Aktivace makrofágů nízkomolekulárními sacharidy z Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

［Abstchvat

Zkoumat imunitní aktivační účinek a mechanismus nízkomolekulárních sacharidů zCistanche deserticola(LMSC) na myších peritoneálních makrofázích, RAW264. 7 buněk. RAW264. 7 buněk bylo rozděleno do normální kontrolní skupiny, LPS pozitivní kontrolní skupiny a LMSC léčebných skupin. RAW264. 7 buněk bylo ošetřeno různými koncentracemi LMSC od 3,91 do 62,5 g·l - 1. K detekci fagocytární aktivity makrofágů byl použit test neutrální červeně. Uvolňování NO bylo detekováno pomocí sady NO a hladiny exprese proteinů související s aktivací makrofágů (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IκB, p-IκB, NF-κB a p-NF-κB) byly detekovány Western blotem. Výsledky ukázaly, že LMSC měl aktivační účinek na makrofágy; může významně zvýšit uvolňování NO v RAW264. 7 buněk a podporují expresi cytokinů TNF- a IL-6. Navíc LMSC významně zvýšil fosforylaci IKK, IkB a NF-KB p65. Kromě toho jedna z hlavních složek mannitolu v LMSC významně zvýšila fagocytární aktivitu makrofágů. Tyto výsledky ukázaly, že LMSC může aktivovat makrofágy up-regulací signální dráhy NF-KB a mannitol může být jednou z hlavních aktivních složek v LMSC.

［Klíčová slova］ Sacharidy s nízkou molekulovou hmotností; Cistanche deserticola; imunitní aktivace; makrofág; zánětlivý faktor; NF-KB

Cistanche deserticola YC Maje rostlina patřící do roduCistanche deserticolaYC Ma. Jeho dužnatý stonek lze použít jako lék. Má funkce vyživování jangu ledvin, vyživující esence a krve a zvlhčování střev. Je známý jako "pouštní ženšen". Chemické složky Cistanche zahrnují fenylethanoidní glykosidy, iridoidní glykosidy, cukry, lignany a mnoho dalších typů. Moderní farmakologické studie zjistily, že Cistanche má mnoho biologických aktivit, jako je neuroprotekce, protinádorová, imunitní regulace, protizánětlivé a antioxidační účinky [1]. Studie ukázaly, že odvar z Cistanche a polysacharidů může významně zlepšit fagocytární schopnost a sekreční funkci makrofágů [2-3]. Neexistuje však žádná zpráva o výzkumu aktivity jeho nízkomolekulárních sacharidů. Proto tato studie použila in vitro kultivační systém RAW264. 7 myších peritoneálních makrofágů k prozkoumání imunomodulační aktivity a souvisejících mechanismů sacharidů Cistanche s nízkou molekulovou hmotností. Tento výzkum může poskytnout více experimentálních důkazů pro komplexní pochopeníImunomodulační účinek Cistanchev budoucnu, aby bylo možné dále řídit jeho klinickou aplikaci.

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

1. Materiály

RAW264. 7 buněk bylo zakoupeno od buněčného centra Čínské akademie lékařských věd; fetální bovinní sérum (FBS) bylo zakoupeno od PAN Biotech, Německo; antibiotika a médium DMEM byly zakoupeny od Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolysacharid od Escherichia coli O55:B5 (LPS) byly zakoupeny od Sigma Company, USA. Souprava oxidu dusnatého (NO) byla zakoupena od Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering. ECL chemiluminiscenční kit byl zakoupen od Thermo Fisher, USA; protilátka byla zakoupena od Cell Signaling Technology, USA; Celkové glykosidy cistanche, nízkomolekulární cukry cistanche a polysacharidy cistanche si naše výzkumná skupina sama vyrobila. Hmotnostní podíl celkových glykosidů cistanche byl 78,76 procenta. Hmotnostní zlomek nízkomolekulárních cukrů zCistanche deserticolaje 58, 00 procent a hmotnostní zlomekCistanche deserticolapolysacharidů je 65. 24 procent . Tanon-5200Multi gelový zobrazovací dělený systém byl zakoupen od Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Čtečka mikrodestiček Sunrise-Basic byla zakoupena od společnosti TECAN.

2. Metoda

2. 1 Neutrální červená metoda pro měření fagocytární aktivity makrofágů

Vezměte myší peritoneální makrofágy v logaritmické růstové fázi, po trypsinizaci, spočítejte buňky, upravte počet buněk na 5 × 104 buněk/ml a naočkujte je do 96-jamkové destičky pro kultivaci buněk, 100 μl/jamku , při 37 stupních Kultivováno za podmínek 5 procent CO2, poté, co buňky přilnou ke stěně, zlikvidujte kultivační supernatant, přidejte médium DMEM (10 procent FBS plus 1 procento P/S), LPS (1 mg·l – 1) a Cistanche cistanche respektive celkové glykosidy,Cistanchebyly kultivovány celkové polysacharidy a nízkomolekulární cukry Cistanche cistanche (3,91 ~ 62,5 g·L -1, v tomto pořadí, filtrované přes filtrační membránu před podáním). Po kultivaci po dobu 48 hodin přidejte do každé jamky 100 μl 0,075% neutrálního červeného fyziologického roztoku, pokračujte v kultivaci po dobu 4 hodin, odsajte supernatant, promyjte 3krát PBS, přidejte buněčný lyzát (ledová kyselina octová -ethanol 1:1) 100 μl, umístěte jej na 2 hodiny do 4 stupňů a po lýze buněk změřte absorbanci (A540 nm).

2. 2 Detekce množství uvolněného NO v buněčném supernatantu

Naočkujte RAW264. 7 buněk v 48-jamkové destičce (1 × 105 buněk/ml, 500 μl/jamku), po inkubaci přes noc odsajte médium buněčné kultury, přidejte médium DMEM (10 procent FBS plus 1 procento P/S), 500 μl každého z LPS (1 mg·L -1) a celkových glykosidů Cistanche cistanche, celkových polysacharidů a cukrů s nízkou molekulovou hmotností (3,91 ~ 62,5 g·L -1, v tomto pořadí). Po 24 hodinách indukční kultivace byl odebrán supernatant. Stanovte koncentraci NO v buněčném supernatantu každé skupiny pomocí sady NO, postupujte podle pokynů a nakonec detekujte absorbanci (A570 nm) pomocí čtečky mikrodestiček

2. 3. Western blot

Naočkujte RAW264. 7 buněk do 6-jamkové destičky, po inkubaci přes noc odsajte médium buněčné kultury, přidejte médium DMEM (10 procent FBS plus 1 procento P/S), LPS (1 mg·l – 1) aCistanchecelkové polysacharidy a cukry s nízkou molekulovou hmotností (3,91 ~ 62,5 g·L -1) byly každý 2 ml a supernatant byl odstraněn po 24 hodinách indukční kultivace. Buňky byly dvakrát promyty PBS a odstraněny. Po trypsinizaci jsou buňky pipetovány dolů. Odstřeďte, odstraňte supernatant, přidejte 10}0 μl lyzačního pufru NP40 a lyzujte na ledu po dobu 40 minut. Po odstředění byl odebrán supernatant a koncentrace proteinu byla stanovena metodou BCA a koncentrace proteinu každého histonu byla rovnoměrně upravena. Odeberte stejné množství vzorků proteinů a oddělte je na 12% SDS-PAGE za konstantního tlaku. Poté pomocí Bio-Rad přenosové elektroforézy přeneste membránu konstantním proudem 350 mA po dobu 1 hodiny a přeneste protein na PVDF membránu (předúprava PVDF membrány: namočte do methanolu a ekvilibrujte přenosovým pufrem). Po blokování 5% odstředěným mlékem (nakonfigurováno s TBST obsahujícím 0,1 procenta Tween-20) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě byla membrána 3krát promyta TBST a membrána byla inkubována v ředidle primární protilátky při 4 stupně přes noc. Membrána byla promyta 3krát TBST každý druhý den a bylo přidáno odpovídající ředidlo pro inkubaci po dobu 1 hodiny. Membrána byla třikrát promyta TBST a proužky byly vyvolány chemiluminiscenční vývojkou ECL.

2. 4 analýza dat

Data jsou vyjádřena jako x ± s a významnost rozdílu je testována pomocí statistického softwaru GraphPad Prism 6 pro jednosměrnou analýzu rozptylu. Vezměte si P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Výsledky

3. 1. Účinky nízkomolekulárních cukrů, celkových glykosidů a celkových polysacharidů Cistanche cistanche na fagocytární aktivitu RAW264. 7 buněk

Výzkum chemických složek Cistanche to ukazujeCistanchehlavně obsahujefenylethanoidové glykosidyiridoidní glykosidy a sacharidy. V tomto experimentu jsou vybrány celkové glykosidy cistanche (včetně fenethylalkoholových glykosidů a iridoidních glykosidů), nízkomolekulární cukry a cukry. U tří aktivních míst celkových polysacharidů byly zkoumány jejich účinky na aktivaci RAW264. 7 buněk. Jak polysacharid Cistanche cistanche, tak i nízkomolekulární cukr cistanche mohou významně zvýšit fagocytární aktivitu RAW264. 7 buněk, ale fagocytární aktivita skupiny, které byly podávány celkové glykosidy, se významně nemění. Kromě toho pozitivní kontrolní lék LPS také významně zlepšil fagocytární aktivitu RAW264. 7, jak je znázorněno na obrázku 1. Výše ​​uvedené výsledky naznačují, že nízkomolekulární cukry a polysacharidy z Cistanche mohou mít vliv na aktivaci RAW264. 7 buněk.

3. 2. Vliv celkových glykosidů Cistanche, nízkomolekulárních cukrů a celkových polysacharidů na obsah oxidu dusnatého (NO) v buněčném supernatantu

Aby bylo možné dále zkoumat aktivační účinek tří aktivních míst Cistanche na RAW264. 7 buněk, byl stanoven obsah NO v buněčných supernatantech stimulovaných různými léky. Výsledky ukázaly, že uvolňování NO ve skupině LPS bylo významně vyšší než ve slepé kontrolní skupině (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistancheneměl žádný významný vliv. Výše uvedené výsledky naznačují, že jak polysacharidy, tak cukry s nízkou molekulovou hmotností Cistanche mohou podporovat uvolňování NO z RAW264. 7 buněk. Mezi nimi je zvláště významný účinek nízkomolekulárních cukrů Cistanche, jak ukazuje obrázek 2.

3. 3. Vliv nízkomolekulárního cukru Cistanche cistanche na expresi TNF- a IL-6 proteinu v RAW264. 7 buněk

TNF- je důležitý zánětlivý mediátor, který se objevuje v procesu aktivace RAW264. 7 buněk, které mohou podporovat syntézu a uvolňování jiných cytokinů (jako je IL-6). Výsledky ukázaly, že exprese TNF- a IL-6 byla významně zvýšena poté, co byl stimulován nízkomolekulární cukr Cistanche cistanche, což naznačuje, že nízkomolekulární cukr Cistanche může podporovat expresi TNF - a IL{11}} v RAW264. 7 buněk, čímž se aktivuje buněčná imunita Fagocytóza, viz obrázek 3.

3. 4. Regulační účinek nízkomolekulárního cukru Cistanche cistanche na signální dráhu IKK /IκB /NF-κB

Abychom prozkoumali potenciální mechanismus nízkomolekulárních cukrů Cistanche cistanche při aktivaci RAW264. 7 buněk, autoři zkoumali jeho regulační účinky na klasickou signální dráhu IKK /IκB /NF-κB. Nízkomolekulární cukr Cistanche cistanche může významně zvýšit fosforylaci NF-κB a fosforylaci jeho upstream klíčových signálních proteinů IKK a IκB a snížit expresi celkového proteinu IκB, což naznačuje, že má aktivační účinek na IKK/ Signální dráha IκB /NF-κB. Podobný regulační účinek má také pozitivní kontrolní lék LPS. Stručně řečeno, nízkomolekulární cukry Cistanche mohou aktivovat signální dráhu IKK/IκB/NF-κB, a tím způsobit syntézu a uvolňování cytokinů, jako jsou TNF- a IL-6, a nakonec způsobit imunitní systém. aktivace RAW264. 7 buněk, viz obrázek 4.

3. 5. Screening účinných látek s účinkem aktivujícím makrofágy v nízkomolekulárních cukrech Cistanche

Naše laboratoř analyzovala obsažené nízkomolekulární cukryCistanchev raném stádiu a zjistili, že obsahuje hlavně mannitol (16,53 procenta), sacharózu (8,34 procenta), fruktózu (25,38 procenta) a glukózu (7,75 procenta) a další složky. Autor tedy použil metodu neutrální červené ke screeningu aktivačního účinku výše uvedených složek na makrofágy. Manitol může významně zvýšit fagocytární aktivitu makrofágů v závislosti na dávce, zatímco účinky ostatních složek nejsou významné. To naznačuje, že mannitol může být jednou z klíčových aktivních složek v nízkomolekulárních cukrech Cistanche cistanche pro aktivaci makrofágů, jak je znázorněno na obrázku 5.

4. Diskuze

Cistanche cistanche, parazitická rostlina z čeledi Lydanaceae, má údajně imunomodulační účinky, měla by tedy obsahovat imunomodulační látky. V tomto experimentu autor zkoumal fagocytární aktivitu myších peritoneálních makrofágů na různých purifikovaných částechCistanchea zjistili, že nízkomolekulární cukry a polysacharidy Cistanche mají účinek na aktivaci makrofágů, ale celkové glykosidy Cistanche nejsou zřejmé. Zároveň autor zjistil, že nízkomolekulární cukry mohou aktivovat makrofágy v nižších koncentracích, proto autoři zvoliliCistanchenízkomolekulární cukry jako těžiště následného výzkumu.

Zkoumáním vlivu nízkomolekulárního cistančového cukru na expresi cytokinů TNF- a IL-6 autoři zjistili, že nízkomolekulární cistančový cukr významně zvýšil expresi TNF- a IL-6, což dále prokázali, že nízkomolekulární cukr cistanche má vliv na myši. Peritoneální makrofágy mají aktivační účinek. Autor tedy dále zkoumal jeho potenciální mechanismus účinku. Proveďte výzkum

Ukázalo se, že bakteriální lipopolysacharid (LPS) může indukovat aktivaci myších makrofágů a myších gliových buněk prostřednictvím signálních drah, jako jsou JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK a MAPK [4-8]. NF-KB dráha je rozpoznána jako klasická dráha, takže signální proteiny na této dráze byly testovány v tomto experimentu. Výsledky ukázaly, že nízkomolekulární cukry Cistanche mohou významně zvýšit fosforylaci NF-KB a fosforylaci klíčových upstream signálních proteinů IKK a IκB, což naznačuje, že nízkomolekulární cukryCistanchemůže aktivovat myší peritoneální obry prostřednictvím signální dráhy IKK/IκB/NF-KB. Fágové buňky uvolňují zánětlivé cytokiny a poté hrají roli v aktivaci buněčné imunity.

V rané fázi laboratoře, chemické složení nízkomolekulárního cukerného extraktu zCistanche deserticolabyl systematicky analyzován. Bylo zjištěno, že nízkomolekulární cukry obsahují hlavně monomery, jako je mannitol, sacharóza, fruktóza a glukóza. Další výzkum zjistil, že mannitol může významně zlepšit fagocytární aktivitu makrofágů. Proto se spekuluje, že mannitol může být klíčovou složkou cukrů s nízkou molekulovou hmotností, která aktivuje buněčnou imunitní funkci.

Stručně řečeno, tato studie použila makrofágy v kultivačním systému Vitro a zjistila, že cukry s nízkou molekulovou hmotnostíCistanchemají významný aktivační účinek na makrofágy a mohou aktivovat myší peritoneální makrofágy prostřednictvím NF-kB signální dráhy, a pak hrát roli. Manitol v cukrech s nízkou molekulovou hmotností může hrát důležitou roli při aktivaci fagocytární aktivity makrofágů.

Reference

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Kultivační techniky pouštní Cistanche a jejího hostitele Tamarix [M]. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Výzkumný přehled farmakologických účinkůCistanche deserticolapolysacharid [J]. Food and Drugs, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan a kol. Makrofágová aktivace Cistanche Polysacharidu [J]. Čínský farmakologický bulletin, 2009, 25 (6): 787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Biologická aktivita a mechanismus bakteriálního lipopolysacharidu [J]. medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao a kol. LPS prostřednictvím dráhy p38/MAPK a aktivace NF-KB indukuje expresi HIF-1 v RAW264. 7 buněk [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41 (10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen a kol. Signální dráha JAK2/STAT3 se podílí na lipo poly Cukrem indukované aktivaci mikroglie［J］. Časopis Třetí vojenské lékařské univerzity, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin a kol. Mulbascum glykosidy inhibují lipopolysacharidy indukovaný zánět BV-2 mikroglie a jeho mechanismus [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41(13): 2506.