Metaanalýzy identifikují methylaci DNA spojenou s funkcí a poškozením ledvin

edmund.chen@wecistanche.com

Chronickýnemoc ledvinje velkou zátěží pro veřejné zdraví. Měřítkem je zvýšený poměr albuminu ke kreatininu v močipoškození ledvin,a používá se k diagnostice a stádiu chronickénemoc ledvin. Rozšířit znalosti o regulačních mechanismech souvisejícíchfunkce ledvina onemocnění jsme provedli celokrvní asociační studii pro odhadovanou rychlost glomerulární filtrace (n=33,605) a poměr albuminu ke kreatininu v moči (n=15,068) a detekovali jsme 69 a sedm míst CpG, kde byla methylace DNA spojena s příslušným znakem. Většina těchto nálezů ukázala přímo konzistentní asociace s příslušnými klinickými výsledky chronického onemocněnínemoc ledvina středně zvýšená albuminurie. Asociace methylace DNA sfunkce ledvin, jako jsou CpG na JAZF1, PELI1 a CHD2 byly validovány vledvinová tkáň. Methylace na PHRF1, LDB2, CSRNP1 a IRF5 ukázala kauzální účinky nafunkce ledvin. Analýzy obohacení odhalily dráhy související s hemostázou a migrací krevních buněk pro odhadovanou rychlost glomerulární filtrace a aktivaci imunitních buněk a odpověď na CpG spojené s poměrem albuminu ke kreatininu v moči.

klíčová slova:nemoc ledvin; poškození ledvin; funkce ledvin; ledvinová tkáň; struktura ledvin

chronickýnemoc ledvin(CKD) představuje velkou zátěž pro veřejné zdraví. Postihuje více než 10 procent dospělých na celém světě a více než 40 procent osob ve věku 70 let a starších1,2. CKD je celosvětově hlavní příčinou úmrtí3 a je hlavním přispěvatelem kardiovaskulární morbidity a mortality2,4,5. CKD je definován jako trvalá přítomnost abnormalitledvinastruktura nebo funkce. Thefunkce ledvinnejčastěji používanými měřítky jsou rychlost glomerulární filtrace, obvykle odhadovaná z koncentrací kreatininu v séru (eGFR) a poměr albuminu ke kreatininu v moči (UACR)6. Zvýšené UACR je měřítkempoškození ledvin, který se používá k diagnostice a stádiu CKD7 a je spojen s diabetem a hypertenzínemoc ledvin8. I mírně zvýšená UACR je nezávisle na jiných rizikovým faktorem kardiovaskulárních onemocněnífunkce ledvin markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 genetických lokusů, které jsou spojeny sfunkce ledvin10,12,13. Varianty indexu na známých lokusech spojených s eGFR vysvětlují odhadem 8,9 procenta rozptylu eGFR12.Nedávná metaanalýza GWAS eGFR integrovaných oblastí otevřeného chromatinu s malými sadami jednonukleotidových polymorfismů (SNP)10. Výsledky této studie podporují význam změněné transkripční regulace jako mechanismu přispívajícího k CKD. Prozkoumat metylaci DNA, s ohledem nafunkce ledvinbyly provedeny epigenomové asociační studie (EWAS) eGFR a CKD. Jako klíčový regulátor transkripce, který lze hodnotit nákladově efektivním a vysoce výkonným způsobem, byla methylace DNA studována na místech CpG (CpGs) s rozlišením jedné báze. Dříve jsme provedli EWAS zahrnující 4859 dospělých ze dvou populačních studií a identifikovali jsme 18 validovaných, odlišně metylovaných míst v plné krvi spojených s eGFR14. Ačkoli tato studie odhalila vhled do mechanismů regulace genůledvinasouvisející CpG vysvětlily pouze 1,2 procenta rozptylu eGFR. Jiné předchozí studie byly zaměřeny na pacienty s CKD a/nebo pacienty s diabetem nebo pacienty s infekcí virem lidské imunodeficience, nebo byly omezeny malou velikostí vzorku, nedostatečnou replikací, chybějící úpravou pro potenciální zmatky nebo jejich kombinací14–19. Další studie se zaměřily na vzorce metylace DNA u diabetikůnemoc ledvin(DKD) pacienti20–22.

CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL

Zde jsme provedli EWASfunkce ledvinvlastnosti k identifikaci dalších CpG souvisejících s genovými regulačními mechanismy, které jsou potenciálně důležité pro CKD. Rozšířili jsme dřívější EWAS pro eGFR a CKD podstatným zvýšením velikosti vzorku na 33 605 jedinců. Navíc jsme jako další znaky zahrnuli UACR a mírně zvýšenou albuminurii (mikroalbuminurii). EWAS byly provedeny v převážně populačních studiích přizpůsobených pohlaví, věku, diabetu, hypertenzi, indexu tělesné hmotnosti (BMI), kouření a nejhojnějšímu podílu bílých krvinek. Replikovali jsme naše výsledky EWAS v samostatných vzorcích, dali jsme do souvislosti místa CpG s úrovněmi genové exprese v různých tkáních, aplikovali jsme zjištění na klinické výsledky a hodnotili kauzalitu mezi methylací DNA afunkce ledvin(Doplňkový obr. 1).

Výsledek

Charakteristiky studijního vzorku. V tomto šetření přispělo 36 studií s celkovým počtem 33 605 účastníků k EWAS eGFR a 15 068 k EWAS UACR. Jejich souhrnné charakteristiky jsou uvedeny v tabulce 1 a popisy jednotlivých studií jsou uvedeny v doplňkových datech 1 a 2.

EWAS eGFR a UACR.Zkoumali jsme asociaciledvinarysy s metylací DNA v krvi při až 441 870 CpG, překrývání CpG pokrytých čipem Illumina MethylationnEPIC BeadChip a polem Illumina HumanMethylation450 BeadChip, které byly použity pro měření ve všech studiích kromě jedné (doplňková data 3). Všechny studie provedly čištění dat pole a použily centrálně vyvinuté skripty pro přípravu souboruledvinahodnoty vlastností, které se následně vztahovaly k methylaci DNA pomocí lineárních regresních modelů upravených pro kovariát s hodnotami methylace jako závislou proměnnou podle předem specifikovaných protokolů studie (viz Metody). Ve studii EWAS jsme nepozorovali žádnou nebo jen malou inflaci (průměrná inflace eGFR=1.00, střední inflace UACR=1.00, doplňková data 1 a 2). V trans-etnickém EWAS upraveném na mnoho proměnných bylo 69 CpG významně asociováno s eGFR a replikováno (obr. 1A, doplňková data 4, viz metody), včetně dříve hlášených14. Replikovaná místa vykazovala jasný vzor nižší methylace (60 CpG, Pbinom=2.2E−10; obr. 1A).

Obr. 1 Výsledky EWAS eGFR a UACR. Chicago grafy výsledků epigenomové asociační studie (EWAS) pro odhadovanou rychlost glomerulární filtrace (eGFR) (A) a poměr albuminu ke kreatininu v moči (UACR) (B) pomocí kombinovaného vzorku pro objev a replikaci. Místa jsou uspořádána podle jejich chromozomální pozice na ose x, s jejich –log10 P-hodnotou asociace Wald-test poskytnutou na ose y. CpG pozitivně korelující se znakem jsou vyneseny v horní části, místa s negativní korelací v dolní části. Tečkované vodorovné čáry představují hladinu významnosti (P-hodnota < 1,1e−7).="" místa="" nových="" replikací="" jsou="" zbarvena="" oranžově,="" známá="" replikovaná="" místa="" jsou="" zbarvena="" tyrkysově="" a="" místa,="" která="" byla="" navíc="" spojena="" s="" příslušným="" binárním="" znakem="">nemoc ledvin[CKD]/ mikroalbuminurie [MA]) jsou označeny křížkem.

V metaanalýze byly nejnižší P-hodnoty pozorovány u známých asociací eGFR včetně cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-hodnota=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, P-hodnota=3.2E−24) a cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-hodnota=8 .7E−20)14, následovaný novým nálezem na cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, hodnota P=1.1E−17). 69 replikovaných CpG spojených s eGFR samotných vysvětlilo 15,7 procenta variace eGFR v samostatném vzorku 1888 účastníků (viz Metody). Po přidání všech proměnných (pohlaví, věk, diabetes, hypertenze, BMI, kouření a podíly bílých krvinek) do asociačního modelu se celkový podíl vysvětleného rozptylu v eGFR zvýšil na 36,3 procenta, přičemž 2,4 procenta variace přisuzována 69 CpG nezávisle na ostatních kovariátech.

V transetnické analýze UACR bylo sedm CpG významně asociováno a replikováno (obr. 1B, doplňková data 5, viz Metody). Z nálezů cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-hodnota=2.6E−13) a cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, P-hodnota=9.9E−13) měla nejmenší asociační P-hodnoty metaanalýzy. U šesti ze sedmi CpG byla nižší metylace spojena s vyšší UACR. Vzhledem k počtu replikovaných míst byla síla binomického testu omezená (6 CpG, pbinom=0.13; obr. 1B). Replikované CpG vysvětlily 3,9 procenta a úplný model 14,6 procenta variace v úrovních UACR, přičemž 0,07 procenta bylo připsáno CpG nezávisle na ostatních kovariátech.

Mezi replikovanými EWAS a dříve hlášenými lokusy GWAS bylo nízké překrývání jak pro eGFR (překrytí=10 ze 69; doplňková data 4), tak pro UACR (překrytí=1 ze 7; doplňková data 5). Nedošlo k žádnému překrývání replikovaných CpG mezi eGFR a UACR, což ukazuje na profily metylace DNA v krvi specifické pro daný rys. Dokonce i mezi 967 a 270 sugestivními asociacemi (P-hodnota < 1e−05)="" kombinované="" metaanalýzy="" vzorku="" objevu="" a="" replikace="" pro="" egfr="" a="" uacr,="" v="" tomto="" pořadí,="" se="" mezi="" oběma="" vlastnostmi="" překrývalo="" pouze="" 10="" míst.="" podrobné="" výsledky="" z="" těchto="" metaanalýz="" pro="" všechny="" sugestivní="" asociace="" jsou="" uvedeny="" v="" doplňkových="" datech="" 6="" (egfr)="" a="" 7="">Heterogenita předků a robustnost nálezů. Abychom vyhodnotili, zda výsledky asociace na eGFR a UACR mohou být řízeny konkrétním původem, provedli jsme metaanalýzu EWAS s předky stratifikovaných vzorků evropských předků (EA) a afroamerických předků (AA) s výsledky z mnoha studií přispívajících k těmto dvěma etnika. Porovnání výsledků asociace replikovaných CpG ve vzorcích EA (Negar=23,671; nUACR=9806) se vzorky AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) v nebo do 50 bp od 69 replikovaných CpG bylo hodnoceno, aby se vyhodnotilo, zda přítomnost SNP může ovlivnit vazbu sondy. Čtyři sondy byly umístěny v blízkosti společného SNP (doplňková data 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), která však nebyly spojeny s žádnou vlastností GWAS podle zdroje PhenoScanner V2 (přístup 2. 12. 2021, pGWAS < 5e−8,="" včetně="" proxy="" snp="" s="" eur="" r²=""> 0,8)23. To naznačuje, že výsledky EWAS pravděpodobně nebudou zkresleny společným rysem, o kterém je známo, že se ho týkáfunkce ledvinblízkou variací sekvence DNA. Bylo zjištěno, že vnitřní SNP sondy, které byly více než pět bází od 3'-konce sondy, mají zanedbatelný význam24.

Vztah k CKD a mikroalbuminurii.Z 69 CpG spojených s eGFR bylo 53 také spojeno s převládajícím CKD v metaanalýze 25,609 jedinců včetně 2376 případů s konzistentním směrem účinku (hodnota P < 0.="" 05/69;="" doplňková="" data="" 4,="" doplňkový="" obr.="" 3a).="" korelace="" mezi="" účinky="" egfr="" a="" ckd="" byla="" vysoká="" (r="−0,93;" obr.="" 3a).="" v="" nezávislé="" kohortě="" 551="" pacientů="" s="" ckd="" bylo="" 65="" cpg="" přímo="" konzistentních="" s="" metaanalýzou="" egfr="" a="" pět="" replikovaných="" (p-hodnota="">< 0,05/69,="" r="0,77;" doplňkový="" obrázek="" 4,="" doplňková="" data="" 4,="" viz="" metody).="" ve="" stejné="" kohortě="" byly="" cpg="" spojené="" s="" egfr="" cg18194850="" (p-hodnota="1.6E−5)" a="" cg07242931="" (p-hodnota="2.3E−5)" také="" spojeny="" s="" časem="">selhání ledvinnebo akutníporanění ledvin(Doplňková data 8, viz Metody). Všech sedm CpG asociovaných s UACR bylo také významně spojeno s mikroalbuminurií u vzorku 7279 jedinců včetně 1186 případů se stejným směrem účinku jako u UACR (hodnota P < 0,05/7,="" r="" {{7}="" },98,="" obr.="" 3b,="" doplňková="" data="" 5,="" doplňková="" obr.="">

Korelace s genovou expresí. Abychom získali přehled o možných funkčních mechanismech CpG spojených s eGFR a UACR, testovali jsme korelaci jejich hladin metylace DNA s hladinami mRNA genů kódovaných v cis v plné krvi a také v krevních monocytech (viz Metody, Doplňková data 9 ). Známý eGFR-asociovaný cg17944885 na chromozomu 19 poblíž ZNF788 byl spojen s transkriptem kódovaným 240 kb vzdáleným proteinem se zinkovým prstem 439 (ZNF439, tabulka 2). Kromě toho byla methylace cg04864179 na interferonovém regulačním faktoru 5 (IRF5) spojena s oběma mRNA transkripty kódovanými IRF5 a blízkým transportinem 3 (TNPO3) (doplňkový obrázek 5A). Z asociací UACR dva replikované CpG cg02711608 a cg22304262 v rodině nosičů solutů 1 člen 5 (SLC1A5) odhalily významné asociace s hladinami mRNA SLC1A5 a cg23570810 s jeho interferonem indukovaným transmembránovým proteinem (inIFITM1 transmembránovým proteinem T1) 2). Všechny výsledky analýzy genové exprese jsou uvedeny v doplňkových datech 9.

Účinky na ledvinovou tkáň.Posoudit, zda se pozorované metylační účinky v krvi přenášejí doledvinová tkáň,použili jsme regresní model, abychom otestovali asociace replikovaných CpG na signifikantní (míra falešného objevu (FDR) < 0,05) a směrově konzistentní asociaci s eGFR aledvinafibróza u 506 mikrodisekcíledvinová tkáňVzorky. V těchto vzorcíchledvina- tkáňová methylace DNA replikovaných CpG spojených s eGFR cg23597162 na JAZF1, cg26099045 v blízkosti PELI1 a cg12644285 na CHD2 byla významně spojena s eGFR se stejným směrem účinku jako v krvi (doplňková data 6A10, doplňková tabulka) Obr. . Dále stejné CpG na PELI1 a šest dalších

místa (cg20146909 na LRRC8D, cg25767870 poblíž FAM46C, cg16618493 na ZBTB7B, cg10632966 poblíž RPEL1, cg01068906 na NOD2 a cg032937731 byly spojeny s GDPD fibrózouledvinavzorky tkáně s konzistentními (tj. inverzními) směry účinku (doplňkový obr. 6B, tabulka 2). Z replikovaných míst UACR jsou hladiny methylace DNA vledvinatkáně cg00008629 na PTBP3 a cg24859433 poblíž IER3 byly spojeny s fibrózou a vykazovaly stejný směr účinku (doplňkový obr. 6D, tabulka 2). V souladu se zjištěními EWAS nebyla nalezena žádná významná asociace CpG spojených s UACR s eGFR u dárců vzorku ledvin (doplňkový obrázek 6C, doplňková data 10).

Kauzální účinky mezi metylací DNA afunkce ledvinrysy. Chcete-li posoudit, zdafunkce ledvinvlastnosti kauzálně ovlivňují metylaci DNA nebo naopak, provedli jsme obousměrnou dvouvzorkovou mendelovskou randomizační (MR) analýzu významně asociovaných CpG. Dopředná MR analýza naznačila, že CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) a cg04864179 (IRF5) kauzálně ovlivňují hladiny eGFR (tabulka 3). Odhady dědičnosti těchto čtyř CpG se lišily mezi třemi soubory dat z populací evropského původu, ale byly konzistentně vyšší než průměrná dědičnost napříč všemi CpG hodnocenými v každé ze tří studií: 0,34 (kauzální eGFR CpG) vs. 0,16 (matice HM450K) na základě Hannona et al.25, 0,55 vs. 0,19 pro Dongen et al.26 a 0,51 vs. 0,19 pro McRae et al.27. Nebyly identifikovány žádné významné příčinné souvislosti pro žádné CpG spojené s UACR. Pro reverzní MR byl jediný významný účinek eGFR na cg23597162 (JAZF1) při použití metody primární inverzní odchylky. Při vícenásobných reverzních analýzách citlivosti na MR však nebyly identifikovány/pozorovány žádné významné účinky. Analýzy vynechání 1 neukázaly žádný náznak, že by výsledky MR mohly být řízeny jediným SNP. Kromě toho, vyjma SNP, které byly spojeny s diabetes mellitus 2. typu, který je hlavním rizikovým faktoremnemoc ledvinnevedlo k rozdílným zjištěním. Výsledky všech primárních analýz a analýz citlivosti MR jsou uvedeny v doplňkových datech 11 a 12 a v doplňkovém obr. 7. Analýzy citlivosti podporují primární zjištění významných dopředných výsledků MR (FDR < 0.05,="" viz="" metody)="" s="" směrově="" konzistentní="" odhady="" účinku,="" což="" naznačuje="" potenciálně="" kauzální="" vztahy="" od="" metylace="" dna="" k="" egfr,="" ale="" ne="">

Vazba transkripčního faktoru, histonové značky a analýzy obohacení dráhy. Provedli jsme analýzy vazebného místa transkripčního faktoru, histonové značky a analýzy obohacení dráhy na základě 967 CpG, které vykazovaly sugestivní asociaci s eGFR (Pvalue < 1e−05;="" doplňková="" data="" 6)="" a="" 270="" cpg,="" které="" vykazovaly="" sugestivní="" asociace="" s="" uacr="" (p-hodnota="">< 1e−5;="" doplňková="" data="" 7)="" v="" metaanalýze,="" abychom="" maximalizovali="" statistickou="" sílu="" analýz="" obohacení="" (viz="" metody)="" 14="" nejprve="" jsme="" hodnotili,="" zda="" cpg="" spojené="" s="" egfr="" jsou="" přednostně="" mapovány="" na="" vazebná="" místa="" 169="" transkripčních="" faktorů="" (tf)="" na="" základě="" chromatinu="" imunoprecipitační="" data="" sekvenování="" dna="" (chip-seq)="" z="" projektu="" encode,="" která="" byla="" agregována="" konsensuálním="" voláním="" napříč="" 91="" typy="" lidských="" buněk="" (161="" stop="" tf)="" a="" doplněna="">ledvinatkáňové stopy (viz Metody). Po několikanásobné korekci testování pro 169 TFs vykazovalo osm TF významné obohacení pro CpG spojené s eGFR (FDR < 0,05;="" obr.="" 4a,="" doplňková="" data="" 13),="" včetně="" cebpb="" (p-hodnota="1)." 75e−06,="" křížová="" tkáňová="" dráha)="" a="" ep300="" (p-value="7.49E−09," křížová="" tkáňová="" dráha).="" to="" je="" v="" souladu="" se="" zjištěním="" chu="" et="" al.14="" v="" menší="" podskupině="" 4859="" účastníků="" z="" 33="" 605="" účastníků="" zde="" analyzovaných.="" cpg="" spojené="" s="" uacr="" byly="" obohaceny="" o="" vazebná="" místa="" 56="" tf="" (obr.="" 4b,="" doplňková="" data="" 14)="" s="" nejsilnější="" asociací="" pro="" polr2a="" (p-hodnota="6.93E−19)," fos="" (p-hodnota="" {{32="" }}.28e−12)="" a="" ep300="" (hodnota="" p="">

ledviny-funkce asociované CpG byly široce obohaceny o několik histonových značek, přičemž 82 ze 195 kombinací typů buněk histonových značek bylo významných (FDR q < 0.05)="" pro="" egfr="" (obr.="" 4c,="" doplňková="" data="" 15)="" a="" 79="" ze="" 195="" pro="" uacr="" (obr.="" 4d,="" doplňková="" data="" 16).="" modifikace="" histonu="" h3k4me1,="" značka="" koncentrovaná="" na="" aktivní="" a="" aktivované="" enhancery,="" byla="" obohacena="" pro="" všechny="" typy="" buněk="" pro="" cpg="" spojené="" s="" uacr="" a="" téměř="" všechny="" typy="" buněk="" pro="" cpg="" spojené="" s="" egfr.="" zatímco="" cpg="" spojené="" s="" uacr="" vykazovaly="" obohacení="" o="" promotorovou="" značku="" h3k4me3="" ve="" 34="" typech="" buněk,="" pouze="" čtyři="">

typy vykazovaly obohacení o místa spojená s eGFR. Naopak značka H3K36me3 spojená s tělem genu vykazovala mnohem širší obohacení pro CpG spojené s eGFR (30 buněčných typů) než CpG spojené s UACR (pět buněčných typů). Na rozdíl od H3K3me1/3 a H3K36me3, které byly všechny spojeny s aktivními geny (enhancery, aktivní promotory, aktivní transkripce), H3K9me3 a H3K27me3, které jsou obecně spojeny s konstitutivním a fakultativním heterochromatinem28–31, nebyly významně obohaceny pro UACR- asociované CpG v jakémkoli testovaném buněčném typu (obr. 4D, doplňková data 16). Obohacení genů zapojených dofunkce ledvin-asociované CpG byly hodnoceny v databázích Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a Reactome (viz Metody)32–35. Významné obohacení bylo pozorováno pro 27 termínů (25 GO, jeden KEGG, jeden reaktom; doplňková data 17, obr. 5A) pro eGFR a 91 termínů (87 GO, čtyři reaktomy; doplňková data 18, obr. 5B) pro UACR (obr. 5B). Dráhy související s migrací specifickou pro typ bílých krvinek, translací mRNA, hemostázou a koagulací, stejně jako inzulínovou odpovědí, vykazovaly významné obohacení pro eGFR asociované CpG (FDR < 0,05;="" obr.="" 5a).="" dráhám="" s="" nejnižším="" obohacením="" p-hodnot="" pro="" místa="" spojená="" s="" uacr="" dominovala="" aktivace="" a="" reakce="" imunitních="" buněk="" a="" dráhy="" související="" s="" interferonem="" (obr.="" 5b).="" další="" cesty,="" které="" byly="" obohaceny,="" zahrnovaly="" migraci="" bílých="" krvinek,="" jako="" u="" výsledků="" egfr="" (doplňková="" data="">

Vztah ke známým asociacím EWAS s jinými rysy. Vzhledem k pozorovanému obohacení cest souvisejících s imunitní odpovědí, výsledkům methylace DNA včetně CpG v blízkosti genů interferonové dráhy a skutečnosti, že stav metylace DNA byl převážně hodnocen v leukocytech, jsme hodnotili, zda naše zjištění mohou být řízena matoucími účinky imunitní odpověď nebo stav zánětu. Provedli jsme tedy vyhledávání replikovaných CpG ve velkém EWAS na hladinách vysoce citlivého sérového C-reaktivního proteinu (CRP)36. Pouze dva CpG, které byly také spojeny s methylací DNA a eGFR vledvinová tkáň,cg09610644 na BDH1 a cg12644285 na CHD2 patřily mezi místa spojená s CRP. Obecné zkreslení našich výsledků prostřednictvím zánětlivého stavu, jak je odhadováno pomocí CRP, se tedy zdá nepravděpodobné.

Některé zfunkce ledvin-asociované CpG identifikované v této studii jsou spojeny s několika dalšími vlastnostmi na základě publikovaných EWAS. 21 míst eGFR bylo spojeno s krevním tlakem, spotřebou alkoholu, BMI, pohlavím, receptorem rozpustného tumor nekrotizujícího faktoru 2 a/nebo kuřáckým stavem a pět míst UACR bylo dříve spojeno s konzumací alkoholu, kouřením, BMI, dosaženým vzděláním, -glutamyltransferáza, receptor rozpustného tumor nekrotizujícího faktoru 2, diabetes mellitus 2. typu a/nebo několik sérových metabolitů (tabulka 2, doplňková data 19). Tři z těchto CpG (všechna místa UACR) byly spojeny s více než dvěma vlastnostmi, a to cg02711608 u SLC1A5 (s -glutamyltransferázou, -glutamylthreoninem, BMI, konzumací alkoholu), cg18181703 u SOCS3 (s diabetes mellitus 2. typu, kuřácký stav, BMI , solubilní receptor tumor nekrotizujícího faktoru 2) a cg24859433 blízko IER3 (s kouřením, dosaženým vzděláním, 4-vinylfenol_sulfát). Doplňkový obr. 5B ukazuje příklad CpG, cg26099045, který byl v korelaci s eGFR a fibrózou vledvinová tkáňv naší analýze a navíc spojené se sexem a kouřením v předchozích EWAS. Konečně, cg17944885 na ZNF788 byl také spojen s eGFR ve vzorku pacientů s DKD22.

Diskuse

V tomto EWAS zfunkce ledvinidentifikovali a replikovali jsme hladiny metylace 69 CpG v krvi spojené s eGFR v krvi. Z toho 60 míst nebylo dříve hlášeno, stejně jako všech sedm CpG identifikovaných ve spojení s UACR. Většina CpG asociovaných s eGFR a UACR byla také významně spojena s jejich klinickými výsledky, tj. CKD a mikroalbuminurií, a mohou proto mít potenciál pro stratifikaci rizikových jedinců. Rozptyl eGFR připisovaný těmto 69 CpG byl 2,4 procenta – dvojnásobek oproti dřívějšímu EWAS14 a je srovnatelný s rozptylem vysvětleným 29 SNP objevenými GWAS, které zahrnovaly třikrát větší velikost vzorku pro objev lokusu37,38. To naznačuje, že diferenciální methylace DNA na jednotlivých CpG kvantifikovaných z krve vysvětluje více variance eGFR než jednotlivé běžné SNP při dané velikosti vzorku. U UACR se zdá, že k odhalení podobného počtu CpG souvisejících s rysem jsou zapotřebí větší velikosti vzorků ve srovnání s eGFR. Vzhledem k tomu, že albumin a kreatinin pro výpočet UACR jsou měřeny v moči na rozdíl od kvantifikace kreatininu ze séra pro odhad GFR, není tento rozdíl neočekávaný a je v souladu s pozorováním těchto znaků z GWAS10,13. Kromě toho se zdá, že genetická variace ovlivňujefunkce ledvinvlastnosti jinými cestami než změnami v metylaci DNA. To je podpořeno nízkým překrýváním mezi replikovanými místy EWAS a GWAS pro eGFR i UACR.

Tato metaanalýza EWAS zahrnovala vzorky různých populací a etnik. Pozorovali jsme vysokou korelaci odhadů účinku získaných z velkého podvzorku jedinců s EA s účinky odhadovanými u jedinců s AA (obr. 2). Navzdory zahrnutí údajů od značného počtu jedinců s původem mimo EA mohou být celkové výsledky transetnického EWAS založeny na údajích od jedinců s původem z EA, což představuje 70 procent (eGFR) / 65 procent (UACR) naší studie (doplňkové údaje 3 a 4). K vyřešení tohoto omezení jsou zapotřebí budoucí analýzy se zvýšeným podílem vzorků bez EA pro spolehlivé a podrobné posouzení heterogenity mezi předky. Potenciál převést poznatky z EWAS o kvantitativních rysech v převážně populačních studiích na osoby s tímto onemocněním ilustruje skutečnost, že odhady účinku u 65 z 69 CpG asociovaných s eGFR byly pozorovány stejným směrem u kohorty 551 pacientů s CKD, ukazující na mechanismy použitelné v širokém rozsahu hladin eGFR (obr. 3). Navíc,

cg07242931 v MAN1C1 a cg18194850 v SUCLG2 nebyly spojeny pouze s eGFR, ale předpovídaly dobu doselhání ledvinnebo akutníporanění ledvin(Doplňkové údaje 8). Další důkaz pro zapojení SUCLG2, který kóduje -podjednotku sukcinyl-CoA syntetázy, na onemocnění ledvin navrhl GWAS na diabetickénemoc ledvinu amerických Indiánů (SNP=rs4453858, P-value=2E−6)39. Genetická variace v tomto genu byla také spojena s hladinami sukcinyl-karnitinu v moči (C4DC, SNP=rs115560420, P-hodnota=7E−15)40. C4DC je metabolický produkt z cyklu trikarboxylových kyselin, který je katalyzován za účasti sukcinyl-CoA syntetázy a vyšších hladin C4DC v krvi spojených s nižším eGFR41. Vyhledávání ve výsledcích metylačních kvantitativních lokusů (meQTL) GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 však neodhalilo významnou asociaci těchto dvou SNP s cg18194850, což naznačuje žádnou přímou souvislost mezi těmito SNP. a stránky CpG.

Protože methylace DNA je hlavním regulátorem genové exprese, hodnotili jsme korelaci metylačních míst DNA spojených s vlastnostmi s hladinami mRNA genů v cis. Geny, jejichž hladiny mRNA významně korelovaly sfunkce ledvinsouvisející místa methylace DNA souvisela s interferonovými cestami (jak pro eGFR, tak pro UACR). Ačkoli tato zjištění souhlasí s výsledky obohacení dráhy pro UACR (obr. 5B, doplňková data 18), počet významných korelací mezi CpG spojenými s UACR a hladinami transkriptů je poměrně nízký. To není překvapivé vzhledem k relativně malé velikosti vzorku 1915 jedinců dostupných pro tuto analýzu a omezenému pokrytí zdroje transkriptomiky. Je zajímavé, že mezi významnými nálezy pro UACR byly dva CpG v rodině nosičů rozpuštěných látek 1 člen 5 (SLC1A5) spojeny s diferenciální genovou expresí a také s krevním tlakem. Methylace DNA na SLC1A5, která kóduje neutrální aminokyselinový transportér závislý na sodíku, by proto mohla být dalším prvkem přispívajícím ke známé korelaci mezi UACR a krevním tlakem.

Významné rozdílně exprimované transkripty nebyly vždy kódovány nejbližším genem (cg17944885 blízko ZNF788), nebo CpG místo korelovalo s více geny v cis (cg04864179 na IRF5). Pozoruhodná je zejména korelace methylace DNA na cg04864179 s hladinami transkriptu IRF5. Vzhledem k významnému výsledku MR tohoto CpG s eGFR by metylace DNA na IRF5 mohla kauzálně ovlivnit eGFR zprostředkovaný jeho genovou expresí. Vezmeme-li v úvahu transformaci znaků základních genetických asociací (viz Metody), pozorovali jsme, že zvýšení metylace DNA o deset standardních odchylek mělo za následek o 3,2 procenta vyšší eGFR. Ačkoli je tento odhadovaný účinek velmi malý, kauzální vliv metylačních vzorců v krevních buňkách na CKD byl také podpořen souhrnnou MR s jiným souborem dat meQTL v nedávné studii, kde byl kauzální účinek přímo konzistentní s našimi výsledky22. Aplikací multi-trait kolokalizace také ukázali, že genetické účinky tohoto lokusu na eGFR byly zprostředkovány metylací IRF5 a genovou expresí v krvi. Kromě toho byla prokázána kolokalizace exprese genu IRF5 s eGFR v tubulárním i glomerulárním kompartmentuledvinatkáň43. Při interpretaci kauzálního účinku pozorovaného v naší studii je však třeba mít na paměti, že analýzy MR pro CpG cg04864179 ukázaly významnou heterogenitu (p < 0,05)="" mezi="" nástroji="" (doplňková="" data="" 11="" a="" doplňkový="" obrázek="" 7="">

IRF5 kóduje člena rodiny interferonových regulačních faktorů (IRF). Skupina členů rodiny IRF obsahuje transkripční faktory s různými rolemi, jako je modulace aktivity imunitního systému, růst a diferenciace, stejně jako kontrola genové exprese pro interferonovou odpověď na virové infekce. IRF5 může ovlivnit odpověď imunitních buněk. Více studií podporuje, že změny v methylaci IRF5 mohou ovlivnitfunkce ledvinprostřednictvím imunitních drah: SNP v IRF5 jsou spojeny se SLE prostřednictvím změn v expresi IRF5 v krevních monocytech44–46. SLE je autoimunitní onemocnění charakterizované aktivací dráhy IFN, která může ovlivnitledvinyjako lupusová nefritida47. Inhibice hyperaktivace IRF5 v myším modelu SLE chráněna před nástupem a závažností lupusové nefritidy a zlepšenafunkce ledvina patologie48,49. Ačkoli se náš EWAS nezaměřoval na studii pacientů se SLE, malé účinky metylace IRF5 na výsledky související s ledvinami, zprostředkované alespoň částečně její expresí a následnými cestami IFN, by mohly být detekovány jako účinky na eGFR v obecné populaci.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL

Několik CpG asociovaných s eGFR, u kterých byla kvantifikována methylace DNA z krevních buněk, bylo také spojeno s eGFR aledvinafibróza, kdy byla kvantifikována methylace DNAledvinatkáně, i když velikost vzorku byla podstatně menší ve srovnání s datovým souborem EWAS. To naznačuje, že alespoň některé nálezy získané z krve lze převést do další cílové tkáně specifické pro znak. Tady krev aledvinajsou dvě hlavní specifické cílové tkáně, protožefunkcezledvinaje filtrace krve k odstranění odpadu. Analýzy obohacenífunkce ledvinasociované CpG indikovaly ústřední roli v regulaci transkripce. Zjistili jsme rozsáhlé obohacení H3K4me1/3 a H3K36me3. H3K4me1/ 3 je spojena s aktivovanými a aktivními zesilovači, stejně jako aktivními promotory a H3K36me3 úzce koreluje s transkribovanými oblastmi genomu50. Role transkripční regulace je dále podporována nejsilnějším signálem obohacení transkripčního faktoru CpG asociovaných s UACR, což je POLR2A, největší podjednotka hlavního enzymu syntetizujícího mRNA v eukaryotech.

Potenciální omezení související s analýzami MR zahrnují, že platné nástroje nebyly dostupné pro všechny CpG pro dopřednou MR. Vzhledem k tomu, že všechny nástroje CpG byly vybrány z cis oblastí, tj. ze stejné genetické oblasti, je pravděpodobné, že všechny nástroje CpG jsou buď platné nebo neplatné, což omezuje počet různých MR metod, které lze použít k testování robustnost výsledků51. Reverzní MR měla omezenou sílu kvůli malé velikosti vzorku dostupné pro odhad asociací methylace SNP-DNA. Větší studie meQTL, jako je GoDMC, nemohly z technických důvodů ukládat výsledky asociace pro všechny SNP (tj. nad určitou hranici P-hodnoty asociace), a proto nebyly použitelné pro dvouvzorkovou reverzní MR. Nevýznamné nálezy je tedy třeba interpretovat opatrně. Kromě toho je obtížná interpretace velikosti kauzálního účinku, protože základní genetické asociace jsou vypočítány na stupnici standardní odchylky úrovní metylace DNA. Dalším potenciálním omezením studie je, že eGFR, CKD a UACR jsou fenotypy odhadované z různých základních parametrů a mají multifaktoriální vliv. Provedli jsme tedy několik analýz, abychom se ujistili, že naše výsledky EWAS nebyly řízeny známými zmatky, včetně diabetu 2. typu, potenciálního zmatku ve vztahu mezi DNAm afunkce ledvin. Nejprve byly asociace EWAS v každé kohortě upraveny o zmatky, aby se odstranily jejich účinky v rámci kohorty. Za druhé, EWAS byly provedeny v každé kohortě samostatně a poté metaanalyzovány, což odpovídá úpravě např. pro prevalenci diabetu napříč kohortami. Nakonec jsme zkontrolovali asociace našich replikovaných CpG v publikovaných studiích EWAS o diabetu. Ze všech našich replikovaných CpG asociací pouze CpG cg18181703 asociovaná s UACR na SOCS3 vykazovala asociaci s diabetem 2. typu. Tento CpG byl také spojen se stavem kouření, BMI a krevními hladinami rozpustného receptoru tumor nekrotizujícího faktoru 2. Vezmeme-li v úvahu, že náš EWAS byl také upraven podle stavu kouření a BMI, předpokládáme, že účinky cg18181703 na UACR budou alespoň částečně nezávislé na diabetu 2. typu, BMI a kouření. Zatímco jsme kontrolovali několik z těchto známých faktorů, další faktory, jako jsou neměřené kovariáty, nemohly být v analýzách explicitně upraveny a mohou ovlivnit zjištění.

K rozšíření našich znalostí o regulačních mechanismech jsou zapotřebí další studie EWAS se zvýšenou velikostí vzorků a s metylací DNA kvantifikovanou z dalších tkání, stejně jako funkční analýzy.funkce ledvina nakonec zlepšit predikci a léčbuledvinachoroba. To platí konkrétně pro UACR, vzhledem k nižšímu počtu pozorovaných významných asociací CpG. Stručně řečeno, tato rozsáhlá metaanalýza EWAS podstatně rozšířila počet CpG reprodukovatelně spojených s eGFR a CKD a odhalila sedm asociací pro UACR a mikroalbuminurii. Methylace DNA na těchto místech vysvětlila velkou část variance eGFR a diferenciální methylace na čtyřech CpG ukázala potenciální kauzální vztah k eGFR. Komplexní charakterizace replikovaných CpG u pacientů s CKD, inledvinová tkáň,pro diferenciální genovou expresi a pro obohacené dráhy a epigenetické značky poskytují vhled dofunkce ledvin- související transkripční regulace.

Metody

Přehled.Vytvořili jsme kolaborativní metaanalýzu založenou na distribučním datovém modelu a postupech kontroly kvality. Pro maximalizaci standardizace fenotypu napříč studiemi byl vytvořen plán analýzy a skript příkazového řádku (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) a poskytnuty všem zúčastněným studiím ( převážně populační studie, doplňkové údaje 1 a 2). Automaticky generované souhrnné soubory byly kontrolovány centrálně. Po schválení fenotypu provedly studie svůj EWAS a nahrály výsledky a agregované informace o metylaci DNA na centrální server. Kontrola kvality EWAS byla provedena pomocí vlastních skriptů k posouzení inflace, pozitivních kontrol, distribuce CpG sond a srovnání celkových distribucí velikostí účinků, standardních chyb a P-hodnot napříč studiemi. Všechny protokoly studie byly schváleny příslušnými místními etickými komisemi. Všichni účastníci všech studií poskytli písemný informovaný souhlas.

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU LEDVIN/RENÁL

Definice fenotypu.Hodnoty kreatininu získané Jaffého testem před 2009 byly kalibrovány vynásobením 0,9552. Studie odhadly GFR s chronickýmNemoc ledvinRovnice epidemiologické spolupráce (CKD-EPI)53. eGFR byla winsorizována při 15 a 200 ml min−1 na 1,73 m2. CKD bylo definováno jako eGFR pod 60 ml min−1 na 1,73 m2. Hodnoty UACR měřené v mg/g byly před všemi analýzami přirozeně logaritmicky transformované. Mikroalbuminurie byla definována jako 1 pro UACR > 30 mg/g a jako 0 pro hodnoty UACR < 10="">

Kvantifikace metylace DNA a kontrola kvality.Pro kvantifikaci methylace DNA byla genomová DNA extrahována z periferní krve. Úrovně methylace DNA byly kvantifikovány pomocí pole BeadChip Infinium MethylationEPIC (EPIC), pole Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) nebo pole Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). Předzpracování dat metylace DNA bylo provedeno podle jednotlivých protokolů studie včetně korekce pozadí, kvantilové normalizace, filtrování sondy, filtrování vzorků, přizpůsobení SNP k umístění kontrolní sondy SNP, filtrování odlehlých hodnot a korekci typu testu (doplňková data 3). Úroveň methylace na každém místě byla reprezentována a analyzována jako -hodnota. CpG sondy překrývající se s SNP byly anotovány. Každá studie vypočítala průměr a směrodatnou odchylku každého místa CpG a tyto souhrnné statistiky byly porovnány mezi studiemi pro systematické rozdíly mezi CpG a následně byly sledovány jednotlivými analytiky studie.

Kovariantní hodnocení.Methylace DNA a kovariáty byly měřeny ve stejnou návštěvu/čas. Prevalentní diabetes byl definován jako plazmatická glukóza nalačno větší nebo rovna 126 mg/dl, plazmatická glukóza bez lačno větší nebo rovna 200 mg/dl, léčba diabetu nebo vlastní hlášení diagnózy diabetu. Prevalentní hypertenze byla definována jako systolický krevní tlak vyšší nebo rovný 140 mm Hg, diastolický krevní tlak vyšší nebo rovný 90 mm Hg nebo léčba hypertenze. Pokud naměřený krevní tlak nebyl k dispozici, byla hypertenze definována vlastním hlášením. Aktuální kuřácký stav byl definován pomocí informací, které sami uvedli. BMI (kg/m2) byl vypočten pomocí měření hmotnosti a výšky, jak bylo hodnoceno v každé studii. Věk byl zahrnut jako spojitá hodnota v asociačních modelech. Struktura populace v nerodinných studiích byla upravena podle genetických hlavních komponent (PC). Proporce typu bílých krvinek byly odhadnuty na základě metylace DNA54. Další technické kovariáty zahrnovaly řídicí sondu PC55, studijní centrum, zpracovací dávku, ID sentrix pole a polohu sentrix.

Statistické metody a metaanalýza. Aby byla zajištěna srovnatelná síla mezi analyzovanými místy, byly do analýz zahrnuty pouze autozomální CpG měřené oběma, EPIC a HM450K. Každá studie prováděla lineární regresní analýzy oddělené podle skupin předků. Pro posouzení robustnosti výsledků EWAS byly analýzy omezeny na studie a dílčí vzorky jedinců evropského původu. Hodnoty metylace DNA byly modelovány jako závislé proměnné, přičemž znakem byly buď kontinuální hodnoty eGFR nebo UACR nebo binární proměnné CKD nebo mikroalbuminurie: metylace DNA ~ znak plus pohlaví plus věk plus genetické PC plus proporce bílých krvinek plus technické kovariáty plus diabetes plus hypertenze plus BMI plus současné kouření Účastníci potřebovali úplné informace o všech proměnných a souhrnné statistiky studie a byli zahrnuti pouze v případě, že bylo k dispozici minimálně 50 účastníků pro eGFR/UACR a 50 případů/kontrol pro CKD/mikroalbuminurii. Každý EWAS specifický pro studii byl před metaanalýzou pomocí BACON přístupu upraven o inflaci, pokud byl odhad inflace větší nebo roven jedné (doplňkový obr. 8)56. Studie byly rozděleny na objev a replikaci podle chronologického pořadí příspěvku k metaanalýze konsorcia CKDGen (doplňková data 1 a 2). Metaanalýza s pevným účinkem vážená inverzní variací, jak je implementována v balíčku R 'metafor' (verze 2.{14}}) byla provedena pro studie objevů, studie replikace a pro odhady výsledného účinku objevu a replikace. CpG byly vyloučeny, pokud byla v rámci objevu nebo replikace k dispozici méně než polovina příslušné velikosti vzorku nebo pokud byl odhad heterogenity I2 vyšší o 95 procent. Úspěšná replikace přidruženého CpG byla definována jako konzistentní směr odhadů účinku mezi objevem (neGFR disk=22,347, nUACR disk=11,458) a replikací (neGFR repl=11,258 , nUACR repl=3610) metaanalýza, Bonferroniho upravený význam objevu P-value (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Analýza genové exprese.Účinkyfunkce ledvinCpG spojené s vlastnostmi byly testovány na asociace s genovou expresí v krvi pomocí dvou souborů dat: (1) hladiny mRNA monocytů od 1202 účastníků studie MESA a (2) mRNA plné krve 713 jedinců Studie KORA F4 57,58. Jako počáteční krok bylo provedeno vyhledání hladin CpG methylace s hladinami mRNA dostupnými v asociačních výsledcích ze studie MESA. Pro toto vyhledávání byly k dispozici výsledky asociace s P-hodnotou < 1e{{10}}.="" analýza="" byla="" podrobně="" popsána="" v="" kennedy="" et="" al.59.="" stručně="" řečeno,="" genová="" exprese="" byla="" hodnocena="" pomocí="" illumina="" humanht-12="" v3.{21}}="" a="" v4.0="" expression="" beadchips="" a="" metylace="" dna="" pomocí="" pole="" illumina="" hm450k.="" hodnoty="" exprese="" byly="" normalizovány="" pomocí="" transformace="" stabilizující="" rozptyl.="" 13="" 933="" transkriptů="" z="" polí="" v3.0="" a="" v4.0,="" které="" byly="" významně="" vyjádřeny="" nad="" úrovněmi="" pozadí="" (detekce="" p-hodnota="">< 0,01)="" alespoň="" u="" 5="" procent="" subjektů.="" asociační="" analýzy="" v="" mesa="" byly="" provedeny="" jako="" lineární="" smíšený="" model="" s="" použitím="" log-transformovaných="" hodnot="" genové="" exprese="" jako="" závislé="" proměnné,="" hodnot="" beta="" methylace="" dna="" jako="" nezávislé="" proměnné="" s="" věkem,="" pohlavím,="" etnickým="" původem="" a="" střediskem="" studie="" přidaných="" jako="" kovariáty="" do="" modelu.="" druhý="" asociační="" test="" byl="" proveden="" v="" datovém="" souboru="" kora="" f4.="" asociace="" úrovně="" methylace="" na="" replikovaných="" cpg="" s="" úrovněmi="" genové="" exprese="" genů="" v="" okolí="" ±500="" kb="" byla="" vypočtena="" pomocí="" log2-transformovaných="" hladin="" mrna="" získaných="" z="" illumina="" human="" ht-12v3="" genového="" expresního="" pole.="" hodnoty="" genové="" exprese="" byly="" regresovány="" na="" hodnoty="" beta="" methylace="" dna="" upravené="" pro="" pohlaví="" a="" věk.="" před="" analýzou="" byly="" technické="" faktory,="" stejně="" jako="" proporce="" typu="" krevních="" buněk,="" regresovány="" z="" úrovní="" metylace="" mrna="" a="" dna="" a="" její="" zbytky="" byly="" zahrnuty="" do="" konečného="" asociačního="" modelu.="" kontrola="" anotace="" a="" kontroly="" kvality="" sond="" genové="" exprese="" byla="" založena="" na="" tabulce="" poskytnuté="" v="" schurmann="" et="" al.60.="" asociace="" exprese="" cpg="" genu="" v="" krvi,="" které="" byly="" dostupné="" ve="" výsledcích="" mesa="" a="" měly="" asociační=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metylace DNA v ledvinové tkáni.Analýzy využívající methylaci DNA vledvinová tkáňs eGFR a fibrózou byly provedeny pomocí dat z 506 mikrodisekcíledvinová tkáňvzorky pomocí Illumina EPIC BeadChip. Vzorky tkáně ledvin byly odebrány odděleně a jsou odlišné od vzorků krve, které byly analyzovány v metaanalýze EWAS. Tyto vzorky byly odebrány z nepostižených částí nádorových nefrektomií a připraveny tak, jak bylo popsáno výše 61. Stručně řečeno, software SeSAMe62 byl použit k provedení předběžného zpracování a kontroly kvality včetně detekce na základě nízké intenzity, korekce prosakování při odečítání pozadí, nelineární korekce zkreslení barviva, kontrola bisulfitové konverze, výpočet hodnot beta a odhad frakce leukocytů. Beta hodnoty CpG asociované s eGFR a UACR a klinické informace byly extrahovány pro asociační analýzu. Regresní model byl použit k testování asociací beta methylace DNA konečných CpG jako závislých proměnných s hladinami eGFR a fibrózy, v tomto pořadí, jako nezávislých proměnných upravených pro pohlaví, věk, genetické PC (1–5), stav diabetu, stav hypertenze. , BMI, pole sentrix ID, pozice sentrix a kontrola konverze bisulfitu a odhadovaná frakce leukocytů.

Cílená vyšetření sond eGFR u pacientů s CKD. Spojení 69 eGFR asociovaných a validovaných CpG z obecné populace s eGFR v German ChronicNemoc ledvin (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Sledování pacientů pro klinické koncové body stále probíhá. Koncové body studie jsou průběžně zaznamenávány standardizovaným způsobem na základě propouštěcích dopisů z nemocnice a úmrtních listů a zahrnují události související s ledvinami i úmrtí. Design studie a rekrutovaná studijní populace jsou podrobněji popsány v předchozích publikacích63,64. Studie GCKD byla schválena místními etickými komisemi a zaregistrována v národním registru pro klinické studie (DRKS 00003971). Podskupina 559 pacientů s CKD přisuzovaným systémovým lupus erythematodes, membránové nefropatii, fokální segmentální glomeruloskleróze nebo autozomálně dominantní polycystickénemoc ledvinbyla vybrána pro kvantifikaci methylace DNA a měřena pomocí Infinium MethylationEPIC BeadChip array (EPIC). Asociace s eGFR byla hodnocena analogicky jako v hlavní analýze (viz Statistické metody a metaanalýza), kromě úpravy pro kouření, která byla kódována 0/1/2 pro nikdy/bývalé/aktuální kuřáky. Vyhodnotit asociaci methylace DNA s časem doselhání ledvinze vstupu do studie byly Coxovy regresní modely přizpůsobeny pro každý CpG a analogicky pro kombinovaný cílový bodselhání ledvina akutníporanění ledvin.Kromě prediktoru metylace DNA byly modely upraveny pro věk, pohlaví a podtyp CKD. Coxův regresní model poskytuje odhady poměru rizika specifického pro příčinu (HR) v přítomnosti konkurenčních událostí, tj. jakékoli jiné smrti kromě smrti související s ledvinami. Dodatečně byly provedeny analýzy rizik subdistribuce za účelem vyhodnocení potenciálních nepřímých účinků prostřednictvím konkurenční události. Předpoklad proporcionálních rizik byl posouzen na základě škálovaných Schoenfeldových reziduí. Grafické hodnocení pro dva přidružené CpG neodhalilo žádné známky závažného porušení (doplňkový obr. 9).

Pozemky regionálního sdružení a anotace. Grafy pro doplňkový obr. 5 byly vytvořeny pomocí balíčků 'Gviz' 65 a 'rtracklayer' 66 R. Do grafu bylo zahrnuto maximálně 40 míst v rámci 50,{5}} bp proti směru nebo po směru od místa zájmu CpG. Pokud interval obsahoval více než 40 míst, byla vynesená oblast zmenšena na vzdálenost nejvzdálenějšího místa plus 10,000 bp. Sekce RefSeq Genes je založena na stopě UCSC NCBI RefSeq s genovými symboly z balíčku 'org.Hs.eg.db' R, sekce CpG Islands je založena na stopě UCSC CpG Islands, sekce Roadmap chromHMM byla založena na Plány 15- uvádějí chromHMM model ploduledvinaepigenom (Roadmap Epigenome ID: E086)67 a sekce Common SNPs je založena na UCSC Common SNPs(151) track68. A konečně, graf korelace CpG ve spodní části obrázku je založen na datech vzorků metylace DNA studie KORA F4 pomocí pole Illumina HumanMethylation450 BeadChip, přičemž chybějící místa jsou zbarvena světle šedě.

Variance se vysvětluje metylací DNA.Procento fenotypové variance vysvětlené 69 replikovanými CpG asociovanými s eGFR bylo odhadnuto pomocí údajů 1 888 účastníků ze studie KORA FF4, sedmiletého sledování studie KORA F457,58. KORA FF4 nebyla součástí metaanalýzy EWAS. Nicméně 988 jedinců zahrnutých do analýzy vysvětleného rozptylu se překrývalo s účastníky KORA F4 EWAS. V tomto souboru dat byl rozptyl vysvětlený všemi CpG nezávisle na kovariátech odhadnut jako rozdíl v R2 základního modelu včetně CpG a modelu bez. Základní model byl definován jakoledvinavlastnost ~pohlaví plus věk plus proporce bílých krvinek plus diabetes plus hypertenze plus BMI plus současné kouření sledvinaznak reprezentující eGFR a UACR. Pro dva CpG spojené s eGFR (cg06008406, cg20004659) nebyla v souboru dat KORA FF4 k dispozici žádná data.

Obousměrná Mendelova randomizační analýza.V dopředné MR pomocí balíčku „TwoSampleMR“ R69 jsme zkoumali potenciální kauzální účinky methylace DNA na replikovaných CpG na eGFR a UACR. MR využívá genetické nástroje k minimalizaci zkreslení způsobených matoucími a obrácenými příčinnými souvislostmi70. Genetické nástroje pro metylaci DNA (meQTL) byly k dispozici pro 47 a pět CpG pro eGFR a UACR, jak dříve identifikovala GoDMC až u 27,750 jedinců42. Souhrn evropských předků Údaje GWAS na eGFR10 a UACR13 byly použity jako příslušná výsledná data. Pro inkluzi meQTL byly aplikovány filtry (pSNP < 1e-5="" s="" methylací="" dna="" v="" cis="" oblasti="" ±="" 500="" kb,="" vazebná="" nerovnováha="" r2="">< 0,2="" v="" oblasti="" 1="" mb,="" steigerova="" filtrace,="" maf=""> 0,05). Provedli jsme inverzně vážené analýzy MR a MR citlivosti (jednoduchý režim, vážený režim, vážený medián a MR Egger) nebo triangulaci odhadem Waldova poměru v případě, že byl k dispozici pouze jeden přístroj na CpG místo71–73. Odhady účinku získané z MR závisí na jednotkách základních datových souborů a v tomto případě odpovídají změně na jednotku v jedné standardní odchylce úrovní methylace na přirozeném logaritmicky transformovaném eGFR a standardní odchylce přirozeného logaritmicky transformovaného UACR, respektive. Při reverzní MR jsme zkoumali potenciální kauzální účinkyfunkce ledvinvlastnosti na methylaci DNA s použitím celogenomově významných SNP z trans-etnických GWAS na eGFR10 a UACR13 jako genetických nástrojů pro eGFR a UACR, v daném pořadí. Abychom maximalizovali vliv na výsledná data, provedli jsme metaanalýzu z-skóre asociací SNP-CpG ze studií KORA F4 (n=1662) ​​a FHS (n=3868). Odhady kombinovaného účinku a jejich standardní chyby meQTL zahrnuté v MR byly odhadnuty z velikosti vzorku, frekvence alel a z-skóre74. Pro zahrnutí SNP byly použity filtry (hodnota P < 5e-8="">ledvinavlastnost, jednostranná hodnota P < 0.05="" s="" dusíkem="" močoviny="" v="" krvi="" pro="" přístroje="" egfr,="" heterogenita="" předků="" p-hodnota="" větší="" nebo="" rovna="" 0.0="" 1,="" steigerovo="" filtrování,="" maf=""> 0.05). Provedli jsme inverzní variance váženou MR s multiplikativními náhodnými efekty (protože pro každý znak byl k dispozici dostatečně vysoký počet nástrojů z různých lokusů)51 a analýzy MR citlivosti (jednoduchý režim, vážený režim, vážený medián a MR Egger)71–73. Jako další analýzu citlivosti zaměřenou na pleiotropní varianty jsme vyloučili celkem 35 nástrojů, které byly spojeny s diabetes mellitus 2. typu v nedávném GWAS75, včetně 898 130 jedinců: jedenáct SNP, které měly asociační P-hodnotu < 5e−8="" s="" diabetem,="" a="" 24="" dalších="" přístroje,="" které="" byly="" ve="" vazebné="" nerovnováze="" (r2=""> 0,2 v rámci 1 Mb, referenční panel 1000 G EUR) s takovým SNP spojeným s diabetem. Vazebná nerovnováha byla hodnocena pomocí LDlink76. Pro reverzní MR odhady účinku poskytují změnu na jednotku v přirozeném logaritmicky transformovaném eGFR a směrodatnou odchylku přirozeného logaritmicky transformovaného UACR na standardní odchylce úrovní methylace DNA. Úprava vícenásobného testování P podle Benjaminiho–Hochberga FDR < 0,05="" byla="" aplikována="" na="" vlastnost="" ledvin="" a="" pro="" dopřednou="" a="" zpětnou="" mr="" zvlášť77.="" heterogenita="" p-hodnoty="" byly="" získány="" z="">

Analýzy obohacení.Abychom informovali o potenciálních funkčních účincích souvisejících CpG, hodnotili jsme obohacení těchto CpG v místech DNázy I nebo modifikace histonů (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), genových sad založených na GO termínech a drahách v databázích KEGG a Reactome32 –35. Analýzy obohacení TFBS byly provedeny, jak bylo podrobně popsáno dříve14. Stručně řečeno, testování obohacení bylo hodnoceno pomocí eForge78 pomocí permutace s párováním pro lokalizaci genové a CpG ostrovní oblasti při vzorkování. Data byla získána buď z projektů ENCODE (125 vzorků) nebo Roadmap Epigenomics (299 vzorků) generovaných metodou Hotspot67,79,80. CpG, které byly spojeny s eGFR a UACR, v tomto pořadí, při P-hodnotě < 1e−{43}}5="" v="" metaanalýze="" byly="" použity="" jako="" vstup="" (doplňková="" data="" 6="" a="" 7)="" a="" 10,000="" běhy="" převzorkování,="" aktivní="" proximitní="" filtr="" a="" fdr="">< 0,05="" považovány="" za="" významné="" (doplňková="" data="" 13="" a="" 14).="" analýzy="" obohacení="" histonových="" značek="" byly="" provedeny="" analogicky="" (doplňková="" data="" 15="" a="" 16).="" obohacení="" v="" genových="" sadách="" nebo="" drahách="" bylo="" hodnoceno="" pomocí="" balíčku="" methylgsa="" a="" verze="" r="" 3.6.181.="" metodou="" testu="" obohacení="" byl="" methylglm="" implementující="" logistickou="" regresi="" upravující="" počet="" sond="" na="" gen="" a="" autozomální="" pozadí,="" které="" překrývá="" 450k="" a="" epic="" čipy.="" byly="" testovány="" genové="" sady="" nebo="" dráhy="" se="" 100–500="" geny="" (výchozí="" nastavení).="" zvažovali="" jsme="" genovou="" sadu="" nebo="" dráhu,="" která="" je="" významně="" obohacena="" při="" fdr="">< 0,05="" korigující="" pro="" vícenásobné="" testování="" v="" každé="" databázi="" pomocí="" benjaminiho="" a="" hochbergovy="" metody="" (doplňková="" data="" 17="" a="">