Koimunoterapie založená na lipozomech s agonistou TLR a CD47-blokádou kontrolního bodu SIRP pro účinnou léčbu rakoviny tlustého střeva

Abstraktní:

Protinádorová imunita je základní složkou léčby rakoviny a je primárně zprostředkována vrozenou imunitní odpovědí, která hraje klíčovou roli při iniciaci a formování adaptivní imunitní odpovědi. Objevující se důkazy identifikovaly vrozené imunitní kontrolní body a receptory pro rozpoznávání vzorů, jako je CD47 a Toll-like receptor 7 (TLR7), jako slibné terapeutické cíle pro léčbu rakoviny. Na základě fúzního proteinu Fc-CV1, který obsahuje vysokoafinitní variantu SIRP (CV1), a Fc fragmentu lidské protilátky IgG1, jsme využili přípravek, který navázal Fc-CV1 na lipozomy naložené imichimodem (agonista TLR7) ( CILP) aktivně cílit na ČT26. WT modely syngenního nádoru tlustého střeva. Studie in vitro odhalily, že CILPs vykazovaly vynikající vlastnosti trvalého uvolňování a účinnost buněčného příjmu ve srovnání s volným imichimodem. In vivo testy prokázaly, že CILP vykazovaly účinnější akumulaci v nádorech a významnější účinek na potlačení nádorů než kontrolní skupiny. Tento imunoterapeutický přípravek měl výhody nízkých dávek a nízké toxicity. Tyto výsledky ukázaly, že kombinace terapie imunitním kontrolním bodem blokády (ICB) a agonistů přirozené imunity, jako je Fc-CV1 a přípravek liposomů s nabitým imichimodem použitý v této studii, by mohla představovat vysoce účinnou strategii pro léčbu nádorů.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

klíčová slova:

imiquimod; lipozom; Fc-CV1; imunoterapie; rakovina tlustého střeva

1. Úvod

Celosvětový výskyt rakoviny každoročně stoupá, což představuje vážnou hrozbu pro zdraví světové populace a představuje velkou zátěž pro zdravotnické systémy. Podle zprávy Světové zdravotnické organizace došlo v roce 2020 na celém světě k 19,29 milionu nových případů rakoviny a 9,96 milionu úmrtí na rakovinu [1]. S neustálým pokrokem v klinické diagnostice, chirurgii, radioterapii a chemoterapii se však celkové přežití a kvalita života pacientů s rakovinou výrazně zlepšily. Zejména imunoterapie, která vznikla vakcínou Coley v 90. letech 19. století [2], předchází radioterapii i chemoterapii a v posledním desetiletí zaznamenala významný pokrok, z čehož mají prospěch pacienti s rakovinou.

Nádorová imunoterapie byla uznávána pro svou vynikající biokompatibilitu a vysokou specifitu a je schopna vyvolat imunitní reakce k eliminaci nádorových buněk [3–5]. Dvě hlavní strategie nádorové imunoterapie jsou posílení imunity a imunitní normalizace [6]. Vzorce posílení imunity sestávají hlavně z cytokinové terapie, nádorových terapeutických vakcín a monoklonálních protilátek. Toll-like receptory (TLR) jsou považovány za potenciální cíle pro imunoterapii rakoviny kvůli jejich roli při aktivaci vrozeného imunitního systému. Agonisté TLR byli vyvinuti jako imunitní adjuvans a řada agonistů TLR prochází klinickými studiemi [7]. Monofosforyl lipid A a imikvimod, agonisté TLR4 a TLR7, v tomto pořadí, obdrželi schválení od Food and Drug Administration pro klinické použití [7–9]. Imichimod, agonista TLR7 [9], aktivuje imunitní reakce a zesiluje protinádorovou aktivitu spuštěním TLR7 [10,11]. Strategii imunitní normalizace představují léky blokující imunitní kontrolní bod (ICB), které regulují defektní adaptivní nádorovou imunitní odpověď. Od prvního kontrolního inhibitoru, ipilimumabu, který byl schválen pro klinickou aplikaci v USA v roce 2011, učinily inhibitory kontrolního bodu imunitního systému, jako jsou inhibitory PD1/PDL1, průlom v imunoterapii rakoviny [12–14]. Kromě adaptovaných imunitních kontrolních bodů podobných PD1/PDL1 přitáhly velkou pozornost také některé vrozené imunitní kontrolní body, jako je SIRP-CD47, a staly se oblastmi významného zájmu ve vývoji protilátek [15–17].

Kontrolní bod SIRP-CD47 byl poprvé identifikován v roce 1999 [18,19]. SIRP je receptor CD47 exprimovaný v neuronech centrálního nervového systému [20] a myeloidních buňkách, včetně monocytů, makrofágů, granulocytů a dendritických buněk. CD47 je „samooznačující molekula“ exprimovaná na téměř všech normálních buňkách a nadměrně exprimovaná na většině nádorových buněk [21]. Na povrchu nádorových buněk se CD47 váže na SIRP a inhibuje fagocytózu zprostředkovanou makrofágy, která je důležitým prostředkem k imunitnímu úniku nádoru [22]. Bylo prokázáno, že fagocytóza makrofágů v mikroprostředí nádoru může být zesílena, když je blokována vazba CD47 a SIRP [20–25]. Proto byly vyvinuty inhibitory imunitního kontrolního bodu, které blokují dráhu CD47/SIRP a používají se v terapii rakoviny [26].

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

V této studii jsme použili kombinaci imichimodu a fúzního proteinu (Fc-CV1) k léčbě rakoviny tlustého střeva. CV1 je modifikovaný lidský rekombinantní protein SIRP, který má 50000-krát vyšší afinitu k CD47 než původní protein [27]. Fc-CV1 byl zkonstruován pomocí technologie "Knobs-into-holes" založené na CV1 monomeru a Fc fragmentu lidského IgG1. Abychom překonali omezení nízké terapeutické účinnosti a systémové toxicity spojené s imichimodem [28,29], připravili jsme nanolipozomy metodou injekce ethanolu. Nanolipozomy se vyznačují nízkou toxicitou při dodávání léčiv [30,31]. Následně byl imichimod zapouzdřen do lipozomů, které povrchově konjugovaly Fc-CV1. A konečně, tento nový nanopreparát může aktivně dodávat agonisty TLR7 do nádorových tkání a má dvojí funkci jako ICB lék a agonista TLR. Byl použit k léčbě modelu syngenního nádoru tlustého střeva CD47+ CT26.WT [32].

2. Výsledky a diskuse

2.1. Charakterizace LP (prázdné lipozomy), ILP (neCD47-cílené lipozomy zapouzdřené v imikvimodu), CLP (cílené lipozomy CD47) a CILP (spřažené lipozomy Fc-CV1 s imiquimodem (agonista TLR7))

CILP byly úspěšně připraveny injekcí ethanolu a metodou gradientu síranu amonného. Obrázek 1A zobrazuje proces syntézy CILP. Analýza TEM ukázala, že CILP byly sférické a jednotného tvaru (obrázek 1B). Kromě toho výsledek DLS odhalil, že velikost částic čtyř lipozomů byla unimodální distribuce (obrázek 1C). Rychlost vazby (BR) byla ověřena pomocí SDS-PAGE, která je zobrazena na obrázku ID, E. Obrázek ID ukazuje molekulovou hmotnost Fc-CV1 a relativní jas pásu dialyzovaných a předdialyzovaných CILP. BR byla vypočtena na 67,13 ± 37,10 % pomocí skenovací denzitometrie elektroforetických pásů Image J (obrázek 1E), což poskytuje možnost CD47-cílení nádorových buněk.

Obrázek 1. (A) Schematické znázornění syntézy CILP. (B) TEM obraz CILP

HPLC byla použita k detekci účinnosti zapouzdření (EE) imichimodu (doplňkový obrázek S1). Jak je zobrazeno na doplňkovém obrázku S1A, volný imichimod vykazoval významný jediný pík, zatímco CLP nevykazovaly žádný pík za stejných testovacích podmínek (doplňkový obrázek S1B). Proto je možné detekovat CILP přímo za testovacích podmínek. Jak se očekávalo, hodnoty detekce CILP před a po dialýze byly považovány za celkový obsah léčiva a obsah léčiva v liposomech (doplňkový obrázek S1C, D). EE imichimodu byla vypočtena na 85,44 ± 4,11 %. V porovnání s uváděným systémem pro podávání léků s pasivním plněním [33–35] dosáhla tato studie vyšší účinnosti enkapsulace a pohodlnějšího procesu přípravy.

DLS prokázala, že průměry LP byly 111,567 ± 0,655 nm, zatímco CLP, ILP a CILP vykazovaly o něco větší velikost 117,467 ± 0,34{{10} } nm, 120,233 ± 0,776 nm a 13{{30}}.033 ± 0,974 nm, v tomto pořadí (tabulka 1). Změny ve velikosti těchto lipozomů lze připsat modifikaci Fc-CV1 a imichimodu. PDI se blížil 0,1 (tabulka 1), což ukazuje, že tato vehikula pro podávání léčiva byla vysoce homogenní ve své distribuci. Kromě toho byly naměřeny hodnoty zeta-potenciálu LP, CLP, ILP a CILP jako -2,231 ± 0,167 mV, -2,492 ± 0,033 mV, -2,383 ± 0,070 mV, respektive -2,07 ± 7,5 mV, resp. , což naznačuje, že povrchově konjugovaný Fc-CV1 a zapouzdřený imichimod měly malý účinek na náboj liposomů.

Tabulka 1. Průměry, zeta-potenciál, PDI a EE LP, CLP, ILP a CILP.

2.2. Účinnost vychytávání buněk in vitro

Účinnost vychytávání buněk CILPs byla hodnocena prostřednictvím intenzity fluorescence Cy5 pohlceného buňkami CT26.WT za použití systému High-Content Imaging System. Jak je znázorněno na obrázku 2, ve srovnání s volnými skupinami Cy5 a ILP-Cy5, skupiny CILPs-Cy5 vykazovaly silnější kapacitu příjmu buněk po 30 minutách inkubace. Z těchto výsledků vyplývá, že Fc-CV1 zvyšuje schopnost intracelulárního dodávání imichimodem naplněných lipozomů díky specifické afinitě k receptoru Fc-CV1, což vede k silnějšímu protinádorovému účinku.

Obrázek 2. Obrázky buněk CT26.WT po inkubaci s volným Cy5, ILPs-Cy5 a CILPs-Cy5 (červená) po dobu 0,5 hodiny a barvení DAPI (modrá). Měřítko: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Uvolňovací křivky liposomů

Křivky uvolňování léčiva volného imichimodu, ILP a CILP byly měřeny v simulovaném prostředí in vivo. Obrázek 3 ukazuje, že volný imichimod byl zcela uvolněn po 1 hodině, zatímco rychlost uvolňování (RR) imichimodu, který byl zapouzdřen s ILP a CILP, byl pouze 54,75 ± 4.08 % a 39,70 ± 0,05 % za 12 hodin , resp. Kromě toho by pomalé uvolňování imichimodu v ILP a CILP mohlo být uzavřeno vlastností liposomů s řízeným uvolňováním léčiva. RR imichimodu v ILP a CILP nevykazoval žádný významný rozdíl po 96 hodinách, což ukazuje, že "po vložení" vykazovalo zanedbatelný dopad na membránovou stabilitu lipozomů.

obrázek 3. Křivky uvolňování imichimodu volného imichimodu, ILP a CILP v PBS při 37 ◦C. Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Studie cytotoxicity

Ke studiu cytotoxicity CILPs in vitro byl proveden test CCK{{0}} na buňkách CT26.WT. Jak ukazuje obrázek 4, CILP v nízkých koncentracích (0,1–1 µg/ml) nevykazovaly cytotoxicitu, což je v souladu s bezpečností imunizační terapie. Životaschopnost buněk byla po léčbě 5 µg/ml imichimodem mírně snížena, pravděpodobně kvůli ROS a endoplazmatickému retikulu zprostředkované imunogenní buněčné smrti vyvolané imichimodem [36]. Navíc CILP vedou k významnému snížení životaschopnosti buněk ve srovnání s kontrolními skupinami, což je připisováno synergickému účinku imichimodu a Fc-CV1.

Obrázek 4. Životaschopnost buněk ošetřených Fc-CV1, imichimodem, CLP, ILP a CILP po dobu 24 hodin. Koncentrace Fc-CV1 a imichimodu byly obě 0–10 µg/ml. * p < 0,05, ** p < 0,01, ns=žádné významné rozdíly

2.5. Biodistribuční studie

Distribuce a akumulace různých přípravků v nádorech a hlavních orgánech přímo ovlivňuje terapeutický účinek. Po intravenózním podání byly fluorescenční signály monitorovány za použití blízkého infračerveného vivisekčního systému pro hodnocení distribuce a akumulace různých přípravků v nádorech a hlavních orgánech po 24 hodinách. Jak je znázorněno na obrázku 5, celková intenzita fluorescence ILPs-Cy5 a CILPs-Cy5 byla vyšší než u volného Cy5, což ukazuje, že lipozomy mají vlastnost dlouhé cirkulace in vivo. Kromě toho intenzita fluorescence u skupiny léčené CILPs-Cy5 byla nejvyšší v nádorové tkáni, což by se dalo připsat účinku ligandů Fc-CV1 na cílení nádoru, čímž se zesílil protinádorový účinek. Je překvapivé, že intenzita fluorescence jater a sleziny byla silnější než u jiných orgánů, což je pravděpodobně způsobeno fagocytózou liposomů retikuloendoteliálním systémem (RES) v játrech a ledvinách [37].

Obrázek 5. Distribuce Cy5-fluorescence v nádorech a hlavních orgánech 24 hodin po intravenózním podání. Data jsou uvedena jako průměr ± standardní odchylka (n=3). **** p < 0.0001

2.6. Studie in vivo nádorové inhibice

Terapeutický plán (obrázek 6A) a účinky různých přípravků jsou uvedeny na obrázku 6. Ve srovnání se skupinami s PBS a LP vykazovaly jiné léčebné skupiny určité tumor-supresorové účinky. Je pozoruhodné, že objem nádoru byl po léčbě CILP minimální, což naznačuje, že CILP měly vynikající nádorový supresorový účinek (obrázek 6B).

Obrázek 6. (A) Schematické znázornění léčby rakoviny tlustého střeva na modelu nádoru CT26.WT. (B) Růstové křivky objemu nádoru během období léčby. (C) Relativní fotografie nádoru a (D) hmotnost nádoru odebrané z různých léčených skupin v den 17. (E) Poměr relativní tělesné hmotnosti k tělesné hmotnosti ve srovnání s 0 dnem. Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka (n=5). * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Na konci experimentu byly myši usmrceny a jejich nádory byly vyříznuty, vyfotografovány a zváženy, aby se stanovila terapeutická účinnost různých přípravků. Jak je znázorněno na obrázku 6C, D, léčebná skupina CILP měla nejmenší a nejlehčí nádory ve srovnání s jinými skupinami, což dokazuje, že CILP měly největší supresorové účinky na nádory. Tabulka 2 ukazuje, že míra inhibice růstu nádoru CILP byla vypočtena na 84,35 %. Navíc 84,35% míra potlačení nádoru byla významně vyšší než u skupin CLPs a ILPs, což znamená, že dochází k synergickému efektu blokování osy „nejez mě“ a aktivace imunitní odpovědi. . Ve srovnání s ekvivalentním přípravkem in vitro (2,5–5 µg/ml) byla vyšší míra inhibice úzce spjata s rychlostí imunitní odpovědi aktivované formulací a blokovala mechanismus imunitního úniku in vivo, který nebyl dostupný in vitro.

Tabulka 2. Údaje o hmotnosti nádoru a inhibici růstu nádoru (TGI) různých léčebných skupin.

2.7. CILP zvýšily infiltraci T-buněk a sekreci IFN

Aby se prozkoumalo prostředí imunitních buněk nádorů, byla imunitní buňka indukovaná CILP imunohistochemicky analyzována na konci protinádorového testu. CD4+ a CD8+ T buňky byly zvýšeny v nádorových řezech skupin CILPs (obrázek 7). Společné podávání Fc-CV1 a terapie imichimodem vedlo k významné infiltraci CD4+ a CD8+ T-buněk. Kromě toho došlo k významné sekreci IFN v nádorech podstupujících léčbu CILP, což bylo způsobeno tím, že CILP spouštěly Toll-like receptor 7 a aktivovaly imunitní odpověď.

Obrázek 7. Imunohistochemie myších nádorových tkání; pozitivní buňky jsou zbarveny hnědě. Měřítko, 50 µm (n=5).

2.8. Posouzení biologické bezpečnosti CILP

Biologická bezpečnost terapie zprostředkované CILP byla také důležitým ukazatelem z hlediska přístupu k terapeutickému hodnocení. Během studie inhibice nádoru in vivo CILP neindukovaly významnou ztrátu hmotnosti v období léčby (obrázek 6D). Biochemické parametry jater a ledvin byly všechny v normálním rozmezí podle standardního referenčního rozmezí myší (tabulka 3) a histologie orgánů nevykazovala žádné významné změny, což ukazuje, že CILP mají vynikající biologickou bezpečnost (obrázek 8). Tato zjištění jsou zásadní pro hodnocení potenciálu CILP jako bezpečného a účinného imunoterapeutického činidla pro léčbu rakoviny.

Tabulka 3. Biochemické parametry jater a ledvin

Obrázek 8. H&E (hematoxylin a eosin) barvení hlavních orgánů. Měřítko, 50 µm (n=3)

3. Materiály a metody

3.1. Materiály

Imiquimod byl zakoupen od MedChem Express (Shanghai, Čína). Fc-CV1 poskytla Státní klíčová laboratoř protilátkových léčiv a cílené terapie. Cholesterol, hydrogenovaný lecitin (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS a DSPE-PEGCy5 byly zakoupeny od společnosti Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Čína). 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) bylo získáno od Keygen Biotech (Nanjing, Čína). Síran amonný byl získán od Sinopharm (Shanghai, Čína). Methanol (chromatografická čistota) a acetonitril (chromatografická čistota) byly zakoupeny od společnosti Aladdin Reagent Company (Shanghai, Čína). Ostatní činidla jsou všechna domácí analytické kvality. Myší buněčná linie rakoviny tlustého střeva CT26. WT poskytla buněčná banka Čínské akademie věd. Buňky byly pěstovány v buněčném inkubátoru v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) při 5 % C02 a 95 % vzduchu. Samice myší BALB/c ve věku 4–6 týdnů byly dodány společností Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Čína).

3.2. Příprava prázdných lipozomů

Nejprve bylo přesně naváženo 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 a 4,7095 mg cholesterolu a rozpuštěno v 0,1 ml ethanolu (HSPC: DSPE-PEG2000:cholesterol=55.5: molární poměr 5,05:39,3). Za druhé, ethanolový roztok byl rychle injikován do předehřátého roztoku síranu amonného (250 mM, 1 ml, 65 °C) pomocí injekční stříkačky a poté inkubován po dobu 30 minut při 65 °C za magnetického míchání. Následně byl připravený roztok postupně extrudován přes polykarbonátové membrány (Avanti, Alabaster, AL, USA); velikost byla 200 nm, 100 nm a 50 nm. Nakonec byly výsledným roztokem blank liposomy (LP) s koncentrací lipidů 22,5 mg/ml.

3.3. Příprava CD47 cílených liposomů zapouzdřených v imikvimodu

Nejprve byl DSPE-PEG2000-NHS rozpuštěn v ddH2O (60 ◦C) a poté smíchán s Fc-CV1 a inkubován na třepacím stole při pokojové teplotě po dobu 5 hodin (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 molární poměr). Mechanismus chemické reakce spojení mezi Fc-CV1 a DSPE-PEG2000-NHS zahrnoval reakci NHS esteru s primárním aminem na Fc-CV1 a vytvořil konjugát stolní aminové vazby. Připravený roztok byl proporcionálně smíchán s LP a inkubován při 60 ◦C po dobu 1 hodiny, aby se vložil Fc-CV1 do lipozomů, což bylo pojmenováno "post insertion" [38]. Poměry směsi byly takové, že 2,25 mg Fc-CV1 bylo modifikováno na 22,5 mg lipozomů. Poté byly získány cílené lipozomy CD47 (CLP).

Následně byly CLP umístěny do dialyzačního vaku (300 kDa) a dialyzovány proti HEPES (10 mM, pH=7,4) po dobu 1 hodiny, aby se odstranil síran amonný a zbytkový Fc-CV1 ve vnější vodné fázi. Dialyzované CLP byly inkubovány s roztokem imichimodu (5 mg/ml) v poměru 1 mg až 7 µmol celkových fosfolipidů při teplotě místnosti po dobu 24 hodin a poté dialyzovány proti PBS (300 kDa) třikrát, aby se eliminoval nezapouzdřený imichimod, který gradientová technika síranu amonného [39]. Poté byly získány CILP. Kromě toho byly připraveny neCD47-cílené lipozomy zapouzdřené v imikvimodu (ILP). CLP a ILP byly považovány za kontrolu pro CILP.

3.4. Charakterizace

Morfologie těchto lipozomů byla fotografována transmisním elektronovým mikroskopem (TEM, Joel, Tokyo, Japonsko). Velikost, zeta-potenciál a index disperzity polymeru (PDI) těchto lipozomů byly stanoveny dynamickým rozptylem světla (DLS) a elektroforetickým rozptylem světla (ELS) za použití Malvernova Zeta sizeru ZSE (Malvern, UK). Rychlost vazby (BR) Fc-CV1 vloženého do lipozomů byla měřena elektroforézou na 15% laurylsulfátu sodného-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a softwarem Image J (Bethesda, MD, USA). Enkapsulační účinnost (EE) imiquimodu byla detekována vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

3.5. Studie vychytávání buněk in vitro

In vitro buněčný příjem těchto lipozomů byl stanoven pomocí kumulativní intenzity fluorescence Cy5 v CT26. WT buňky. DSPE-PEG-Cy5 byl inkubován s CILPs a ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs nebo ILPs=1:5 hmotnostní poměr) při 60 ◦C po dobu 1 h, v tomto pořadí, a poté s fluorescenčními lipozomy byly získány CILPs-Cy5 a ILPs-Cy5. Buňky CT26.WT byly nasazeny do 96-jamkových destiček a náhodně rozděleny do tří skupin (1 x 104 buněk/jamka, n=3). Poté, co konfluence buněk dosáhla 50–70 %, byla každá skupina inkubována s volným Cy5, ILPs-Cy5 a CILPs-Cy5, v daném pořadí, po dobu 30 minut při 37 °C, ve kterých byly konečné koncentrace Cy5 1 µg/ml v 0,1 ml média RPMI 1640. Následně byly buňky imobilizovány 4% paraformaldehydem po dobu 15 minut poté, co byly dvakrát promyty PBS, a poté barveny 10 ul DAPI (1 ug/ul) po dobu 10 minut poté, co byly dvakrát promyty PBS. Nakonec byl příjem každé skupiny buněk zaznamenán pomocí High-Content Imaging System (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) po dvojnásobném promytí PBS.

3.6. Studie uvolňování Imiquimodu

Křivky uvolňování různých lipozomů naplněných léčivem byly provedeny pomocí dialyzační metody (300 kDa) a výsledky byly porovnány s roztokem volného imichimodu. Stručně, 0,6 ml ILP, CILP a roztok imichimodu byly odděleně zabaleny do dialyzačních vaků a poté umístěny do 500 ml roztoku PBS (pH=7,4, 37 ◦C). Stejné objemy vzorků byly extrahovány ze sáčků v předem stanovených časových intervalech (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 a 96 h) a rychlost uvolňování (RR) imichimodu byl vypočten pomocí následující rovnice:

kde Sund a Sd představovaly plochu píku HPLC imichimodu v predialyzovaných a dialyzovaných přípravcích v různých časech (n=3).

3.7. Cytotoxicita CILP

CT {{0}}.WT buňky byly nasazeny na 96-jamkovou destičku (1 × 104/jamka, n=3) a kultivovány ve 100 ul média RPMI 1640 až do konfluence těsně dosáhl 70 %. Za účelem stanovení cytotoxicity CILPs bylo médium RPMI 1640 odstraněno z každé jamky a nahrazeno komplexním roztokem CILP a média RPMI 1640 s koncentracemi Fc-CV1 a imichimodu v rozmezí od 0 do 10 ug/ml. Buňky byly inkubovány s komplexním roztokem po dobu 24 hodin. Kromě toho byly buňky, které byly ošetřeny Fc-CV1, CLP, roztokem imichimodu a ILP v podobné koncentraci, považovány za kontrolní skupiny. Přežívající buňky byly detekovány pomocí testu CCK-8 po 24 hodinách a životaschopnost neošetřených buněk byla považována za 100 %.

3.8. Biodistribuční studie

Devět myším samicím BALB/c bylo subkutánně injikováno CT26. Buňky WT (5 × 105 ) v pravém boku a tyto myši nesoucí nádor byly náhodně rozděleny do tří skupin (n=3). Objemy nádorů byly měřeny pomocí posuvného měřítka a byly vypočteny podle následujícího vzorce:

Když objem nádoru dosáhl 100 mm3, byly intravenózně injikovány volné Cy5, ILP-Cy5 a CILPs-Cy5 v dávce Cy5 0,4 mg/kg. Dvacet čtyři hodin po intravenózní injekci byl vyjmut nádor, srdce, játra, slezina, plíce a ledviny. Fluorescenční signály nádorů a hlavních orgánů byly detekovány optickým zobrazovacím systémem IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. Studie in vivo nádorové inhibice

Třicet pět samic myší BALB/c bylo náhodně rozděleno do sedmi skupin (n=5) a 5 × 105 CT26. Buňky WT byly injikovány subkutánně do pravého boku každé myši. Když byla velikost nádoru myši přibližně 100 mm3, bylo zahájeno léčení. PBS, LP, imichimod, Fc-CV1, ILP, CLP a CILP byly intravenózně injikovány ve dnech 0, 4, 8 a 12. Dávka imichimodu byla 2,5 mg/kg v první a druhé injekci a 5 mg/kg ve třetí a čtvrté injekci. Ve všech injekcích byla dávka Fc-CV1 5 mg/kg. Při této dávce byla koncentrace léčiva v těle 2,5–5 µg/ml, což v experimentu in vitro působilo cytotoxicitě na buňky. Průměry nádorů a tělesná hmotnost byly měřeny každý den během léčby. V den 17 byly myším nádory vyjmuty a byla změřena jejich hmotnost. Inhibice růstu tumoru (TGI) byla vypočtena podle následujícího vzorce:

3.10. Imunohistochemie

Imunohistochemické barvení CD4, CD8 a IFN bylo provedeno v nádorových tkáních podle standardního protokolu. Po deparafinizaci a rehydrataci parafinového řezu řezů nádorových tkání byl do kruhu přidán 3% BSA, aby byla tkáň pokryta, a poté byl uzavřen na 30 minut při teplotě místnosti. Řezy byly obarveny protilátkami CD4, CD8 a IFN (Servicebio, Wuhan, Čína) přes noc při 4 °C a poté inkubovány se sekundární protilátkou (značená HRP, Servicebio, Wuhan, Čína) při teplotě místnosti po dobu 50 minut. po dvou promytích PBS. Nakonec byly řezy vizualizovány pod mikroskopem (Nikon, E100, Tokio, Japonsko) po reakci s chromogenním činidlem DAB.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

3.11. Posouzení biologické bezpečnosti CILP

Na konci studie inhibice nádoru byly všechny nádory shromážděny a byla změřena hmotnost těchto nádorů. Biochemické parametry, včetně alanintransaminázy (ALT), aspartáttransaminázy (AST), kreatininu (CREA) a močoviny (UREA), byly detekovány v krvi myší. Čerstvé nádorové tkáně a hlavní orgány byly fixovány 4% paraformaldehydem a zality v parafínu pomocí zalévacího stroje (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Čína). Tkáňové řezy o tloušťce 5 um byly nařezány přes mikrotom (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Čína) a poté obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E) podle protokolu. Následně byly barvené řezy pozorovány pod mikroskopem (Nikon, E100, Tokio, Japonsko).

3.12. Statistická analýza

Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. Hladina významnosti mezi skupinami byla testována jednosměrnou ANOVA pomocí Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 bylo definováno jako významný rozdíl.

3.13. Etika zvířat

Všechny postupy a doporučení týkající se zvířat byly schváleny Zvláštním výborem pro etiku vědeckého výzkumu Univerzity Liaocheng v souladu s národními směrnicemi pro péči a používání laboratorních zvířat (kód schválení: 2022111010; Datum schválení: 1. listopadu 2022).

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

4. závěr

Stručně řečeno, imichimodem zapouzdřené CD47-cílené lipozomy byly úspěšně vyvinuty a výsledky in vitro prokázaly, že CILP mají lepší trvalé uvolňování a specifický cílící účinek. Výsledky in vivo ukázaly, že přípravek může být účinně přijímán nádorovými buňkami a že vykazuje vynikající účinnost léčby nádorů a biologickou bezpečnost díky dvojí funkci imunitní odpovědi a vrozené blokádě kontrolních bodů imunitního systému. Proto se lipozomy zapouzdřené v imikvimodu spojené s Fc-CV1 zdají být slibnou novou nanomedicínou pro zlepšení léčby nádorů expresí CD47. Imunoterapie založená na vrozené imunitě může v budoucnu sloužit jako obecná strategie proti nádorovému růstu pro synergické kombinace s ICB.

Reference

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Global Cancer Statistics 2020: Globocan Odhady výskytu a úmrtnosti na celém světě pro 36 druhů rakoviny ve 185 zemích. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: Od Coleys k moderní imunoterapii rakoviny. Toxiny 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Imunoterapie a kombinované strategie pro imuno-onkologii. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS Top 10 problémů v imunoterapii rakoviny. Imunita 2020, 52, 17–35. [CrossRef]

5. Jain, KK Personalizovaná imuno-onkologie. Med. Princ. Praxe. 2021, 30, 1–16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Posun paradigmatu v imunoterapii rakoviny: Od vylepšení k normalizaci. Buňka 2018, 175, 313–326. [CrossRef]

7. Hussein, WM; Liu, TY; Skwarczynski, M.; Toth, I. Toll-Like Receptor Agonists: A Patent Review (2011–2013). Expert Opin. Ther. Pat. 2014, 24, 453–470. [CrossRef]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Protinádorová aktivita agonistů Toll-like Receptor 7. Přední. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Small-Molecule Modulators of Toll-like Receptors. Acc. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirák, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlach, J.; a kol. Podpora nádoru intratumorálními plazmocytoidními dendritickými buňkami je zvrácena léčbou ligandem Tlr7. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [CrossRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Agonisté Tlr7 Imiquimod a Gardiquimod zlepšují imunoterapii na bázi DC pro melanom u myší. Buňka. Mol. Immunol. 2010, 7, 381–388. [CrossRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Léčba po progresi v éře imunoterapie. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Immune Checkpoint Inhibitors: Recent Progress and Potential Biomarkers. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Inhibitory imunitního kontrolního bodu: Základy a výzvy. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway Mediates Cancer Immune Escape and Imunotherapy. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [CrossRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Příslib makrofágů řízených kontrolních bodů u myeloidních malignit. Nejlepší praxe a výzkum. Clin. Haematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Innate Immune Checkpoint Inhibitory: Další průlom v lékařské onkologii? Mol. Cancer Ther. 2021, 20, 961–974. [CrossRef]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Integrin-asociovaný protein je ligand pro molekulu neuronové adheze P84. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [CrossRef]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ lidský signálně-regulační protein je exprimován na normálních, ale ne na podskupinách leukemických myeloidních buněk a zprostředkovává buněčnou adhezi zahrnující jeho kontrareceptor Cd47. Krev 1999, 94, 3633–3643. [CrossRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK The Cd47-Sirpalpha Signaling Axis as Innate Immune Checkpoint in Cancer. Immunol. Rev. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Role Cd47 jako markeru sebe sama na červených krvinkách. Science 2000, 288, 2051–2054. [CrossRef]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. The Role of Cd47-Sirpalpha Immune Checkpoint in Tumor Immune Evasion and Innate Immunotherapy. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Role v imunitním systému a aplikace při léčbě rakoviny. Buňka. Oncol. 2020, 43, 19–30. [CrossRef]

24. Huang, Y.; Smět.; Gao, P.; Yao, Z. Targeting Cd47: The Achievements and Concerns of Current Studies on Cancer Immunotherapy. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [CrossRef]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Pokroky v protinádorové léčbě zaměřené na osu Cd47/Sirpalpha. Přední. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Blokáda Cd47 spouští destrukci imunogenních nádorů zprostředkovanou T buňkami. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Ring, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; a kol. Upravené varianty Sirpalpha jako imunoterapeutické adjuvans k protirakovinným protilátkám. Věda 2013, 341, 88–91. [CrossRef]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Topický Imiquimod má terapeutické a imunomodulační účinky proti intrakraniálním nádorům. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [CrossRef]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Přehled terapie imichimodem a diskuse o optimální léčbě bazocelulárních karcinomů. Clin. Drug Investig. 2018, 38, 883–899. [CrossRef]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Cílené podávání liposomálních léčiv: Nanověda a biofyzikální perspektiva. Nanoměřítko Horiz. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanopharmaceuticals a nanomedicína aktuálně na trhu: výzvy a příležitosti. Nanomedicína 2019, 14, 93–126. [CrossRef]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sun, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; a kol. Změna polohy azelnidipinu jako duálního inhibitoru cíleného na cesty Cd47/Sirpalpha a Tigit/Pvr pro imunoterapii rakoviny. Biomolecules 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Framework Co-Delivers Tlr-7 agonists and Anti-Cd47 Antibodies to Modulate Macrophages and Orchestrate Cancer Imunotherapy. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [CrossRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Fototermální terapie s imunoadjuvantními nanočásticemi spolu s kontrolní blokádou pro účinnou imunoterapii rakoviny. Nat. Commun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Long, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; He, Q. Multifunkční polymerní chemoimunoterapie na bázi micel s blokádou imunitního kontrolního bodu pro účinnou léčbu ortotopického a metastatického karcinomu prsu. Acta Pharm. Hřích. B 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. Huang, SW; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; a kol. Imichimod vykazuje protinádorové účinky indukcí imunogenní buněčné smrti a je zesílen glykolytickým inhibitorem 2-deoxyglukózou. J. Investig. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; On, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Metabolismus nanomateriálů in vivo: krevní oběh a clearance orgánů. Acc. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [CrossRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, zacílení na MR, biodistribuční a inhibiční růst nádoru charakterizace vazby anti-Her2 Affibody k liposomálnímu doxorubicinu s použitím tubo nádorů u myší Balb/C. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Příprava liposomů a charakterizace velikosti. Metody Enzymol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]