů výrobce.

4.7. Transfekce DNA pro nadměrnou expresi nc886 a transfekce siRNA pro Knockdown nc886

Pro získání DNA pro nadměrnou expresi nc886 v buňkách byla DNA amplifikována pomocí AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Korea) s použitím genomové DNA HDF jako templátu a následujících primerů popsaných v tabulce 2.

Amplifikovaná DNA byla purifikována pomocí QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Německo). Purifikovaná DNA byla transfekována činidlem LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pro knockdown nc886 byly buňky transfekovány anti-oligy (si-ctrl a si-nc886) v koncentraci 250 pM za použití činidla Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

4.8. Western blotting

Buněčné lyzáty byly připraveny s PRO-PREP™ Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Korea). Celkové proteiny byly separovány systémem elektroforézy NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a přeneseny na polyvinylidendifluoridové (PVDF) membrány. Imunoblotting byl proveden s použitím primární protilátky proti p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), MMP1, Col1A2 a -actinu (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Skenovací denzitometrické hodnoty pásů byly analyzovány pomocí ImageJ, verze softwaru 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Po indikované inkubaci byly měřeny kolagen (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japonsko) a MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) v kultivačním supernatantu pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA) podle pokynů výrobce.

4.10. Statistická analýza

Všechny výsledky jsou uvedeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). Rozdíly mezi těmito dvěma skupinami byly hodnoceny t-testem nebo analýzou rozptylu (ANOVA) za použití GraphPad Prism. Statistická významnost byla označena buď jako p < 0.05 nebo p < 0,01.

5. Závěry

Závěrem lze říci, že regulace exprese nc886 může být potenciálním cílem buněčného stárnutí ve fibroblastech a ATC může být silnou epigenetickou složkou proti stárnutí.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, YK, KH a EJ; metodologie YK, HJ, N.-HP a K.-SL; zpracování dat, YK, HJ a EC; vyšetřování, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP a EJ; administrace projektu, WP, DP a EJ; zdroje, WP a DP; dohled, DP a EJ; psaní — původní návrh, YK; psaní – recenze a úpravy, N.-HP, KH, WP, DP a EJ Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.

Financování:

Tento výzkum nezískal žádné externí financování.

Prohlášení institucionální revizní komise:

Nelze použít.

Prohlášení o informovaném souhlasu:

Nelze použít.

Prohlášení o dostupnosti dat:

Údaje budou zpřístupněny na vyžádání.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Buněčné stárnutí: Když se dobrým buňkám dějí špatné věci. Nat. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Stárnutí: Přístupy k jeho kontrole. Drug Discov. Dnes Ther. Strategie. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Baťa-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Mechanismy fotostárnutí a chronologického stárnutí pleti. Oblouk. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; a kol. Charakteristické znaky stárnutí fibroblastů. Mech. Aging Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Epigenetika stárnutí a nemocí souvisejících se stárnutím. J. Gerontol. Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Genetika a epigenetika stárnutí a dlouhověkosti. Buněčný cyklus 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Prekurzor miR-886, nová nekódující RNA potlačená u rakoviny, se spojuje s PKR a moduluje její aktivitu. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Píseň, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; a kol. Epigenetická regulace transkripcí RNA polymerázy III v časné tumorigenezi prsu. Oncogene 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Im, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, nekódující RNA, inhibuje UVB-indukovanou expresi MMP-9 a COX{5}} prostřednictvím dráhy PKR v lidských keratinocytech. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Inhibice UVB-indukovaného zánětu extraktem Laminaria japonica prostřednictvím regulace nc886-PKR dráhy. Živiny 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Identifikace epigalokatechin-3-O-(3-Omethyl)-galátu (EGCG300Me) a profilů aminokyselin v různých kultivarech čaje (Camellia sinensis L.). Data Brief. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Antioxidační a cytoprotektivní účinky (-)-epigalokatechin-3-(300-O-methyl)galátu. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Účinky extraktu ze zeleného čaje na ženy s nadváhou a obezitou s vysokou hladinou lipoproteinového cholesterolu s nízkou hustotou (LDL-C): Randomizovaná, dvojitě zaslepená a zkřížená placebem kontrolovaná klinická studie. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Orální interakce mezi flavanolovým extraktem ze zeleného čaje a antokyanovým extraktem z červeného vína pomocí nového modelu založeného na buňkách: Pohledy na účinek různých ústních epitelů. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Krizhanovsky, V. Cesta ECM stárnutí ve stárnutí: Komponenty a modifikátory. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Chronická léčba resveratrolem zlepšuje adhezi buněk a zmírňuje zánětlivý fenotyp u senescentních lidských fibroblastů. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Sun, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Sekreční fenotypy spojené se stárnutím odhalují buněčné neautonomní funkce onkogenního RAS a supresoru tumoru p53. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Buněčné stárnutí a senescentní sekreční fenotyp: Terapeutické příležitosti. J. Clin. Vyšetřování. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Buněčné stárnutí: Od fyziologie k patologii. Nat. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; a kol. Zásadní funkce histondeacetylázy 1 při kontrole proliferace a potlačení inhibitoru CDK. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Role matricových metaloproteináz ve stárnutí: tkáňová remodelace a mimo ni. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, S.; Passos, JF Detekce druhů reaktivního kyslíku v senescentních buňkách. Metody Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs Regulatory Networks in Cellular Senescence. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, MY; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Identifikace lncRNA, AK156230, jako nového regulátoru buněčného stárnutí v myších embryonálních fibroblastech. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Wood, WH, 3.; Becker, KG; a kol. lncRNA spojené se stárnutím: dlouhé nekódující RNA spojené se stárnutím. Stárnoucí buňka 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Vznikající role lncRNA při stárnutí. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; a kol. Dlouhá nekódující antisense RNA řídí translaci Uchl1 prostřednictvím vložené repetice SINEB2. Příroda 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; a kol. Řízení diferenciace somatických tkání pomocí dlouhé nekódující RNA TINCR. Příroda 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Koordinovaná kontrola stárnutí pomocí lncRNA a nového komplexu korepresoru T-box3. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Ztráta Lamin B1 je biomarker spojený se stárnutím. Mol. Biol. Buňka 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Kinase to Remember. Přední. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL Aktivace PKR způsobuje zánět a sekreci MMP-13 v lidských degenerovaných kloubních chondrocytech. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Muži, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Inhibice PKR chrání před poškozením vyvolaným H2O2 - na neonatálních srdečních myocytech zmírněním apoptózy a zánětu. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1, Hyanggi Ji 1, Eunae Cho 1, Nok-Hyun Park 2, Kyeonghwan Hwang 2, Wonseok Park 2, Kwang-Soo Lee 1, Deokhoon Park 1 a Eunsun Jung 1,*.

1 Biospectrum Life Science Institute, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Korea; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EC); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Divize základního výzkumu a inovací, Centrum výzkumu a vývoje Amorepacific Corporation, Youngin-si 17074, Korea; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com