Produkce lipázy Yarrowia Lipolytica při fermentaci v pevné fázi za použití vedlejších produktů z ovoce Amazonky a sójové moučky jako substrátu Část 1

Abstraktní: Produkce polynenasycených mastných kyselin z rybího tuku, která souvisí s různými zdravotními přínosy včetně účinků proti kardiovaskulárním onemocněním, antihypertenzních, protirakovinných, antioxidačních, antidepresivních, anti-aging a anti-artritických účinků, mimo jiné, lze výhodně provádět prostřednictvím aplikace lipázy. Vysoké náklady spojené s produkcí enzymu však mohou učinit proces neproveditelným, a proto by měly být pro vyřešení těchto problémů prozkoumány alternativní substráty. Cílem tohoto výzkumu bylo vyrobit lipázu Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 v pevné fázi fermentace za použití vedlejších produktů potravinářského průmyslu (andiroba olejový koláč a sójový šrot) a ověřit potenciální použití při počáteční hydrolýze rybího oleje dále vyrábět polynenasycené mastné kyseliny vhodným způsobem. Byl proveden screening pro analýzu kombinací andiroba olejového koláče a sójového šrotu v různých poměrech (0:1{{20}}0 až 100:0, v tomto pořadí) po 48 hodinách fermentační proces. Poté byla pevná matrice složená ze sójové mouky a koláče z andiroba oleje doplněna sójovým olejem a Tween 80 pro zlepšení lipázové aktivity. Enzymatický extrakt byl charakterizován proteinovým profilem elektroforézou. Nakonec byly enzymatický extrakt a vyrobený pevný biokatalyzátor použity k vyhodnocení potenciální hydrolýzy rybího oleje v počáteční studii. Maximální lipolytická aktivita (63,7 U·g −1 ) byla dosažena použitím andiroba olejového koláče a sójového šrotu (50:50) po 24 h fermentace. Sojový olej 1,5 procenta a Tween 80 (0,001 procenta) v emulzi poskytly 1,{23}}násobné zvýšení (82,52 U·g -1 ) enzymové aktivity. Elektroforetická analýza prokázala pás mezi 37 a 40 kDa, který může souviset s lipázou, a pás 75 kDa odkazující na podjednotku -konglycininu přítomného v sójovém šrotu. Po 48 hodinách vykázal pevný biokatalyzátor vyšší stupeň hydrolýzy (DH) (71,0 procenta) než enzymatický extrakt (61,5 procenta). Pevný biokatalyzátor byl stabilní během skladování při teplotě místnosti po dobu 7 měsíců. Výroba lipáz za použití vedlejšího produktu z amazonského ovoce a sójového šrotu při fermentaci v pevné fázi je životaschopná, stejně jako aplikace extraktu a pevného biokatalyzátoru v počáteční aplikaci pro hydrolýzu rybího oleje k další výrobě polynenasycených mastných kyselin v průmyslovém vhodný proces.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na doplněk Cistanche Tubulosa

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: Carapa guianensis Aublet; produkce lipázy; fermentace v pevném stavu; udržitelnost; Yarrowia lipolytica

1. Úvod

Amazonské ovoce má vysoký biotechnologický potenciál pro výzkum a aplikaci v různých sektorech ekonomiky, jako je farmaceutický a potravinářský průmysl, díky přítomnosti makro a mikroživin, včetně bílkovin, sacharidů, vlákniny, karotenoidů, polynenasycených mastných kyselin a vitamínů, mimo jiné. [1].

Andiroba (Carapa guianensis Aublet) je amazonská rostlina, která produkuje plody olejnatých semen s komerčním potenciálem pro extrakci oleje s léčivými vlastnostmi jako analgetický, antiedematogenní a protizánětlivý účinek [2,3]. Kromě toho představuje zajímavé technologické vlastnosti pro kosmetický průmysl, protože je bohatý na změkčující sloučeniny, které jsou dodávány jako vstup pro kosmetický průmysl po celém světě [4]. Plod andiroby je tobolka, která váží mezi 90 a 540 g a skládá se z 1 až 16 hnědých semen o hmotnosti mezi 1 a 70 g. Pro získání oleje se semena rozdrtí na malé kousky a suší se v pecích, dokud nedosáhnou 8% vlhkosti. Poté jsou lisovány v kovových lisech typu expeler [5], čímž vzniká olej andiroba, který představuje velký průmyslový zájem a vysokou komerční hodnotu, protože tento produkt může v závislosti na jeho vlastnostech přesáhnout 50 dolarů za litr [6].

Roční produkce andiroby je asi 122,16 tun [7] a produkce oleje nepřesáhla 30 procent hmotnosti plodů [8]. Tato čísla znamenají, že se ročně vyrobí přibližně 36 648 tun ropy a 85 512 tun koláčů. Vedlejší produkt získaný po průzkumu těchto plodů může stále obsahovat lipidy (20 procent), popel (4,2 procenta), bílkoviny (7,3 procenta) a sacharidy (17 procent) a díky tomuto složení je jeho použití v biotechnologických procesech je zajímavé [9]. Jedním ze způsobů, jak použít tyto vedlejší produkty, je fermentace v pevném stavu (SSF) k výrobě sloučenin s vysokou přidanou hodnotou, jako jsou enzymy.

Fermentace v pevné fázi se provádí pomocí pevné matrice v nepřítomnosti volné vody, ale pevná látka musí mít dostatek vlhkosti pro mikrobiální růst [10]. Bylo popsáno použití SSF k výrobě aromatických sloučenin [11], antibiotik [12], organických kyselin [13], biopesticidů [14], biosurfaktantů [15], enzymů [16] a dalších sloučenin. Produkce enzymů v SSF vyžaduje použití mikroorganismů, jako jsou houby a bakterie, které rostou za podmínek běžně používaných v SSF. Mezi biotechnologicky využívanými mikroorganismy vynikají kvasinky, zejména Yarrowia lipolytica, díky svému potenciálu produkovat lipázy [10].

Yarrowia lipolytica je nekonvenční kvasinka, která má maximální růstovou teplotu 32–34 ◦C a není schopna přežít v anaerobních podmínkách. Y. lipolytica je klasifikován jako obecně uznávaný jako bezpečný (GRAS) Food and Drug Administration (FDA), což umožňuje jeho bezpečné použití v potravinářských a farmaceutických procesech/produktech [9]. Je známo, že tato kvasinka produkuje intracelulární, extracelulární lipázy a lipázy spojené s buněčnou stěnou. Yarrowia lipolytica může produkovat lipázy za použití různých zdrojů uhlíku, včetně olejů, methylesterů a mastných kyselin [17]. Uvedené vlastnosti činí Y. lipolytic všestranným pro biotechnologické aplikace, zejména při výrobě lipáz.

Lipázy (triacylglycerolacylhydrolázy EC 3.1.1.3) jsou enzymy, které za přítomnosti vody katalyzují hydrolýzu triglyceridů na volné mastné kyseliny a glycerol [18]. Lipázy mohou být aplikovány v mnoha odvětvích včetně potravinářského průmyslu, mezi jinými. Použití lipáz bylo popsáno při hydrolýze mléka, tuku a zrání sýrů, při úpravě máslových tuků, při zlepšování vůně nápojů a pečiva, při úpravě potravin a při vývoji chuti masa a ryb. [19]. Kromě toho již byly lipázy aplikovány na hydrolýzu oleje na koncentraci polynenasycených mastných kyselin, které lze použít v potravinářském průmyslu jako obohacený doplněk [20].

Několik studií uvádí použití odpadu a vedlejších produktů při výrobě lipázy, mezi nimi slupky sóji, slupky melounu, moučku z bavlníkových semen, mouku ze sójových bobů a pokrutiny z andiroby [9,21–26]. Nicméně kombinace andiroba olejového koláče a sójového šrotu v různých poměrech pro produkci lipázy Yarrowia lipolytica dosud nebyla popsána. Cílem tohoto výzkumu bylo vyrobit lipázu Yarrowia lipolytica fermentací v pevné fázi (SSF) za použití vedlejších produktů potravinářského průmyslu (andiroba olejový koláč a sójový šrot) k použití při hydrolýze rybího oleje k další výrobě polynenasycených mastných kyselin.

2. Výsledky a diskuse

Strategie přijatá k produkci lipázy Yarrowia lipolytica v SSF za použití kombinace andiroba olejového koláče a sójového šrotu v různých poměrech byla založena na vývojovém diagramu znázorněném na obrázku 1.

2.1. Charakterizace agroprůmyslového vedlejšího produktu

Fyzikálně-chemické složení andiroba olejového koláče je uvedeno v tabulce 1. Andiroba olejový koláč obsahoval 13,7 procent bílkovin, 26,9 procent éterového extraktu, 0,4 procent sacharidů a 45,6 procent nerozpustné vlákniny. Na druhou stranu sójová mouka obsahovala 48,3 procenta bílkovin, 2,4 procenta éterového extraktu, 14,{15}} procent sacharidů a 18,5 procent nerozpustné vlákniny. Každá živina přítomná v koláči má roli v mikrobiálním metabolismu. Obsah dusíku je nezbytný pro syntézu proteinů, nukleotidů a sekundárních metabolitů pro růst a metabolismus mikroorganismů a také pro biosyntézu enzymů [25]. Zbytkový obsah oleje (éterový extrakt) přítomný v olejovém koláči andiroby působí jako zdroj uhlíku, podílí se na tvorbě biomasy a produkci energie pro výkon buněčné funkce [26]. Kromě toho je olej přítomný v koláči andiroby hydrofobním substrátem a může působit jako induktor při produkci lipázy, jak uvádí Brígida et al. [17]. Zpočátku lipáza navázaná na buňku mikroorganismu hydrolyzuje lipid přítomný v médiu a iniciuje buněčný růst. V průběhu procesu klesá dostupnost substrátu, takže organismus vylučuje extracelulární lipázy [27].

Popel kvantifikovaný v olejovém koláči z andiroby (4,5 procenta) a sójovém šrotu (6,3 procenta) představuje obsah několika minerálů a může být použit v metabolismu mikroorganismu; některé minerály, jako jsou ionty sodíku a manganu, však mohou inhibovat růst Yarrowia lipolytica [17], a proto je nutné vedlejší produkty řádně vyhodnotit.

Obsah sacharidů a vlákniny v surovinách lze v mikrobiální výživě využít v omezené míře, protože Yarrowia lipolytica neprodukuje amylázy ani celulázy a hemicelulázy [28,29], což ztěžuje rozklad těchto polysacharidů a uvolňování sloučenin bohatých na uhlík. použít v metabolismu kvasinek. Předpokládá se tedy, že růst kvasinek je způsoben hlavně přítomností hydrofobních substrátů v koláči.

Hodnoty pórovitosti koláče z andiroby a sójového šrotu jsou uvedeny v tabulce 1. Podle tabulky 1 byla pórovitost koláče z andiroby a sójového šrotu 0,425 a 0,412 m3 vzduchu m−3 lůžko, resp. Vyšší hodnoty pórovitosti jsou spojeny se zlepšeným přenosem hmoty a tepla během fermentace, což vede ke zlepšení produkce enzymů. Kromě toho je pórovitost důležitým parametrem pro pochopení vlhkosti média: vysoké hodnoty vlhkosti mohou být spojeny s nízkými hodnotami pórovitosti, což ovlivňuje provzdušňování média a následně produkci lipázy [22].

2.2. Výroba lipázy od SSF

Použití vedlejších produktů pro výrobu lipázy fermentací v pevné fázi a výroba stabilních pevných biokatalyzátorů umožňuje aplikaci enzymu přímo do reakčního média, čímž se snižují náklady spojené s extrakcí enzymu a čištěním pro následnou aplikaci. Kromě toho použití vedlejších produktů poskytuje živiny pro mikrobiální růst a vývoj, působí jako fyzická podpora pro mikroorganismus a snižuje náklady na kultivační médium procesu. Fermentace v pevném stavu navíc umožňuje využití zbytků a vedlejších zemědělsko-průmyslových produktů, což je alternativa ke snížení ekologických problémů spojených s nevhodnou likvidací odpadu [30].

Po charakterizaci byly vedlejší produkty použity jako pevný matricový substrát při výrobě lipázy pomocí SSF, přičemž byly sledovány lipolytické a proteolytické aktivity, vlhkost a pH během fermentačního procesu. Obrázek 2 ukazuje naměřené profily proměnných odezvy během 48 hodin fermentace za použití Y. lipolytica a kombinace koláče z andiroba oleje a sójového šrotu v různých poměrech jako substráty.

Pokud jde o použití jednotlivých substrátů, maximální lipolytická aktivita 4,36 U·g −1 byla zjištěna pro sójový šrot (0:100; obrázek 2A) a 13,48 U·g −1 pro andiroba olejový koláč (100:0; obrázek 2B), po 12 a 24 hodinách, v daném pořadí. Po dosažení bodu největší aktivity lipázy bylo pozorováno snížení jejích hodnot, které může souviset se zvýšením aktivity proteázy. Tento enzym má afinitu k proteinovým strukturám a díky tomu může působit tak, že degraduje strukturu lipázy a snižuje její aktivitu [24,31,32].

Koláč Andiroba a sójová moučka použité v různých poměrech (25:75), (50:50) a (75:25) produkovaly maximální hodnoty aktivity lipázy 57,21 U·g -1 po 12 hodinách (obrázek 2C), 63,70 U·g -1 (obrázek 2D) a 40,13 U·g -1 (obrázek 2E) po 24 hodinách fermentace, v daném pořadí, což ukazuje, že směs matric může zlepšit aktivitu lipázy. Zlepšení enzymatické aktivity po kombinaci andiroba olejového koláče a sójového šrotu lze vysvětlit pozorováním fyzikálně-chemického složení obou surovin, jak ukazuje tabulka 1. Sójový šrot má vysoký obsah bílkovin, zatímco andiroba olejový koláč má vyšší obsah oleje . Směs andiroba olejového koláče a sójového šrotu pro výrobu lipázy se tedy ukázala jako zajímavější než použití každé zvlášť, a to podporuje nezávislost jediného substrátu a také použití více než jednoho vedlejšího produktu.

Počáteční pH matric je kyselé v důsledku přítomnosti volných mastných kyselin přítomných v olejnaté matrici a tento stav podporuje růst Yarrowia lipolytica, protože tato kvasinka potřebuje pro dobrý růst mírně kyselé médium [33], aniž by se musel stát pufrem. V průběhu procesu také dochází k postupnému zvyšování pH v matricích v rozmezí od 6,39 do 7,32 (obrázek 2A), 5,69 až 6,82 (obrázek 2C), 5,64 až 7,68 (obrázek 2D) a 5,21 až 6,03 (obrázek 2E). V matrici obsahující pouze andiroba olejový koláč byl pozorován postupný pokles pH (4,8 až 4,26, obrázek 2B) v důsledku zbytkového obsahu oleje v pevném médiu, protože olej je zpočátku hydrolyzován lipázou a není spotřebován kvasinkami v počáteční hodiny, čímž se udržuje mírně kyselé pH.

Pokud jde o obsah vlhkosti, nebyly během fermentace pozorovány žádné změny, což dokazuje, že inkubační systém s nasycenou vlhkostí a matricemi byl účinný při zadržování vlhkosti. Fermentační médium schopné udržet optimální obsah vlhkosti je nezbytné pro produkci lipázy Yarrowia lipolytica [24], protože tento parametr může ovlivnit provzdušňování systému. Kromě toho je vyžadován ideální obsah vlhkosti pro zajištění vody nezbytné pro metabolismus mikroorganismu a pro solubilizaci živin. Když je obsah vlhkosti nad ideální, může v systému nastat špatná difúze kyslíku, která je mimo ideální rozmezí pro mikroorganismus [34].

Některé studie uvádějí použití vedlejších produktů jako substrátů při fermentaci v pevné fázi. V těchto studiích však dochází k začlenění čistých zdrojů uhlíku a/nebo dusíku, jako je glukóza, kvasnicový extrakt, pepton a močovina [35–37] v množstvích, která mohou zvýšit náklady procesu. Ideální matrice musí vykazovat určité vlastnosti pro aplikaci, která zahrnuje působení jako podpora, poskytování nezbytných živin pro růst mikroorganismů a sekreci požadovaného biotechnologického produktu. Najít všechny tyto vlastnosti ve vedlejším produktu může být náročné, což ztěžuje nalezení adekvátního systému pro fermentační proces; tedy hledání nových surovin a jejich kombinace musí být nepřetržité [16].

Pro další testy byl tedy zvolen poměr 50:50 mezi andiroba koláčem a sójovým šrotem. Volba této podmínky je spojena se zhodnocením neprozkoumaného odpadu z oblasti Amazonie.

2.3. Suplementace fermentační matrice

Ve druhé části této práce byly dort s olejem andiroba a sójový šrot v poměru 50:50 doplněny 1,5 procenta sójového oleje, jak je znázorněno na obrázku 3. Suplementace byla provedena za účelem ověření dostupnosti snáze asimilovaného zdroje uhlíku (sojový olej) zlepšila produkci lipázy o zbytkový obsah oleje přítomného v koláči andiroba oleje. Maximální aktivita lipázy 56,32 U·g −1 byla získána po 28 hodinách fermentace a aktivita proteázy se pohybovala od 2,71 do 7,60 U·g −1. Hodnota pH se pohybovala od 5,63 do 7,63 a vlhkost zůstala po celé období bez větších výkyvů (53 až 58 procent ). Jak bylo uvedeno dříve, lipolytická aktivita získaná po suplementaci byla nižší než hodnota zjištěná bez suplementace. Suplementace matrice pro produkci lipázy byla studována Fariasem et al. [38] a Souza a kol. [24]. Autoři zjistili lipázovou aktivitu 139 U·g −1 a 93,9 U·g −1 při použití kalu a sójového oleje. Když však Souza a spol. [24] provedli fermentaci pouze za použití sójového šrotu (bez suplementace), autoři zjistili 9,4 ± 0,3 U·g −1 lipázové aktivity po 10 hodinách fermentace, což dokazuje, že suplementace zvýšila lipázovou aktivitu ve studované fermentační matrici.

Další složkou běžně uváděnou pro suplementaci média je Tween 80. To je neustále uváděno v literatuře, protože tato složka může zvyšovat aktivitu lipázy při použití v submerzní fermentaci [39], ale neexistují žádné zprávy o použití Tween 80 při fermentaci v pevné fázi. Tween 80 může zvýšit produkci extracelulární lipázy během fermentačního procesu díky emulgační kapacitě substrátu, a proto zlepšit dostupnost substrátu pro mikroorganismus a také změnit buněčnou permeabilitu [40]. Byla tedy provedena studie s kombinací sójového oleje 1,5 (procento w/v) a Tween 80 0,001 procent (w/v) v emulzi k doplnění fermentačního pevného média, jak je znázorněno na obrázku 4.

Pokud jde o suplementaci Tweenem 80, bylo ověřeno, že po 14 hodinách fermentace byla lipolytická aktivita 57,6 U·g −1. Stejná hodnota byla dříve získána pouze s doplňkem sójového oleje po 28 hodinách fermentace, což prodlužuje proces fermentace a ovlivňuje životaschopnost. Maximální lipolytická aktivita po 20 hodinách fermentace byla 82,52 U·g −1, což je 1,{11}}násobný nárůst oproti produkci lipázy za použití samotného sójového oleje a 8-h zkrácení doby procesu.

Dlouhé doby fermentace zvyšují cenu procesu, takže hledání ideálního binomického mikroorganismu – média, které produkuje lipázu v kratším čase (vysoká produktivita) a které využívá vedlejší produkty jako matrice, je zajímavé. Několik studií v literatuře uvádí produkci lipázy prostřednictvím SSF za účelem dosažení adekvátních podmínek a umožnění získání lipáz. Bylo pozorováno použití různých surovin, včetně sójové moučky, řepky, slupek vodního melounu a pokrutin z palmojádrového oleje, s aktivitami v rozmezí 9 až 127 U·g −1[9,22,24].

Sales, Castro, Ribeiro a Coelho [22] studovali produkci lipázy Y. lipolytica při fermentaci v pevné fázi pomocí sójové moučky doplněné slupkou vodního melounu (5 procent) a dosáhli zlepšení aktivity lipázy o 31 procent, což je hodnota odpovídající 75,22 U ·g −1. Souza a kol. [41] vyrobili lipázu z Y. lipolytica fermentací v pevné fázi pro použití při syntéze komerčních esterů s hodnotou pro potravinářský průmysl a výsledky ukázaly, že nejlepší fermentační podmínky pro výrobu biokatalyzátoru byly použití sójového šrotu a sójového oleje ( 3 procenta t/t). Enzym vyrobený za těchto podmínek umožnil konverzi až 92,9 za účelem syntézy užitečných esterů s vysokou přidanou hodnotou používaných v potravinářském průmyslu.

Kromě vysokých enzymatických aktivit získaných v této práci můžeme zdůraznit další výhody: (i) možnost použití vedlejších produktů s nízkou exploatací, s přitažlivostí pro udržitelnost pro oblast Amazonie; ii) možnost kombinace různých vedlejších produktů, která umožňuje nutriční doplňování pro mikrobiální metabolismus; iii) snížení tlaku na složky již široce používané v bioprocesním průmyslu, jako je sójová moučka; iv) ekonomické zhodnocení regionů produkujících vedlejší produkty; (v) rozšíření možností substrátu pro výrobu lipáz a (vi) snížení provozních nákladů, mimo jiné výhody.

2.4. SDS-PAGE

Surový enzymatický extrakt získaný po fermentaci za použití matrice složené z andiroba olejového koláče a sójového šrotu (50:50) bez suplementace byl analyzován na SDS-PAGE. Elektroforetická analýza ukázala proteinové pásy obsažené v enzymatickém extraktu, jak je znázorněno na obrázku 5.

Dráha 1 odkazuje na standardní proteinové markery a dráha 2 je vzorek získaný z kombinace andiroba olejového koláče a sójového šrotu v lepším studovaném poměru (50:50). V surovém enzymatickém extraktu je možné zobrazit pás o velikosti 37–40 kDa, který může souviset s lipázou a/nebo esterázou produkovanou Yarrowia lipolytica, jak pozorovali Souza et al. [41], což může být také hlavní extracelulární lipáza Y. lipolytica (Lip2), která byla široce produkována ve všech našich studiích. Dále se uvádí, že i u enzymů, které jsou spojeny hlavně s buněčnou stěnou (Lip7 a Lip8) Y. lipolytica, byla pozorována stejná molekulová hmotnost (37–41 kDa) [42].

Navíc, podle výsledků dříve publikovaných naší výzkumnou skupinou, stejné zde prezentované pásy souvisely s esterázovou a lipázovou aktivitou ze zymogramu odhaleného -naftylacetátem jako substrátem [41], což nám umožnilo je korelovat. Pásy 75 kDa označují podjednotku -konglycininu přítomnou v sójovém šrotu, jak zjistili Sales et al. [22] a Cheng a kol. [43] při fermentaci sójového šrotu.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】