Abstraktní

ObjektivníProzkoumat mechanismus fenylethanolových glykosidů Cistanche (CPhG) na vrozenou imunitní funkci, růst nádoru a apoptózu nádorových buněk u nahých myší s osteosarkomem rezistentním na léky.MetodyBuněčná linie lidského osteosarkomu MG-63 rezistentní na léčivo byla vytvořena metodou gradientové koncentrace a byl zkonstruován model nahé myši osteosarkomu rezistentního vůči léčivu (celkem 36 myší, 6 na skupinu). Modelové skupině byl podán žaludeční sondou normální fyziologický roztok; skupina s methotrexátem (MTX) dostávala intraperitoneální injekci MTX (20 mg/kg) každé tři dny; kombinovaná skupina dostávala intraperitoneální injekci MTX každé tři dny v kombinaci s denní sondou středních dávek CPhG (250 mg/kg); skupinám s vysokou, střední a nízkou dávkou CPhG byly denně podávány CPhG žaludeční sondou ve vysokých (500 mg/kg), středních (250 mg/kg) a nízkých (125 mg/kg) dávkách. Byly pozorovány změny velikosti nádoru u nahých myší, byly vyneseny křivky průměrného objemu nádoru v průběhu času a byla vypočtena rychlost inhibice nádoru; sérové ​​hladiny IL-2 a TNF- u nahých myší byly detekovány pomocí ELISA; apoptóza nádorových buněk byla měřena průtokovou cytometrií; Western blot byl použit k detekci exprese proteinů Bcl-2, Bax souvisejících s apoptózou a exprese p-AKT, p-mTOR, p-PI3K v nádorových tkáních.VýsledkyVe srovnání s modelovou skupinou byly objem a hmotnost nádoru ve všech léčených skupinách významně sníženy (P < 0,001); ve srovnání s modelovou skupinou a skupinou MTX byly sérové ​​hladiny IL-2 a TNF- u nahých myší všech skupin CPhGs a skupiny s kombinací významně zvýšeny (P < 0,01); ve srovnání s modelovou skupinou byla exprese Bax ve všech léčebných skupinách významně up-regulována (P < 0,001) a exprese Bcl-2 ve skupinách s vysokou a střední dávkou CPhGs a ve skupině s kombinací byla významně snížena (P < 0,001); ve srovnání s modelovou skupinou a skupinou MTX byla míra apoptózy tumoru u nahých myší všech skupin CPhGs a skupiny s kombinací významně zvýšena, zatímco hladiny p-AKT, p-mTOR a p-PI3K byly významně sníženy (P < 0,05).ZávěrCPhG mohou významně zlepšit imunitní funkci u nahých myší s osteosarkomem rezistentním na léčivo a podporovat apoptózu nádorových buněk regulací signální dráhy PI3K/AKT/mTOR a exprese apoptotických proteinů Bax a Bcl-2, čímž účinně inhibují růst nádoru.

Klíčová slovaosteosarkom;Cystanche fenylethanolové glykosidy; MG-63; nádorové buňky; apoptóza; mechanismus účinku; Signální dráha PI3K/AKT/mTOR

 

VÝHODY CISTANCHE TUBULOSA

 

 

 

 

 

 

Osteosarkom (OS)je vysoce maligní primární kostní nádor s nejvyšší incidencí mezi primárními maligními kostními nádory u adolescentů, doprovázený extrémně vysokou invaliditou a úmrtností. V současnosti může vysokodávkovaný methotrexát (MTX) samotný nebo v kombinaci s jinými chemoterapeutiky po operaci účinně zlepšit míru přežití pacientů s OS [1]. Někteří pacienti s OS jsou však necitliví na chemoterapii kvůli lékové rezistenci, což vede k progresi nádoru. Podskupiny T lymfocytů u pacientů s nádorem jsou navíc často ve stavu imunitní nerovnováhy a chemoterapie může krátkodobě dále zhoršit poruchy imunity a imunosupresi [2]. Studie ukázaly, že posílení lidských imunitních odpovědí může zlepšit prognózu pacientů s OS z hlediska biologických charakteristik OS [3]. Chemoterapeutická rezistence je jedním z nejčastějších a neřešitelných problémů vedoucích k selhání léčby u pacientů s OS a imunosuprese je také jedním z klíčových faktorů způsobujících rychlou progresi nádoru [4].

Signální dráha fosfatidylinositol 3-kináza (PI3K)/proteinkináza B (AKT)/savčí cíl rapamycinu (mTOR) je považována za jednu z nejdůležitějších onkogenních drah u lidských rakovin. Tato dráha je u OS často přeaktivována, což může řídit proliferaci buněk OS, invazi, metastázy a angiogenezi, inhibovat apoptózu a dále vést k rezistenci OS na chemoterapeutika [5]. Studie potvrdily, že Cistanche fenylethanolové glykosidy (CPhGs), hlavní složkaCistanche deserticola, může posílit imunitní funkci a inhibovat růst nádoru u myší s hepatomem [6].In vitrostudie ukázaly, že CPhG mohou významně inhibovat proliferaci buněk hepatomu HepG2 a indukovat jejich apoptózu [7]. Indukce buněčné apoptózy je hlavním mechanismem současných protinádorových léků a také výzkumným bodem v léčbě OS v posledních letech. Nahé myši sdílejí mnoho podobností s lidmi v anatomii, fyziologii a biologii a mají vysokou přijatelnost pro transplantované nádory, což umožňuje xenotransplantaci určitých heterologních nádorových buněk, a proto jsou široce používány při vytváření nádorových modelů [8–9]. Cílem této studie je zkonstruovat model nahé myši osteosarkomu rezistentního na léky, sledovat účinky CPhG na imunitní funkci a dráhu PI3K/AKT/mTOR v tomto modelu, stejně jako její inhibiční účinek na růst nádoru a farmakologický mechanismus, aby poskytla reference pro rozšíření nápadů na klinickou léčbu a základní výzkum OS.

 

CISTANCHE TUBULOSA PŘÍNOSY PRO RŮST KOSTÍ

 

CISTANCHE NA PRODEJ

Podpůrná služba Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel:+86 15292862950

 

 

1 Materiály a metody

1.1 Pokusná zvířata

Třicet šest nahých myší stupně SPF (ve věku 6–8 týdnů, vážící 19–25 g) bylo zakoupeno od Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd., se zvířecím certifikátem č. 202367524. Tento experiment byl schválen Etickým výborem laboratorních zvířat Northwest Minzu University (Xbmu-3m-202306).

1.2 Buněčná linie

MG-63 buněk bylo zakoupeno od buněčné banky Čínské akademie věd v Šanghaji.

1.3 Léky a činidla

Fetální bovinní sérum, médium DMEM s vysokým obsahem glukózy, 0,25 % Trypsin-EDTA, MTX (Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd., čísla šarží PWL001, MA0212, MA0233-1, MB1156-1, v tomto pořadí); CPhG (Shaanxi Senyuan Biotechnology Co., Ltd., číslo šarže SY20231212605); anti-p-mTOR protilátka, anti-p-PI3K protilátka, anti-p-AKT protilátka, anti-Bcl-2 protilátka, anti-Bax protilátka (Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd., čísla šarží HA600094, HA721673, ET1607-73, ET1702-53, v tomto pořadí); Soupravy ELISA pro TNF- a IL-2 (Hangzhou Lianke Biotechnology Co., Ltd., čísla šarží EK282, resp. EK202).

1.4 Nástroje

Stolní vysokorychlostní chlazená centrifuga CT14RD (Shanghai Tianmei Biochemical Instrument Co., Ltd.); SW-CJ-1FD čistá lavice (Suzhou Purification Co., Ltd.); CO-5AC buněčný inkubátor (Sanyo, Japonsko); AE31 fluorescenční inverzní mikroskop (Xiamen Motic Industrial Group Co., Ltd.); RT-6100 čtečka mikrodestiček (Shenzhen Rayto Life Sciences Co., Ltd.); Systém gelové elektroforézy PowerPoc, analyzátor gelového zobrazování ChemiDoc™ (Bio-Rad, USA).

 

1.5 Experimentální metody

1.5.1 Vytvoření buněčné linie lidského osteosarkomu MG-63 lékově rezistentní (MG-63/MTX)

MG-63 buňky byly kultivovány do logaritmické růstové fáze s 80% konfluencí buněk. Bylo přidáno předem připravené buněčné kultivační médium obsahující 100 ng/ml MTX a médium bylo vyměněno po 48 hodinách. Když buňky opět dosáhly 80% konfluence, byla přidána stejná koncentrace média obsahujícího MTX. Výše uvedené kroky byly opakovány, aby se umožnilo MG-63 buňkám osteosarkomu růst stabilně v médiu obsahujícím 100 ng/ml MTX. Poté byla stejným způsobem postupně zvyšována koncentrace MTX v médiu s použitím 200 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml, 2000 ng/ml, 5000 ng/ml a 10000 ng/ml. Po 5 měsících kultivace byla pro následující experimenty vybrána osteosarkomová buněčná linie odolná vůči léčivu (MG-63/MTX) stabilně rostoucí v 10000 ng/ml MTX.

 

 

1.5.2 Vytvoření modelu nahé myši s osteosarkomem rezistentním na léčivo

Zvířecí model osteosarkomu byl založen s odkazem na literaturu [10]. Buňky MG-63/MTX byly připraveny do buněčné suspenze 4×10⁶/100 μl a 100 μl bylo injikováno subkutánně do axily nahých myší, aby se pozorovala tvorba nádoru.

1.5.3 Seskupování zvířat a intervence

Nahé myši nesoucí nádor byly náhodně rozděleny do modelové skupiny, skupiny MTX, skupiny MTX kombinované s CPhG (MTX-CPhGs), skupiny CPhG s vysokou dávkou (CPhGs-H), skupiny CPhG se střední dávkou (CPhGs-M) a skupiny CPhG s nízkou dávkou (CPhGs-L) u každé myši. Žaludeční sonda byla zahájena 6. den po modelování. Myším v modelové skupině bylo podáváno 10 ul/g normálního fyziologického roztoku denně sondou; skupina MTX dostávala intraperitoneální injekci 20 mg/kg MTX každé tři dny; skupina MTX-CPhG dostávala denně 250 mg/kg CPhG v kombinaci s intraperitoneální injekcí 20 mg/kg MTX každé tři dny; skupina CPhGs-H dostávala denně 500 mg/kg CPhG žaludeční sondou; skupina CPhGs-M dostávala denně 250 mg/kg CPhGs; skupina CPhGs-L dostávala denně 125 mg/kg CPhG žaludeční sondou. Všechny nahé myši byly léčeny nepřetržitě po dobu 15 dnů.

1.5.4 Měření objemu a hmotnosti nádoru u nahých myší s osteosarkomem odolným vůči lékům

Objem nádoru nahých myší v každé skupině byl pozorován a zaznamenán a byly vyneseny křivky růstu nádoru. Dvacet čtyři hodin po posledním podání byly myši usmrceny cervikální dislokací, nádory byly vypreparovány a zváženy a byla vypočtena rychlost inhibice nádoru. Vzorce jsou následující: Objem nádoru=1/2 (dlouhý průměr nádoru × krátký průměr nádoru²) Míra inhibice nádoru=[(průměrná hmotnost nádoru modelové skupiny – průměrná hmotnost nádoru léčebné skupiny)/průměrná hmotnost nádoru modelové skupiny] × 100 %

1.5.5 Detekce sérových hladin IL-2 a TNF- pomocí ELISA

Sérum bylo extrahováno z nahých myší v každé skupině a sérové ​​hladiny IL-2 a TNF- byly detekovány testem ELISA podle pokynů výrobce.

1.5.6 Detekce apoptózy nádorových buněk průtokovou cytometrií

Nádorové tkáně z každé skupiny byly rozemlety, rozemlety, zfiltrovány, odstředěny a červené krvinky byly lyžovány za účelem přípravy jednobuněčných suspenzí v centrifugačních zkumavkách. Koncentrace buněk byla upravena na 1 x 10⁶/ml, buňky byly resuspendovány ve 100 ul vazebného pufru, přidáno 5 μl AV-FITC a PI, inkubováno ve tmě po dobu 15 minut, centrifugováno, resuspendováno a přidáno 400 ul vazebného pufru. Po smíchání byly vzorky detekovány průtokovou cytometrií.

1.5.7 Detekce p-AKT, p-mTOR, p-PI3K a apoptotických proteinů Bcl-2, Bax pomocí Western blotu

Nádorové tkáně z každé skupiny byly rozemlety a umístěny do homogenizátoru, lyžovány pufrem pro lýzu proteinů a homogenizovány. Po lýze byl supernatant shromážděn centrifugací při 12 000 ot./min. Elektroforetický gel byl připraven pro separaci proteinů s následným membránovým přenosem a blokováním. Membrány byly inkubovány s primárními protilátkami při 4 stupních přes noc, promyty a inkubovány se sekundárními protilátkami při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí pufrem TBST na třepačce byl pro vyvolání přidán luminiscenční roztok ECL. Po fixaci byla provedena gelová obrazová analýza a pomocí softwaru Image J byly analyzovány hodnoty šedé proužků proteinu.

1.6 Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism 7 a SPSS 25.0. Data měření byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (x ± s). Pro srovnání mezi skupinami s normálním rozdělením a homogenním rozptylem byla použita jednocestná ANOVA a pro data s nenormálním rozdělením byl použit neparametrický test. K analýze rychlosti inhibice nádoru byl použit párový t-test. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

 

 

Obrázek 1. Morfologické srovnání buněk MG-63 a MG-63/MTX (×200)

2 Výsledky

2.1 Osteosarkom MG-63 buněčná linie rezistentní na léky (MG-63/MTX)

Původní MG-63 buňky rostly adherentně se střední velikostí, většinou vřetenovitého tvaru, občas nepravidelné, s velkými jádry a jasnými jadérky (obrázek 1-A). Buňky MG-63/MTX byly protáhlé, vřetenové nebo nepravidelné, se zřejmými pseudopodiemi (obrázek 1-B).

2.2 Srovnání růstu nádoru u myší každé skupiny

Od 6. dne žaludeční sondy byl objem nádoru v léčených skupinách významně menší než v modelové skupině. 21. den žaludeční sondy byly porovnány nádory ze 3 nahých myší v každé skupině (obrázek 2-A). Objem nádoru ve všech léčených skupinách byl menší než v modelové skupině (P < 0,001). Objem nádoru ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L a MTX-CPhGs byl menší než ve skupině MTX (P < 0,001). Mezi skupinami CPhGs objem nádoru postupně klesal se zvyšující se koncentrací léčiva a rozdíl od modelové skupiny se stal významnějším (obrázek 2-B). Výsledky ukázaly, že CPhG by mohly významně inhibovat růst nádoru u myší s nádorem rezistentním vůči lékům a inhibiční účinek pozitivně koreloval s koncentrací CPhG.

Ve srovnání s modelovou skupinou byla průměrná hmotnost nádoru ve skupinách MTX, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L a MTX-CPhGs významně snížena (P < 0,001). Ve srovnání se skupinou MTX byla míra inhibice nádoru ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L a MTX-CPhGs významně zvýšena a ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M a CPhGs-L se míra inhibice nádoru zvyšovala v závislosti na dávce se zvyšující se koncentrací léku (tabulka).

2.3 Účinky CPhG na sérové ​​hladiny IL-2 a TNF- u nahých myší s nádory rezistentními vůči lékům

Ve srovnání s modelovou skupinou byla hladina TNF- v séru ve skupině MTX významně zvýšena (P < 0,05) a hladiny TNF- a IL-2 v séru ve skupině MTX-CPhGs byly významně zvýšeny (P < 0,01). Kromě toho byly hladiny TNF- v séru ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M a CPhGs-L významně vyšší než v modelové skupině (P < 0,001), hladina IL-2 v séru ve skupině CPhGs-M byla zvýšena (P < 0,01) a hladiny IL-2-H v séru výrazněji vzrostly ve skupinách CPLGs-PhGs (CPLGs <0,001) 0,001). Ve srovnání se skupinou MTX byly hladiny TNF- a IL-2 v séru ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L a MTX-CPhGs významně zvýšeny (P < 0,001) (tabulka 2). To naznačuje, že CPhG mohou zlepšit vrozenou imunitní funkci u myší s nádorem s OS rezistentním na léky regulací exprese TNF- a IL-2.

 

Obrázek 2. Porovnání objemů nádorů u nahých myší s nádory v každé skupině po intervenci (x ± s, n=3, mm3)

Poznámka: Modelová skupina; skupina MTX; skupina CPhGs-L; skupina celkových glykosidů Cistanche deserticola s nízkou dávkou fenylethanolu; skupina CPhGs-M; střední dávka Cistanche deserticola fenylethanol skupina celkových glykosidů; skupina CPhGs-H; vysoká dávka Cistanche deserticola fenylethanol skupina celkových glykosidů; skupina MTX-CPhGs; ve srovnání se skupinou Model, ***P<0.001; compared with the MTX group, ###P<0.001

Tabulka 1. Účinek fenylethanoidových glykosidů Cistanche na hmotnost nádoru u nahých myší s nádorem (n=3)

Skupina	Průměrná hmotnost nádoru (g)	Míra inhibice (%)
Model	0.79 ± 0.04	-
MTX	0.49 ± 0.03	35.73 ± 4.61
CPhGs–L	0.33 ± 0.01	58.55 ± 4.02
CPhGs–M	0.31 ± 0.02	60.50 ± 0.98
CPhGs–H	0.28 ± 0.01	64.58 ± 1.77
MTX–CPhG	0.18 ± 0.01	75.77 ± 1.78

*Poznámka: Skupina "Model" nemá ve zdrojové tabulce uvedenou míru inhibice (zobrazeno jako pomlčka). Pokud chcete, mohu také přidat značky významnosti (např., ## atd.) jako poznámky pod čarou přesně jako na obrázku.

2.4 Účinky CPhG na apoptózu nádorových buněk u nahých myší s nádory rezistentních vůči lékům

Ve srovnání s modelovou skupinou byla míra apoptózy tumoru významně zvýšena ve skupinách MTX a CPhGs-L (P < 0,05) a ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M a MTX-CPhGs byla zvýšena výrazněji (P < 0,001). Ve srovnání se skupinou MTX byla míra apoptózy nádoru ve skupinách CPhGs-H, CPhGs-M a MTX-CPhGs zvýšena (P < 0,001) (obrázek 3, tabulka 3). Výše uvedené výsledky ukazují, že CPhG mohou podporovat apoptózu nádorových buněk u nahých myší s nádorem rezistentním vůči lékům.

2.5 Účinky CPhG na expresi p-AKT, p-mTOR a p-PI3K v nádorových tkáních nahých myší s nádory rezistentních vůči lékům

Ve srovnání s modelovou skupinou byla exprese p-AKT v nádorových tkáních nahých myší rezistentních na léky ve skupině MTX významně snížena (P < 0,001). Hladiny exprese p-AKT, p-mTOR a p-PI3K v nádorových tkáních nahých myší ve skupinách MTX-CPhGs, CPhGs-H a CPhGs-M byly signifikantně sníženy (P < 0,001), exprese p-AKT ve skupině CPhGs-L byla snížena (P < 0,01 a exprese p-P-P3 významně snížena) 0,001). Ve srovnání se skupinou MTX byly hladiny exprese p-AKT, p-mTOR a p-PI3K v nádorových tkáních nahých myší ve skupinách MTX-CPhGs a CPhGs-H také významně sníženy (P < 0,001), exprese p-AKT ve skupině CPhGs-M byla mírně snížena (exprese P < 0,05 a p-KP3 byla významně snížena), výrazněji snížena exprese p-p-m 0,001), exprese p-AKT ve skupině CPhGs-L byla snížena (P < 0,01) a exprese p-mTOR a p-PI3K byla snížena výrazněji (P < 0,001) (obrázek 4-A až 4-D).

 

Tabulka 2. Hladiny exprese TNF- a IL-2 v séru v každé skupině (n=3)

Skupina	TNF- (pg/ml)	IL-2 (pg/ml)
Model	79.90 ± 3.60	28.36 ± 2.35
MTX	93.71 ± 2.86*	28.87 ± 1.60
MTX–CPhG	118.00 ± 3.78***###	40.92 ± 1.54***###
CPhGs–H	122.76 ± 2.97***###	45.03 ± 4.95***###
CPhGs–M	117.52 ± 3.60***###	41.44 ± 3.87***###
CPhGs–L	124.19 ± 8.37***###	44.77 ± 2.31***###

 

Poznámky (jak je znázorněno na obrázku):Model=skupina modelů; MTX=skupina methotrexátu; CPhGs–L/M/H=skupina fenylethanoidových glykosidů Cistanche s nízkou/střední/vysokou dávkou; skupina kombinací MTX–CPhGs =. Význam vs. model: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

2.6 Účinky CPhGs na expresi Bcl-2 a Bax v nádorových tkáních nahých myší s nádory rezistentních vůči lékům

Ve srovnání s modelovou skupinou byla exprese Bax v nádorových tkáních nahých myší rezistentních vůči lékům ve všech léčebných skupinách významně zvýšena (P < 0,001), exprese Bcl-2 ve skupině MTX byla zvýšena (P < 0,05) a exprese Bcl-2 ve skupinách MTX-CPhGs, CPhGs-H a CPhGs-M byla významně snížena (01 < 0P). Ve srovnání se skupinou MTX byla exprese Bcl-2 v nádorových tkáních skupin CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L a MTX-CPhGs významně snížena (P < 0,001) a exprese Bax ve skupinách CPhGs-H a CPhGs-M byla významně zvýšena (P <,4,4-F4E) (Obr. Aure 4-F4). Dále ukazuje, že CPhG mohou podporovat apoptózu nádorových buněk u nahých myší nesoucích nádory rezistentní na léky regulací exprese Bcl-2 a Bax.

 

 

3 Diskuse

Rezistence na chemoterapii a imunosuprese u pacientů s OS jsou překážkami v klinické léčbě OS. V současnosti je hlavním mechanismem protinádorových léků podpora apoptózy nádorových buněk, což přímo odráží účinnost chemoterapie; na druhé straně je imunita těla silnou zárukou pro pacienty tolerovat chemoterapeutika. Proto je klíčové studovat, jak účinně podporovat apoptózu buněk OS rezistentních na léky a snížit poškození imunity vyvolané chemoterapií.

Obrázek 3. Rychlost apoptózy buněk nádorové tkáně v každé skupině myší (n=3, %)

Poznámka: A. Modelová skupina; B. Methotrexátová (MTX) skupina; C. Methotrexát kombinovaný s Cistanche deserticola skupina celkových glykosidů fenylethanolu (MTX-CPhGs); D. Skupina celkových glykosidů fenylethanolu (CPhGs-H) ve vysoké dávce Cistanche deserticola; E. Skupina celkových glykosidů fenylethanolu (CPhGs-M) se střední dávkou Cistanche deserticola; F. Skupina celkových glykosidů fenylethanolu (CPhGs-L) v nízké dávce Cistanche deserticola.

Tabulka 3. Míra apoptózy buněk nádorové tkáně v každé skupině (n=3)

Skupina	Míra apoptózy (%)
Model	14.47 ± 1.10
MTX	19.77 ± 1.32*
MTX–CPhG	29.21 ± 0.77***###
CPhGs–H	31.66 ± 1.93***###
CPhGs–M	30.13 ± 2.16***###
CPhGs–L	22.49 ± 3.02**

Poznámky (jak je znázorněno na obrázku):Model=skupina modelů; MTX=skupina methotrexátu; CPhGs–L/M/H=skupina fenylethanoidových glykosidů Cistanche s nízkou/střední/vysokou dávkou; skupina kombinací MTX–CPhGs =. Význam vs. model: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

 

 

Cistanche deserticolamá farmakologické účinky prohřívání ledvin a doplnění esence, zvlhčení střev, antioxidační a zlepšení imunity. Zhang a kol. [11] v roce 1988 uvedl, že vodný extrakt zCistanche deserticolamůže zlepšit imunitní funkci a stimulovat vývoj imunitních orgánů, jako je brzlík u myší. Následujícíin vivostudie to dále zjistilyCistanchepolysacharidy měly účinky proti rakovině plic a proti sarkomu [12]. Studie ukázaly, že CPhG, hlavní složkaCistanche deserticola, má farmakologické účinky, jako je antioxidační, anti-aging, neuroprotekce, posílení imunity, ochrana jater a léčba spermatogenních poruch [13], a také má protinádorové a imunitu zvyšující účinky na různé zhoubné nádory včetně rakoviny jater, plic, rakoviny prsu a rakoviny vaječníků [14]. Naše předchozí studie to zjistilaCistanche deserticolaby mohly podporovat apoptózu buněk OS rezistentních na lékyin vitrosnížením exprese MRP1 a mutantních proteinů P53 [15]. Tato studie zjistila, že objem a hmotnost nádoru v léčebných skupinách byly menší než v modelové skupině a objem nádoru ve skupinách s různými koncentracemi CPhG a skupině MTX-CPhG byl také menší než ve skupině MTX, se zvýšenou mírou inhibice nádoru. To ukazuje, že CPhG mohou významně inhibovat růst nádoru u myší s nádorem s OS rezistentním na léčivo a inhibiční účinek pozitivně koreluje s koncentrací CPhG, což je v zásadě v souladu se studií Hou et al. [16] o inhibičním účinku CPhG na subkutánně transplantované nádory u myší nesoucích hepatom H22.

Imunitní funkce úzce souvisí s výskytem a rozvojem nádoru. IL-2 je typ buněčného růstového faktoru v imunitním systému, který může zlepšit imunitní funkci těla podporou proliferace a diferenciace T buněk a produkovat imunitní buňky s protinádorovou aktivitou [17]. TNF- vykazuje protinádorové účinky vazbou na receptory, aby vyvolal apoptózu nádorových buněk, zvýšil imunitní funkci hostitele, působí na vaskulární endoteliální buňky nádoru, zvyšuje vaskulární permeabilitu, indukuje programovanou smrt a následně způsobuje krvácení a nekrózu nádoru [18]. Analýza sérové ​​exprese IL-2 a TNF- u myší každé skupiny ukázala, že hladiny exprese sérového TNF- a IL-2 u modelových myší s nádorem různých skupin koncentrace CPhGs a skupiny MTX-CPhGs byly významně zvýšeny. To naznačuje, že CPhG mohou zlepšit imunitní funkci u myší s nádorem s OS rezistentním vůči lékům regulací exprese TNF- a IL-2, inhibovat proliferaci buněk osteosarkomu rezistentních vůči lékům, a tak vykazovat protinádorové účinky.

 

Obrázek 4. Diagram výsledků elektroforézy proteinů p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 a Bax v nádorové tkáni nahých myší (x ± s, n=3, mm3)

Poznámka: Model, modelová skupina; MTX, skupina methotrexátu; MTX-CPhGs, metotrexát kombinovaný s Cistanche deserticola fenylethanolová skupina celkových glykosidů; CPhGs-L, skupina celkových glykosidů Cistanche deserticola fenylethanol v nízké dávce; CPhGs-M, střední dávka Cistanche deserticola fenylethanol skupina celkových glykosidů; CPhGs-H, vysoká dávka Cistanche deserticola fenylethanol skupina celkových glykosidů; A. Výsledky Western Blot proteinů p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 a Bax; B. p-mTOR; C. p-PI3K; D. p-AKT; E. Bcl-2; F. Baxa; Ve srovnání s modelovou skupinou, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Ve srovnání se skupinou MTX # P < 0,05, ## P < 0,01, ### P < 0,001.

 

Fosforylace AKT v signální dráze PI3K/AKT/mTOR může přímo nebo nepřímo regulovat řadu faktorů souvisejících s apoptózou, jako je rodina Bcl-2, X-vázaný inhibitor apoptózového proteinu (XIAP), myší double minute 2 (MDM-2) a X protein spojený s Bcl-2 (Bax) [19]. Abnormálně aktivovaná signální dráha PI3K/AKT/mTOR může up-regulovat expresi membránových transportérů ABCB1 a ABCC1, a tím snížit účinnost chemoterapie a zprostředkovávat rezistenci OS na chemoterapeutika [20]. Různé monomery tradiční čínské medicíny mohou podporovat apoptózu buněk OS inhibicí signální dráhy PI3K/AKT/mTOR, jako je prokyanidin B2, kvercetin, luteolin aLactarius deliciosuspolysacharidy [21]. Tato studie zjistila, že při jednorázovém působení MTX byla exprese proteinu p-AKT významně snížena, zatímco exprese proteinu p-mTOR a p-PI3K nevykazovala žádný významný rozdíl, což naznačuje, že MTX má malý účinek na signální dráhu PI3K/AKT/mTOR v nádorových tkáních nahých myší s nádorem rezistentním vůči lékům. Exprese proteinů p-AKT, p-mTOR a p-PI3K v nádorových tkáních nahých myší s OS s nádorem rezistentním vůči lékům v různých skupinách koncentrace CPhGs a skupině MTX-CPhGs byla nižší než v modelové skupině a také významně nižší než ve skupině MTX, což ukazuje, že CPhGs má významný inhibiční účinek na léčivo/rezistentní buňky v dráze AKTm. Detekce apoptózy nádorových buněk průtokovou cytometrií ukázala, že míra apoptózy nádoru v každé skupině byla po lékové intervenci významně zvýšena. Detekce exprese proteinu Bax a Bcl-2 ukázala, že exprese Bax v nádorových tkáních nahých myší s OS s nádorem rezistentním na léky ve skupinách s různými koncentracemi CPhGs a skupině MTX-CPhGs byla významně zvýšena, zatímco exprese Bcl-2 v nádorových tkáních modelových myší ve skupinách MTX-CPhGs, CPhGs-H a CPhGs.-M byla významně snížena To naznačuje, že určitá koncentrace CPhG může podporovat apoptózu buněk OS odolných vůči lékůmin vivoinhibicí signální dráhy PI3K/AKT/mTOR, down-regulací exprese Bcl-2 a up-regulací exprese Bax.

Závěrem lze říci, že CPhG mohou podporovat apoptózu buněk OS rezistentních na léky a inhibovat růst nádoruin vivoa jeho mechanismu lze dosáhnout inhibicí signální dráhy PI3K/AKT/mTOR a regulací exprese Bcl-2 a Bax. Mezitím mohou CPhG zlepšit imunitní funkci u myší s nádorem s OS rezistentním vůči lékům zvýšením hladiny exprese TNF- a IL-2, čímž se projeví synergické protinádorové účinky. Potenciál jeho klinické aplikace však stále vyžaduje další zkoumání a výzkum.

 

Reference

1 Zhang C, Hu J, Zhu K, et al. Přežití, komplikace a funkční výsledky cementovaných megaprotéz pro osteosarkom vysokého stupně kolem kolene[J]. Int Orthop, 2018, 42(4):927-938. DOI:10.1007/s00264-018-3770-9.2 Liu Q, Xu R, Xu X a kol. Charakteristika a význam podskupin T lymfocytů v periferní krvi myší s osteosarkomem[J]. Transl Cancer Res, 2022, 11(6):1503-1509. DOI:10.21037/tcr22-264.3 Wu W, Jing DD, Cao L a kol. Současný stav a vyhlídky imunoterapie osteosarkomu[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(7):721-726. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1281.4 Wang CZ, Liu YF, Zhang XQ a kol. Pokrok ve výzkumu mechanismu astragalosidu Ⅳ regulujícího protinádorové působení imunitních buněk[J]. Čínský archiv tradiční čínské medicíny, 2024, 42(11):145-149. DOI:10.13193/j.issn.1673-7717.2024.11.029.5 Zhang J, Yu XH, Yan YG a kol. Signalizace PI3K/Akt u osteosarkomu[J]. Clin Chim Acta, 2015, 444:182-192. DOI:10.1016/j.cca.2014.12.041.6 Hu Q, You SP, Liu T a kol. Výzkum účinku cistanche proti rakovině jater[J]. Karcinogeneze, teratogeneze a mutageneze, 2018, 30(3):194-199. DOI:10.3969/j.issn.1004-616x.2018.03.006.7 Qi XX, You SP, He ZX a kol. Účinek fenylethanolového glykosidu Cistache deserticola na proliferaci a apoptózu buněk HepG2 in vitro[J]. Journal of Xinjiang Medical University, 2021, 44(9):1041-1047. DOI:10.3639/j.issn.1009-5551.2021.09.012.8 Panaampon J, Sasamoto K, Kariya R, et al. Vznik nahých myší bez NK buněk a jejich aplikace pro xenoimplantáty lidských nádorů[J]. Asian Pac J Cancer Předchozí, 2021, 22(4):1069-1074. DOI:10.31557/APJCP.2021.22.4.1069.9 Yu CB, Sun P, Zhang XW a kol. Studie na zvířecím modelu xenoimplantátu rakoviny slinivky u nahých myší[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2012, 12(9):1648-1650. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.10 Xu XR, Wang N, Sun MM a kol. Různé účinky u myší s modelem osteosarkomu s akupunkturou v jednom bodě a kompatibilitou akupunkturních bodů[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35(5):2271-2276. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.11 Zhang HQ, Zhang AX, Du NS, et al. Účinky Cistanche deserticola na imunitní funkce myší[J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1988, (12):736-737, 710. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZZXJ198812019.htm.12 Zhang HQ, Xu AH, Li DD. Farmakologické účinky polysacharidů Cistanche na nádory a myši nesoucí nádory[J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1997, (S1):155-156, 294. https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapnmsDqon66yc8-zI2VqwJgixywPNSnAl0qboPnZqB4FNuT0bsHSSvs0Dn72KJ2ZeQ_Sv -S-Wcbp5ClislhRETaTYT6KGBMKP3_EreGXg3-BH52Itk0rqWiNksajNxzld06uvdfRzCDj-utLfgfANyySxJMHM-g==&uniplatform{}=46{163}NZK{163} Xue HY, Jiao CY, Yao J. Současný stav farmakologických účinků glykosidů Cistanches Herba[J]. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 2018, 34(4):486-488. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.04.026.14 Tang Y, Wu JQ. Protinádorové účinky fenylethanoidových glykosidů zbavených z Cistanche deserticola[J]. Current Biotechnology, 2023, 13(3):399-405. DOI:10.19586/j.2095-2341.2023.0040.15 Xu W, Ding JX, Xie XW a kol. Účinek Cistanche deserticola na buňky osteosarkomu rezistentní na chemoterapii a expresi MRP1 a P53[J]. Journal of Li-shizhen Traditional Chinese Medicine, 2021, 32(3):551-554. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2021.03.11.16 Hou XT, Liu T, Su DQ. Protinádorový účinek fenylethanolových glykosidů z Cistanche deserticola na myši nesoucí nádor H22[J]. Journal of Toxicology, 2021, 35(3):231-235, 240. DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2021.03.010.17 Zhang XY, Wang D, Fu CX, et al. Pokrok ve výzkumu léčby nádorů interleukinem-2[J]. Oncology Progress, 2024, 22(6):581-585, 618. DOI:10.11877/j.issn.1672-1535.2024.22.06.01.18 Gao SY, Li D. Pokroky ve výzkumu faktoru nekrózy nádorů a rakoviny[J] Čínský farmakologický bulletin, 2020, 36(9):1209-1213. DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2020.09.006.19 Zhou H, Hai GF, Zhang T a kol. Pokrok ve výzkumu dráhy PI3K/AKT/mTOR a jejích cílených inhibitorů v léčbě rakoviny[J]. China Pharmaceuticals, 2023, 32(5):127-135. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2023.05.030.20 Liu YJ, Cao YH, Kuang R. Výzkumný pokrok mechanismu nádorové mnohočetné rezistence a zvrácení tradiční čínské medicíny[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024, 59(7):561-570. DOI:10.11669/cpj.2024.07.001.21 Yang HD, Li N, Xie XW a kol. Monomery čínské medicíny v léčbě osteosarkomu regulací signální dráhy PI3K/Akt/mTOR: přehled[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2023, 29(3):254-262. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221527.