Nanozymový hydrogel pro zvýšenou tvorbu alkylových radikálů a účinnou protinádorovou terapii†

Alkylové radikály (Rc), které se nespoléhají na tvorbu kyslíkubuněčný stres, byly použity vléčba nádorůale velké množství glutathionu (GSH) v nádorových buňkách reaguje s alkylovými radikály, čímžsnížení jejich protinádorového účinku. V této studii, vylepšený systém tvorby alkylových radikálů reagující nablízké infračervené světlobyl navržen. Alkylový radikál spouští 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (AIPH) a enzym pyrit (FeS2) byly zapouzdřeny v agarózovém hydrogelu za účelem přípravy AIPH–FeS2–hydrogelový (AFH) systém. FeS2 lze použít jako fototermální činidlo pro přeměnu energie blízkého infračerveného světla na tepelnou energii, což vede k rozpuštění hydrogelu. AIPH je současně indukován k produkci alkylových radikálů. FeS2 lze také použít jakozesilovač oxidačního stresuke snížení intracelulárního obsahu GSH, čímž se zesílí terapeutický účinek alkylových radikálů. Nakonec mohou volné radikály nezávislé na kyslíku generované systémem AFH při blízkém infračerveném laserovém ozařování a fototermálním ošetřenízabíjet rakovinné buňkyprostřednictvím synergickéhooxidace/fototermální efekt. Zde vyvinutý systém AFH poskytuje nový pohled na posílení terapeutického účinku alkylových radikálů.

KLIKNĚTE ZDE, ABY VĚDĚTE JAK CISTANCHE PROTI RAKOVINĚ

Úvod

V posledních letech se léčba založená na volných radikálech, jako je fotodynamická terapie, takže nedynamická terapie a elektrodynamická terapie stala populární volbou pro léčbu rakoviny prsu.1–3 Externí stimuly (laser, ultrazvuk, elektrická pole) podporují produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), které indukují buněčnou smrt tím, že způsobují vážné oxidační poškození nebo dysfunkci buněčného metabolismu.4–6 Bohužel hypoxické prostředí nádoru a rychlá proliferace nádorových buněk snižují terapeutické výsledky takových léčebných postupů, které jsou závislé na produkci ROS, zejména léčbě pevných nádorů.7–10 Alkylové radikály jsou novým typem volných radikálů, které nezávisí na tvorbě kyslíku, aby zabíjely buňky, a bylo prokázáno, že jsou účinné při léčbě nádorů v normoxickém a hypoxickém prostředí.11 Uvolňovaný alkyl Radikály mohou vyvolat apoptózu rakovinných buněk zvýšením oxidačního stresu, což vede k poškození buněčných lipidů a DNA. Jako typický iniciátor volných radikálů může 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (AIPH) vytvářet alkylové radikály při vysokých teplotách. 12 Činí tak i v nepřítomnosti kyslíku. Vytvořené volné radikály jsou pro buňky toxické a budou okamžitě oxidovat buněčné elementy nebo interagovat s kyslíkem za vzniku sekundárních toxických látek.13 I v hypoxickém nádorovém mikroprostředí může AIPH produkovat alkylové radikály ke zvýšení intracelulárního hydroperoxidu lipidů a dále spouštět apoptózu nádorových buněk.14 To vše naznačuje, že Rc je slibný lék na léčbu rakoviny.

Při fototermální terapii se jako vnější stimul používá světlo nebo teplo.15–17 Fototermální terapie (PTT) založená na blízkém infračerveném (NIR) laserovém ozařování se používá k prevenci agregace nádorových buněk; k odstranění nádorů se spoléhá na lokální tepelné účinky.18–20 Několik fototermálních činidel (PTA), jako jsou nanokrystaly zlata a sirník molybdeničitý, se používá v kombinaci s AIPH k uvolnění alkylových radikálů v reakci na infračervené laserové záření.19,21–23 nádorové mikroprostředí (TME) má obvykle vysokou úroveň exprese glutathionu (GSH) v solidních nádorech, protože GSH hraje důležitou roli v odolnosti proti radioterapii prostřednictvím spontánní reakce nebo reakce katalyzované GSH S transferázou s xenogenními.24,25 Kromě toho, jako redukční činidlo může GSH přímo odstraňovat alkylové radikály.21,26 To snižuje účinnost terapií na bázi alkylových radikálů. Nanoenzym pyrit (FeS2), jako nový fototermální nanomateriál, má nejen dobrý fototermální účinek pod NIR světlem, ale má také nanoenzymovou aktivitu.27 Nanaza FeS2 prokázala podobnou aktivitu jako glutathionoxidáza (GSH OXD), oxiduje GSH na oxidovaný glutathion (GSSG).28 V TME bylo zjištěno, že deplece GSH narušuje REDOXní rovnováhu buněk a způsobuje oxidační stres.29 Proto se očekává, že FeS2 dosáhne dobrého synergického účinku s AIPH.

Minimálně invazivní fotoresponzivní hydrogely se v poslední době staly populárními jako platforma s řízeným uvolňováním léčiva.30–32 Hydrogely koagulují, když jsou injikovány do nádorové tkáně a slouží jako dlouhodobý depot.33 Tuto topickou formu podání lze opakovat po jedné injekce. Kromě toho lze parametry, jako je výkon laseru a doba ozařování, upravit tak, aby se změnila rychlost uvolňování léčiva, čímž se rozšířila použitelnost této léčebné metody.34,35 Vzhledem k těmto výhodám se předpokládalo, že použití hydrogelů k dodávání FeS2 a AIPH k TME by zlepšily účinnost terapií založených na volných radikálech.

V této studii byla navržena metoda využívající intratumorální aplikaci injekčního hydrogelu obsahujícího enzym FeS2 a iniciátor volných radikálů AIPH. Nejprve byl připraven hybridní systém AIPH-FeS2-hydrogelu (AFH) vložením nanočástic FeS2 a AIPH do agarózového hydrogelu. Hydrogel je pevný při pokojové teplotě a FeS2 a AIPH jsou zapouzdřeny v jeho matrici. Po ozáření blízkým infračerveným (NIR) světlem přemění FeS2 světelnou energii NIR na tepelnou energii, která způsobí zahřátí systému AFH a poté se hydrogel roztaví a uvolní FeS2 a AIPH. Při vysokých teplotách se AIPH rozkládá za vzniku alkylových radikálů. Následně enzym FeS2, který napodobuje aktivitu GSH-OXD, snižuje intracelulární obsah GSH. Zničení GSH podpoří zabíjející účinek alkylových radikálů. Protože AFH může sídlit v místě nádoru po dlouhou dobu, může systém AFH umožnit přesnou kontrolu nad uvolňováním alkylových radikálů změnou intenzity laseru a doby záření. Konečně volné radikály nezávislé na kyslíku generované systémem AFH při ozařování NIR a fototermální léčbě mohou synergicky zabíjet rakovinné buňky prostřednictvím synergického oxidačně/fototermálního účinku a růst nádoru během léčebného cyklu je dobře obydlený. Stručně řečeno, zde navržený AFH systém dále zesiluje terapeutický účinek AIPH změnou redoxní homeostázy (schéma 1).

Výsledky a diskuse

K přípravě kompozitního hydrogelu obsahujícího FeS2 a AIPH byl použit nízkotající agarózový hydrogel. FeS2 byl smíchán s vodným roztokem agarózy při 60 C a poté naplněn alkylovým radikálem spouštěcím AIPH, následovalo rychlé ochlazení na pokojovou teplotu. Vznikla tak hydrogelová matrice AFH. K charakterizaci morfologie FeS2 byla použita transmisní elektronová mikroskopie (obr. 1A). FeS2 nano zyme vykazoval kulovitou morfologii s průměrnou velikostí částic asi 148 nm (obr. S1†). UV-vis absorpční spektra FeS2 (obr. 1B) ukázala, že FeS2 byl silně absorbován v oblasti NIR při 80}8 nm. Díky této vlastnosti je FeS2 dobrým PTA. Fototermální výkon enzymu FeS2 při různých koncentracích (0, 25, 50 a 100 mg ml 1 ) byl studován ozařováním roztoku laserovým systémem 0,5 W cm 2 808 nm (obr. 1C). Zahřívací účinek roztoku byl přímo úměrný koncentraci FeS2. Teplota 100 mg ml 1 roztoku FeS2 se zvýšila asi o 17,5 C za pouhých 5 minut laserového ozařování, což dokazuje dobrý fototermický výkon FeS2. Skenovací elektronová mikroskopie také ukázala, že hydrogel AFH má složitou síť struktury pórů a distribuce velikosti pórů (obr. 1D), díky čemuž je hydrogel vhodný pro aplikaci léčiva. Fototermální stabilita je také důležitým kritériem pro hodnocení kvality PTA.36 Roztok 200 mg ml 1 FeS2 byl zahříván 808 nm NIR laserem po dobu 5 minut, poté byl laser vypnut a roztok FeS2 byl ponechán vychladnout. přirozeně na pokojovou teplotu. Tento proces byl několikrát opakován, aby se vyhodnotila fototermická stabilita FeS2 (obr. 1E). Nebyla patrná žádná změna v křivce ohřevu každého fototermálního cyklu a byl pozorován pouze nepatrný rozdíl v maximální teplotě dosažené po 5 minutách ozařování, což ověřilo fototermickou stabilitu FeS2. Reologická analýza také odhalila vysoký skladovací modul připraveného hydrogelu v pevném stavu při pokojové teplotě (obr. 1F). S rostoucí teplotou hydrogel postupně socénoval a rozpouštěl se a akumulační modul se postupně snižoval. Dále byl proveden experiment fototermálního rozpouštění na hydrogelu FeS2. Ztuhlý AFH (FeS2 obsažený v hydrogelu) byl umístěn do skleněné misky obsahující deionizovanou vodu. Při pokojové teplotě si připravený hydrogel AFH udržel svůj ztuhlý tvar, ale po 10 minutách ozařování laserem 808 nm se hydrogel téměř úplně rozpustil a nanomateriál FeS2 se uvolnil a rozpustil ve vodě ve skleněné misce (obr. 1G). Výrazné zvýšení teploty AFH během ozařování potvrdila i termokamera (obr. 1H). Spektrum rentgenové fotoelektronové spektroskopie (XPS) FeS2 po reakci s hydrogelem ukázalo, že FeS2 obsahuje prvky Fe a S (obr. S2†). Jak je znázorněno na obr. S3,† obsah GSH byl významně snížen po společné inkubaci FeS2 a GSH, má pozitivní korelační křivku s časem a koncentrací. Kromě toho aktivita FeS2 podobná POD byla závislá na velikosti. Nanozymy o velikosti 150 nm vykazovaly vyšší aktivitu než nanozymy o velikosti 280 a 687 nm (obr. S4†).

Na základě vysoce výkonných charakteristik AFH byly hodnoceny jeho protinádorové účinky. Zpočátku byla k prozkoumání zabíjejícího účinku připraveného hydrogelu AFH v kombinaci s ozařováním NIR použita souprava pro barvení živých/mrtvých buněk fluorescein diacetát/propidium jodid. Skupina PBS plus NIR a skupina pouze s AFH vykazovala silnou zelenou fluorescenci, zatímco AIPH téměř nevykazovala žádný zabíjející účinek (obr. 2A). Pro ověření relativních výsledků experimentů jsme připravili hydrogel obsahující pouze FeS2 (FH). Připravený hydrogel obsahující pouze FeS2 (FH) v kombinaci s NIR měl mírný zabíjející účinek. Nejlepší cytotoxický účinek mělo zejména ošetření AFH plus NIR.

Dichlorfluorescein diacetátová sonda byla použita k detekci schopnosti AIPH produkovat ROS. AIPH vykazoval slabší schopnost indukovat ROS v nepřítomnosti laserového ozařování, zatímco FH naplněný FeS2 vykazoval střední stupeň produkce ROS po ozáření NIR (obr. 2B). Jasně zelená fluorescence pozorovaná ve skupině léčené AFH plus NIR lze připsat uvolňování FeS2 a AIPH po laserovém ozáření (obr. 2C). Kromě toho skupiny AIPH a AIPH plus NIR vykazovaly velmi malou zelenou fluorescenci (obr. S5†). Test CCK-8 také ukázal stejné výsledky. Životaschopnost buněk ve skupině AFH plus NIR byla asi 8,5 procenta, což se významně lišilo od životaschopnosti ostatních skupin (obr. 2D). Vysoká teplota podpoří rozklad AIPH za vzniku alkylových radikálů. Současně může FeS2 vykazovat aktivitu GSH-OXD ke snížení intracelulárního GSH. GSH, jako všudypřítomný tripeptid obsahující thiol, je syntetizován ze svých základních aminokyselin (kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu) v mnoha buňkách. GSH je hojně produkován v různých typech rakovinných buněk. GSH v buňkách obecně existuje v redukované formě, která může reagovat s oxidačními látkami, jako jsou alkylové skupiny, přičemž se oxiduje na svou oxidovanou formu glutathion disulfid (GSSG), čímž se snižuje protinádorový účinek založený na volných radikálech.37 Deplece GSH naruší redoxní rovnováhu buněk, způsobí oxidační stres a nakonec povede k buněčné apoptóze.38 Ellmanovo činidlo bylo použito k testování schopnosti každé skupiny vyčerpat GSH. AFH kombinovaná skupina NIR vykazovala nejlepší schopnost deplece GSH (obr. 2E).

Schéma 1 Nanozymový hydrogel pro zvýšenou tvorbu alkylových radikálů a účinnou protinádorovou terapii

Obr. 1 (A) TEM snímek FeS2. (B) UV-Vis-NIR absorbanční spektrum roztoku FeS2. (C) Zahřívací křivky pro různé koncentrace roztoků nanočástic FeS2 po ozáření laserem při 808 nm (0,5 W cm 2 ) po dobu 5 min. (D) SEM snímek hydrogelu. (E) Změny teploty roztoku FeS2 při cyklickém ozařování laserem. (F) Reologické a teplotní křivky (červená a černá, v tomto pořadí) pro připravený AFH v reakci na ozáření laserem 0,5 W cm 2 808 nm. (G) Morfologie připraveného AFH před a po 0,5 W cm 2 808 nm laserovém ozáření po dobu 10 min a (H) infračervené termosnímky připraveného AFH po ozáření.

Vzhledem k jeho dobré výkonnosti in vitro jako enzymu napodobujícího PTA a GSH OXD byl účinek AFH na přeměnu světla na teplo NIR studován in vivo. Myším BALB/c byly subkutánně injikovány buňky 4T1 za vzniku nádorů. Obr. 3A ukazuje křivku změny teploty skupiny PBS a skupiny AFH po ozáření 808 nm NIR laserem 0,5 W cm2 po dobu 10 minut. Teplota skupiny AFH se po ozáření zvýšila asi o 17,6 C, zatímco teplota skupiny PBS se téměř nezvýšila. Vysoká teplota může změnit vlhkost membrány nádorových buněk, a tím zvýšit propustnost buněčné membrány, což následně způsobí tepelné poškození proteinů.39,40 Nakonec rakovinné buňky ztratí schopnost proliferovat. Dále byla hodnocena protinádorová aktivita zprostředkovaná AFH u myší nesoucích nádor 4T1. Myši nesoucí nádor byly náhodně rozděleny do pěti skupin. Objem nádoru u myší ve skupině PBS plus NIR a skupině AIPH se během dvoutýdenního léčebného období rychle zvýšil a skupina AFH vykazovala mírný supresorový účinek nádoru (obr. 3C). Bylo to proto, že agaróza se pomalu metabolizovala a některé léky se pomalu uvolňovaly. Skupina AFH plus NIR měla nejsilnější vliv na růst nádoru. Během léčby byl objem nádoru u myší významně potlačen. Po období léčby byly myši usmrceny a nádory byly izolovány a zváženy. Výsledky pro hmotnost nádoru byly v souladu s výsledky pro objem nádoru (obr. 3D).

Důležité je, že během celé studie nebyly v léčebné skupině pozorovány žádné změny tělesné hmotnosti, což ukazuje, že léčba nezpůsobila u myší žádnou významnou systémovou toxicitu (obr. S6†). Tento výsledek je velmi povzbudivý, protože ačkoli mnoho materiálů vykazovalo dobré experimentální výsledky, způsobily také vážné vedlejší účinky, které vážně omezovaly jejich klinické vyhlídky.41,42 20 ,70 - Dichloruorescin diacetát byl použit k měření intra -generace nádorových ROS u léčených myší. Barvení bylo významně zesíleno u nádorů podrobených kombinované terapii AFH plus NIR (obr. 3E). Zvýšená produkce volných radikálů vedla ke zvýšenému terapeutickému účinku na zvířecím modelu. K ověření buněčné apoptózy a proliferace byly použity analýzy TUNEL a Ki{6}} (obr. 3E). Nádorové tkáně ve skupině AFH plus NIR byly masivně nekrotické bez významné proliferace.

Obr. 3 (A) Infračervené termální snímky nádorů po ozáření 808 nm laserem (0,5 W cm2) po dobu 10 min v uvedených léčebných skupinách. (B) Zvýšení teploty u myší s implantovanými nádory 4T1 po 808nm laserovém ozáření (0,5 W cm2) po dobu 10 minut v uvedených léčebných skupinách. (C) Změny objemu nádoru v průběhu času ve skupinách léčených, jak je uvedeno. (D) Průměrné hodnoty hmotnosti nádoru spojené s indikovanou léčbou. (E) ROS, Ki-67 a TUNEL barvené řezy nádorů z uvedených léčebných skupin. **P < 0,01, ***P < 0,005; Studentův t-test.

Po léčbě životně důležité orgány (srdce, játra, slezina, plíce a ledviny) neměly žádný zánět ani poškození. Jaterní a ledvinové indexy byly normální (obr. 4A–D a S7†). Komplexní experimentální data in vivo ukazují, že synergická terapie AFH a PTT má dobré terapeutické účinky a biokompatibilitu. V budoucnu má dobré vyhlídky pro klinické lékařské aplikace.

Obr. 4 Výsledek bezpečnostních experimentů in vivo. Biochemické údaje krve včetně markerů funkce ledvin: (A) markery jaterních funkcí: CRE, (B) BUN a (C) ALT po různých léčbách. (D) Výsledky histopatologické analýzy (obrázky barvené H&E) hlavních orgánů, srdce, plic, jater, ledvin a sleziny myší, které byly vystaveny různé léčbě 16 dní po injekci. Měřítko: 100 mm.

Závěr

Navrhli jsme injekční fotocitlivý hydrogel, který může současně dosáhnout terapie volnými radikály a PTT zapouzdřením enzymu FeS2 a zdroje alkylových radikálů AIPH do agarózového hydrogelu. Při 808 nm laserovém záření PTA FeS2 podporuje zahřívání systému AFH a vede k uvolňování AIPH a jeho rozkladu za vzniku alkylových radikálů. Současně může FeS2 snižovat intracelulární obsah GSH, a tím dále ničit redoxní homeostázu. Rychlost rozpouštění hydrogelu lze měnit parametry, jako je hustota výkonu laseru a velikost bodu. Studie in vivo i in vitro ukázaly, že kombinací AFH s ozařováním NIR lze dosáhnout silných účinků zabíjení nádorů s nevýznamnými nežádoucími účinky. Hydrogelový systém navržený v této studii poskytuje strategii pro posílení terapeutických systémů založených na alkylových radikálech.

Reference

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo a BZ Tang,Adv. Sci., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang a F.-B. Wang,Nanoměřítko, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He a Z. Qian,Brada. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai a S. Xu,J. Nanobiotechnol., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li a BZ Tang,Biomateriály, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li a X. Wang,Nano Res., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang a K. Li,J. Mater. Chem. B, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan a GG Qiao,ACS Nano, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia a K. Li,Biomateriály, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu a C. Gong,Brada. Chem. Lett., 2021, DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.