LIMIT je imunogenní LncRNA v rakovinové imunitě a imunoterapii

Abstraktní

MHC-I představuje nádorové antigeny CD8+ T buňkám a spouští protinádorovou imunitu. Lidé mohou mít 30,000-60,000 dlouhých nekódujících RNA (lncRNA). Zůstává však špatně pochopeno, zda lncRNA mohou ovlivnit nádorovou imunitu. Zde identifikujeme LncRNA, schopnou indukovat MHC-I a imunogenicitu nádoru (LIMIT) u lidí a myší. Zjistili jsme, že IFN stimulovaný LIMIT, LIMIT cis-aktivovaný guanylát vázající protein (GBP) genový shluk a GBP narušily asociaci mezi HSP90 a faktorem tepelného šoku-1 (HSF1) – což vedlo k aktivaci HSF1 a transkripci MHC-I stroje, ale ne PD-L1. RNA-řízená aktivace CRISPR LIMIT posílila GBP a MHC-I a potencovala imunogenicitu nádoru a terapii kontrolních bodů.

Umlčení LIMIT, GBP a/nebo HSF1 snížilo MHC-I, zhoršilo protinádorovou imunitu a oslabilo účinnost imunoterapie. Klinicky LIMIT, GBPs- a HSF1-signalizační transkripty a proteiny korelovaly s MHC-I, tumor-infiltrujícími T buňkami a odpovědí na blokádu kontrolních bodů u pacientů s rakovinou. Celkově prokazujeme, že LIMIT je dříve neznámá rakovinová imunogenní lncRNA a osa LIMIT-GBP-HSF1 může být cílitelná pro imunoterapii rakoviny.

Klíčová slova 

dlouhá nekódující RNA; OMEZIT; MHC-I; IFN; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; imunita T buněk; imunoterapie rakoviny

Úvod

Blokáda kontrolního bodu uvolňuje CD8+ T lymfocyty zprostředkovanou imunitní sílu proti rakovině1. Hlavní histokompatibilní komplex-I (MHC-I) hraje klíčovou roli v aktivaci a aktivaci CD8+ T buněk2. MHC-I je však v rakovinných buňkách často downregulován, což vede k imunitnímu úniku nádoru a odolnosti vůči imunoterapii3,4. Je důležité pochopit, jak obnovit nádorovou expresi MHC-I a revitalizovat protinádorovou imunitní odpověď5. LncRNA se rychle objevují spolu s pokrokem v hlubokém sekvenování RNA a pokrývají mnohem více lokusů v lidském genomu než geny kódující protein6. LncRNA regulují geny kódující proteiny na několika úrovních7-9 a hrají klíčovou roli v genomovém imprintingu10, buněčné diferenciaci11 a progresi rakoviny12. Identita, způsob účinku, funkce a klinický význam specifických lncRNA v imunitě proti rakovině a imunoterapii však zůstávají neznámé. Zde identifikujeme LIMIT jako dříve neznámou rakovinovou imunogenní lncRNA. LIMIT ovlivňuje mechanismy MHC-I a protinádorovou imunitu. Zjistili jsme, že LIMIT lokálně cílí na GBP, čímž vytváří molekulární kaskádu LIMIT-GBP-HSF1-MHC ke změně protinádorové imunity a účinnosti nádorové imunoterapie. Naše práce nejen odhaluje dříve neznámou biologii imunogenní lncRNA, LIMIT, ale také naznačuje, že osa LIMIT-GBP-HSF1 může být cílitelná pro imunoterapii rakoviny.

LIMIT je imunogenní lncRNA

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Abychom prozkoumali neznámé regulační geny v nádorové imunitě na základě infiltrace nádorových CD8+ T buněk, rozdělili jsme lidský melanom (TCGA, SKCM) na horké a studené typy nádorů a analyzovali jsme imunogenní genové korelace. Kromě transkriptů CD8A, IFN a MHC-I (HLA-ABC) jsme zjistili, že kandidát lncRNA byl obohacen v horkém nádoru mezi 3926 kandidáty lncRNA anotovanými GENCODE13 (obr. 1a; doplňková tabulka 1). Na základě funkčních studií v následujících experimentech jsme označili tohoto kandidáta lncRNA jako LIMIT: lncRNA indukující MHC-I a imunogenicitu nádoru (LIMIT). V souboru dat o lidském melanomu hladiny LIMIT pozitivně korelovaly s hladinami IFN, MHC-I a CD8 (obr. lb-d). V souladu s tím analýza obohacování genové sady (GSEA) odhalila, že exprese LIMIT koreluje s geny odezvy IFN, prezentací antigenu prostřednictvím MHC-I a imunitní aktivací (obr. 1e-h). Kromě toho hladiny LIMIT korelovaly se zvýšenou mírou odezvy kontrolního bodu na imunoterapii 14-17 (obr. 1i) a byly spojeny s přežitím u pacientů s melanomem (obr. 1j). Navíc exprese LIMIT korelovala s IFN, MHC-I a CD8 napříč různými typy rakoviny (rozšířená data obr. la-1). LIMIT je tedy potenciální imunogenní lncRNA.

Ověřili jsme, zda je LIMIT lncRNA. Northern blotting ukázal, že LIMIT byl přibližně 2 kb dlouhý v lidských melanomových buňkách A375 (obr. 1k). Aplikovali jsme rychlou amplifikaci cDNA konců (RACE) a charakterizovali cDNA konce LIMIT v lidských (A375) i myších (B16) melanomových buňkách (obr. 11, m). Dále jsme klonovali celou délku LIMIT u lidí i myší a porovnali jsme ji s odpovídajícími sekvencemi genomu (rozšířená data obr. 2a, b). Lidský LIMIT byl lokalizován na chromozomu 1 s 1967 nukleotidy a 6 exony (rozšířená data obr. 2a), zatímco myší limit byl lokalizován na chromozomu 3 s 1634 nukleotidy a 7 exony (rozšířená data obr. 2b). LIMIT neobsahoval platnou Kozakovu sekvenci. Když jsme připravili RNA z jaderných a cytoplazmatických frakcí buněk A375, LIMIT byl detekován především v jaderné frakci (obr. 1n). LIMIT tedy nemá žádný potenciál pro kódování proteinů. Souhrnně LIMIT splňuje všechna kritéria, aby mohl být definován jako lncRNA. Zejména v lokusu LIMIT, kandidátovi na lncRNA, byl nalezen pseudogen GBP1 (GBP1P1) v hepatocelulárním karcinomu (HCC)18. LIMIT však vykazoval nízkou podobnost s GBP1P1 nebo GBP1 (rozšířená data obr. 2c, doplňková tabulka 2). LIMIT tedy není GBP1P1. Vysoká korelace mezi LIMIT a genovou signaturou reagující na IFN (obr. 1e) naznačuje, že IFN může stimulovat expresi LIMIT. Ošetření IFN skutečně vyvolalo expresi LIMIT, jak ukazuje Northern blot (obr. 1k) a RNA-seq v buňkách A375, HT29, Meijuso a A549 (obr. 1o). Léčba jinými cytokiny, jako je IFN a TNF, však nedokázala indukovat expresi LIMIT (obr. lk). Navíc IFN nedokázal vyvolat LIMIT v buňkách STAT1 knockout (KO) A375 (obr. 1p). LIMIT je tedy dříve neznámá lncRNA reagující na IFN v lidských i myších buňkách.

LIMIT rozšiřuje expresi MHC-I

Výhody doplňku cistanche-jak posílit imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pro studium funkce LIMIT v nádorových buňkách jsme nejprve srazili LIMIT pomocí malých vlásenkových RNA (shLIMIT). Použili jsme nástroj Blast k výběru LIMIT shRNA, které nemají žádné mimocílové kandidáty (doplňkové tabulky 3-6). ShLIMIT se nezaměřoval na geny kódující GBP (rozšířená data obr. 3a). V buňkách A375 shLIMIT suprimoval expresi LIMIT (obr. 2a), ale neovlivnil fosforylaci STAT1 (obr. 2b) v reakci na IFN - což naznačuje, že LIMIT neovlivnil globální genovou signalizaci IFN. MHC-I a PD-L1 jsou cílové geny IFN19-21. ShLIMIT vedl ke snížení exprese MHC-I (obr. 2c), ale ne PD-L1 (rozšířená data, obr. 3b), v reakci na stimulaci IFN. V souladu s těmito lidskými údaji limit umlčení v buňce myšího melanomu YUMM1.7 nebo v buňce rakoviny tlustého střeva CT26 vedl ke snížené expresi MHC-I v reakci na IFN (obr. 2d-g). V buňkách A375 ovlivnil shLIMIT nejen expresi MHC-I (HLA-ABC, HLA-E a HLA-F), ale také expresi MHC-II (HLA-DRA a HLA-DMA); zatímco LIMIT nezměnil expresi jiného IFN signalizačního genu (rozšířená data obr. 3c). LIMIT se tedy podílí na regulaci IFN-indukované exprese MHC-I a MHC-II bez změny globální signální dráhy IFN.

LIMIT je přerušený gen s velkými introny, který v genomu zabírá přibližně 17 kb. Nepodařilo se nám vyřadit lokus LIMIT spárovanými sgRNA a Cas9. Vzhledem k tomu, že existuje 5 předpokládaných vazebných míst STAT1/IRF1 v promotoru LIMIT, navrhli jsme 4 spárované sgRNA k odstranění těchto vazebných míst v promotoru LIMIT (rozšířená data obr. 3d). Vytvořili jsme buňky A375 s delecí promotoru LIMIT ve všech 4 kombinacích sgRNA. Zjistili jsme, že IFN již není účinný pro indukci exprese LIMIT a MHC-I v nádorových buňkách s delecí promotoru LIMIT ve srovnání s buňkami divokého typu (obr. 2h, i). Dále jsme použili RNA-řízený aktivační systém CRISPR k aktivaci exprese Limit v nádorových buňkách22. Vytvořili jsme 4 vodící RNA zacílené na promotorovou oblast Limit (sgLimit) a koexprimované s dCas9-VPR, tripartitním transkripčním aktivátorem fúzovaným s Cas9 s nulovou nukleázou, do buněk B16 (rozšířená data obr. 4a). Všechny 4 sgLimit zvýšily expresi Limit, stejně jako MHC-I (rozšířená data, obr. 4b, c). Když jsme transfekovali buňky B16 seskupeným sgLimit a necílovými sgRNA (sgNT), sgLimit indukoval expresi Limit a MHC-I, ale ne PD-L1 (obr. 2j, k). Limit tedy selektivně cílí na MHC-I, ale ne na PD-L1. Celkově experimenty se ztrátou a ziskem funkce ukazují, že LIMIT může změnit 15-3násobně expresi MHC-I ve více rakovinných buňkách u myší a lidí. Dále jsme zkoumali, zda LIMIT-změněná exprese MHC-I ovlivňuje TAA-specifické zabíjení CD8+ T buněk zprostředkované in vitro. Za tímto účelem jsme nejprve geneticky srazili B2M pomocí specifických shRNA v buňkách B16 exprimujících ovalbumin (OVA)--. shRNA-B2M vedla k 1,{51}}násobnému snížení exprese OVA-H2Kb (rozšířená data obr. 4d). Když byly B16-OVA buňky nesoucí shFluc a shB2M inkubovány s OT-I buňkami, pozorovali jsme pokles OT-I zprostředkovaného zabíjení shB2M-B16-OVA buněk ve srovnání s shFluc-B{{63 }}OVA buňky (rozšířená data obr. 4e-g). Data naznačují, že 1,{67}}násobné změny v expresi MHC-I řízené pomocí LIMIT by mohly být funkčně relevantní při ovlivnění TAA-specifických CTL aktivit. Abychom to potvrdili, aktivovali jsme LIMIT v buňkách B16-OVA exprimujících šelak a shB2M. Jak se očekávalo, aktivace LIMIT CRISPR indukovala minimální expresi MHC-I v buňkách shB2M ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 21). V souladu s tím buňky OT-I zprostředkovaly minimální zabíjení nádorů v buňkách shB2M-OVA-B16 ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 2m, n). Data naznačují, že exprese MHC-I indukovaná LIMIT je důležitá při aktivaci a funkci T-buněk specifických pro TAA. Antigen prezentující buňky (APC), včetně makrofágů a dendritických buněk (DC), exprimují MHC-I, prezentují antigeny a aktivují TAA-specifické T buňky. Rozšířili jsme naše studie z nádorových buněk na APC. IFN silně stimuloval limitní expresi v DC a makrofázích derivovaných z kostní dřeně (rozšířená data, obr. 4h, i). Transfekovali jsme makrofágy s 5'FAM-značenou siRNA targeting Limit (siLIMIT). Snížení LIMIT vedlo k nižší expresi MHC-I v reakci na stimulaci IFN ve srovnání s kontrolou (rozšířená data obr. 4j, k). LIMIT je tedy lncRNA reagující na IFN a může podporovat expresi MHC-I jak v nádorových buňkách, tak v APC.

LIMIT zvyšuje protinádorovou imunitu

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

Nedostatečná exprese MHC-I uděluje nádoru imunitní únik a odolnost vůči imunoterapii3. Abychom porozuměli roli Limit v protinádorových imunitních odpovědích in vivo, naočkovali jsme kontrolní (shFluc) a limitně umlčující (shLimit) nádorové buňky YUMM1.7 do NOD scid c-deficientních (NSG, imunitní deficientní) a divokého typu C57BL/6 (imunitně kompetentní) myši. Ve srovnání s kontrolními nádory rostly nádory shLimit YUMM1.7 srovnatelně u myší NSG (obr. 3a), zatímco u myší divokého typu postupovaly rychleji (obr. 3b). Kromě toho jsme naočkovali nádory shLimit CT26 myším BALB/c divokého typu. Limit umlčení opět vedl ke zvýšenému růstu nádoru CT26 v imunokompetentním modelu (obr. 3c). Údaje naznačují, že limit umlčení může narušit protinádorovou imunitu a usnadnit růst nádoru způsobem závislým na imunitě. Na podporu tohoto jsme detekovali snížení CD3+, IFN+ a TNF+ T buněk v shLimit YUMM1.7 nádorech (obr. 3d, e). Společně umlčování Limit narušuje protinádorovou imunitu. Pro stanovení exprese MHC-I a MHC-I: SIINFEKL in vivo jsme založili buňky YUMM1.7 stabilně exprimující OVA (YUMM1.7-OVA) a transdukované pomocí shRNA targeting Limit nebo Fluc. Po ošetření IFN jsme detekovali sníženou povrchovou expresi OVA-H2Kb v buňkách shLimit-YUMM1.7 (rozšířená data obr. 5a). Myším C57BL/6 jsme naočkovali shLimit YUMM1.{41}}OVA buňky a shFluc-YUMM1.{44}}OVA buňky. Poté jsme pitvali nádorové tkáně a detekovali expresi H2Db a OVA-H2Kb v nádorových buňkách. Pozorovali jsme snížení H2Db a OVA-H2Kb v buňkách shLimit-YUMM1.{55}}OVA ve srovnání s kontrolními buňkami (rozšířená data, obr. 5b-f). Data naznačují, že Limit může ovlivnit expresi MHC-I a MHC-I: antigenu in vivo. Dodatečně jsme naočkovali kontrolní (sgNT) a limit aktivující (sgLimit) B16 buňky do myší divokého typu C57/BL6. Jak se očekávalo, sgLimit (aktivace limitu) dramaticky snížil růst nádoru (obr. 3f). To bylo doprovázeno zvýšeným počtem T buněk infiltrujících nádor a aktivací (obr. 3g, h). Melanom B16 je relativně necitlivý model nádoru k blokádě PD-L123. V souladu s tím blokáda PD-L1 nedokázala kontrolovat růst nádoru sgNT B16 u myší. Je zajímavé, že limitní aktivace u nádoru B16 s odpovědí nádoru senzibilizovaného sgLimit na blokádu PD-L1, jak je ukázáno sníženou progresí nádoru (obr. 3i). Celkově limit potencuje nádorovou imunitu a senzibilizuje odpověď nádorové imunoterapie.

LIMIT cis-aktivuje GBP pro posílení MHC-I a nádorové imunity

Dále jsme zkoumali, jak LIMIT ovlivňuje MHC-I a nádorovou imunitu. LncRNA mohou lokálně regulovat expresi sousedních genů24. LIMIT je lokalizován blízko ke shluku genů, proteinům vázajícím guanylát (GBP), v lidských i myších genomech (rozšířená data obr. 2a, b). Zeptali jsme se, zda LIMIT může regulovat vyjadřování GBP. Umlčení LIMIT snížilo hladiny prekurzorových a zralých mRNA GBP (obr. 4a) a proteinů GBP1-5 (obr. 4b) v lidských buňkách A375 v reakci na léčbu IFN. Data naznačují, že LIMIT může podporovat transkripci GBP v cis. Na podporu této možnosti limit umlčení také snížil expresi Gbp2 v myších buňkách YUMM1.7 a CT26 (rozšířená data obr. 6a, b). Kromě toho aktivace limitu CRISPR indukovala expresi Gbp2 v buňkách B16 (obr. 4c). Abychom otestovali, zda LIMIT může trans-regulovat GBP, vynutili jsme expresi LIMIT cDNA do buněk A375. Zjistili jsme, že GBP1 a více imunitních faktorů (včetně IRF1, HLA-ABC a PD-L1) nebyly změněny nadměrnou expresí LIMIT (rozšířená data, obr. 6c). LIMIT je tedy cis-působící lncRNA schopná indukovat expresi GBP. Mezi členy rodiny Gbp je Gbp2 převládajícím členem rodiny Gbp v myších buňkách (rozšířená data obr. 6d). Abychom otestovali, zda LIMIT může regulovat MHC-I prostřednictvím GBP, vytvořili jsme stabilní buňky YUMM1.7 nesoucí šelak, shLimit, shGbp2 nebo shLimit plus shGbp2. Zjistili jsme, že v reakci na stimulaci IFN vedly shLimit a shGbp2 ke srovnatelnému snížení exprese Gbp2 a MHC-I; současné umlčení Limit a Gbp2 nedokázalo dodatečně změnit expresi Gbp2 a MHC-I (obr. 4d, e). Kromě toho jsme se zajímali, zda nadměrná exprese GBP může zachránit expresi MHC-I downregulovanou-MHC-I při omezení srážení nádorových buněk. Vynutili jsme expresi GBP1 v buňkách shLIMIT A375 (GBP1OE) a ošetřili jsme tyto buňky IFN. Pozorovali jsme, že shLIMIT vedl ke snížené expresi MHC-I v kontrolních buňkách, ale ne v buňkách GBP1OE (rozšířená data obr. 6e). Exprese PD-L1 a IRF1 nebyla ovlivněna shLIMIT nebo GBP1OE (rozšířená data, obr. 6e, f). Limit tedy může regulovat expresi MHC-I způsobem závislým na GBP. Dále jsme myším C57BL/6 naočkovali buňky YUMM1.7 s umlčením Limit a/nebo Gbp{56}}. Umlčení limitu a umlčení GBP podobně vedlo k rychlejšímu růstu nádoru ve srovnání s kontrolní skupinou, zatímco současné umlčení LIMIT a GBP dále neovlivnilo progresi nádoru (obr. 4f). Dále jsme detekovali pokles počtu T buněk infiltrujících nádor a aktivaci v nádorech shLimit, nádorech shGbp2 a nádorech shLimit plus shGbp2 (obr. 4g a rozšířená data obr. 6g). Společně LIMIT zvyšuje expresi MHC-I a nádorovou imunitu způsobem závislým na GBP. GBP jsou IFN-responzivní geny ve fibroblastech25 a makrofázích26 v kontextu obrany hostitele proti patogenům. Role GBP v imunitě proti rakovině však není známa. Vzhledem k tomu, že umlčení GBP snížilo expresi MHC-I a aktivaci CD8+ T buněk (obr. 4g a rozšířená data obr. 6g), předpokládali jsme, že GBP mohou ovlivnit účinnost imunoterapie rakoviny. Abychom tuto hypotézu otestovali, umlčeli jsme Gbp2 v buňkách MC38, nádorovém modelu citlivém na imunoterapii23. Jak se očekávalo, umlčení Gbp2 v buňkách MC38 snížilo expresi MHC-I po ošetření IFN (obr. 4h) a do značné míry zrušilo účinnost blokády PD-L1 (obr. 4i). To spolu s výše uvedenými údaji naznačuje zapojení LIMIT a GBP do kontroly účinnosti imunoterapie rakoviny. Na podporu této možnosti analýza klinických dat odhalila, že vysoké hladiny exprese GBP korelovaly s LIMIT, expresí MHC-I a imunoterapeutickou odpovědí (rozšířená data, obr. 6h-j) u pacientů s melanomem14-17. Kromě toho byly hladiny exprese GBP pozitivně spojeny s přežitím pacienta (rozšířená data obr. 6k). Abychom ověřili, zda jsou GBP geny reagující na IFN v rakovinných buňkách, stimulovali jsme buňky A375 pomocí IFN a dalších cytokinů. GBP byly indukovány IFN, ale byly minimálně ovlivněny jinými imunitními cytokiny (obr. 4j). Dále jsme použili systém CRISPR-Cas9 k zacílení sdílených sekvencí mezi GBP1-5 a vygenerovali GBP1-5 knockout (KO) buňky A375 (obr. 4k). Pozorovali jsme, že IFN špatně stimuloval transkripty genového aparátu MHC-I (obr. 41) a povrchové proteiny HLA-ABC v buňkách GBP KO A375 (obr. 4m). Proto LIMIT cis-aktivuje GBP pro posílení mechanismu MHC-I a nádorové imunity.

GBP aktivují HSF1 ke stimulaci MHC-I a nádorové imunity

Abychom demonstrovali, jak mohou GBP regulovat expresi MHC-I a nádorovou imunitu, vynutili jsme expresi GBP v buňkách A375. Je zajímavé, že nadměrná exprese GBP zvýšila expresi lidského MHC-I - jak ukazuje qRT-PCR (obr. 5a), barvení povrchu membrán (obr. 5b) a Western blotting (obr. 5c). Data naznačují, že GBP mohou aktivovat MHC-I na transkripční úrovni. V souladu s tím zvýšená exprese Gbp2 zvýšila expresi myšího MHC-I v buňkách YUMM1.7 a B16 (obr. 5d). Abychom identifikovali transkripční faktor (faktory), který reguluje MHC-I prostřednictvím GBP v reakci na IFN, provedli jsme bioinformatickou predikci s PROMO27. Našli jsme 8 transkripčních faktorů změněných IFN v buňkách A375, které mohou cílit na HLA-ABC, HSPA5, CALR a TAP1. Kromě několika dobře známých faktorů byla aktivita HSF1 vysoce indukována IFN (rozšířená data, obr. 7a). Zpracováním datových sad ChIP-seq v ENCODE28 jsme zjistili, že jak STAT1, tak HSF1 byly obohaceny o promotory genů asociovaných s MHC-I s různými vazebnými vzory (rozšířená data, obr. 7b). Provedli jsme ChIP test s anti-HSF1 protilátkou v IFN-stimulovaných A375 buňkách. HSF1 byl obohacen o promotory HLA-ABC, HSPA5, CALR a TAP1, ale ne o HPRT1, což je negativní kontrola (obr. 5e). Výsledky naznačují, že HSF1 je transkripční faktor pro MHC-I. HSF1 je obvykle aktivován přerušením proteostázy29. Abychom otestovali, zda aktivace HSF1 zvýší expresi MHC-I, ošetřili jsme buňky A375 seznamem stresorů30: tepelný šok, oxidační stres (Luperox), inhibitory translace (puromycin), proteazom (MG-132) a doprovod (17-AAG). Je zajímavé, že tyto stresory univerzálně stimulovaly expresi MHC-I - zatímco KRIBB11, inhibitor HSF1, tento účinek snižoval (obr. 5f a rozšířená data obr. 7c). Aktivace HSF1 tedy obecně indukuje expresi MHC-I. Dále jsme se zeptali, zda by GBP mohly aktivovat HSF1. Vynucená exprese GBPs indukovala luciferázovou aktivitu reportéru HSF1 HSE-Luc (obr. 5g), stejně jako fosforylaci HSF1 (obr. 5h). To naznačuje, že GBP by mohly aktivovat HSF1. IFN nedokázal vyvolat expresi HSPA5 v buňkách GBP-KO A375 (obr. 5i). IFN tedy aktivuje HSF1 indukcí exprese GBP. Kromě toho léčba KRIBB11, inhibitorem HSF1, zrušila upregulaci MHC-I zprostředkovanou nadměrnou expresí GBP1 (obr. 5j). GBP tedy stimulují expresi MHC-I způsobem závislým na HSF{78}}. Abychom upevnili mechanický vztah mezi GBP a HSF1, umlčeli jsme Gbp2 a/nebo Hsf1 v buňkách MC38 (obr. 5k). Po léčbě IFN umlčení Gbp2 nebo Hsf1 samotných snížilo expresi MHC-I, ale současné umlčení Gbp2 a Hsf1 nedokázalo dodatečně modulovat expresi MHC-I (obr. 51). Abychom demonstrovali funkční význam souhry mezi GBP a HSF1 v nádorové imunitě, naočkovali jsme nádorové buňky MC38 exprimující šelak, shGbp2, shHSF1 nebo shGbp2 plus shHSF1 do myší C57BL/6. Ve srovnání s kontrolami shFluc umlčení Gbp2 a umlčení Hsf1 srovnatelně zrychlilo růst nádoru (obr. 5m) a snížilo počet T buněk infiltrujících nádor a jejich aktivaci (obr. 5n a rozšířená data obr. 7d). Navíc současné umlčení Gbp2 a Hsf1 nedokázalo dále ovlivnit růst nádoru a T buňky infiltrující nádor (obr. 5m, n a rozšířená data obr. 7d). Celkově GBP stimulují expresi MHC-I a protinádorovou imunitu aktivací HSF1.

Osa LIMIT-GBP-HSF1 řídí MHC-I a nádorovou imunitu

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Dále jsme zkoumali, jak GBP aktivují HSF1 ke změně exprese MHC-I a nádorové imunity. Za normálních podmínek je monomerní HSF1 spojen a potlačován chaperony, jako je HSP9031. Přerušení jejich interakce umožňuje trimerizaci a akumulaci HSF1 v jádře, což vede k transkripční aktivaci jeho cílových genů32. Předpokládali jsme, že GBP mohou narušit spojení mezi HSP90 a HSF1, což vede k aktivaci HSF1. Abychom otestovali tuto možnost, ošetřili jsme buňky A375 IFN a provedli jsme Co-IP s protilátkou HSP90. Zjistili jsme, že endogenní GBP indukované IFN byly spojeny s HSP90 (obr. 6a). Kromě toho jsme transfekovali buňky A375 exogenním Flag-GBP1 a provedli jsme Co-IP experiment s Flag-protilátkou. HSP90 byl detekován v IP produktu z buněk transfekovaných Flag-GBP1, ale ne z kontrolních buněk transfekovaných vektorem (obr. 6b). Imunofluorescenční barvení ukázalo, že GBP a HSP90 byly z velké části lokalizovány v cytoplazmě (obr. 6c). Když jsme transfekovali buňky 293T se zvyšujícími se dávkami plasmidů GBP1, HSF1 asociovaný s HSP byl snížen způsobem závislým na dávce (obr. 6d). Data naznačují, že GBP interagovaly s HSP90 a tato interakce narušila spojení mezi HSF1 a HSP90. HSP90 je chaperon pro vícenásobné skládání proteinů a stabilitu, zpochybnili jsme, zda GBP mohou změnit chaperonovou aktivitu HSP90. I když inhibitor HSP90 potlačil expresi klientských proteinů HSP90 (jako je RAF1, BCL2 a CDK433), nadměrná exprese GBP to nedokázala (obr. 6e). GBP tedy interagují s HSP90 a uvolňují HSP90-sdružený HSF1, ale nemění aktivitu HSP90. Poté jsme přímo zkoumali roli HSF1 v expresi MHC-I. Buňky A375 jsme ošetřili IFN v přítomnosti inhibitoru HSF1 KRIBB11. Jak se očekávalo, léčba KRIBB11 snížila IFN-stimulovanou mRNA expresi genů souvisejících s MHC-I, včetně HLA-ABC, TAP1, HSPA5 a CALR, ale ne IRF1 (obr. 6f). Je zajímavé, že KRIBB11 snižoval IFN-indukovanou expresi MHC-I, ale měl minimální účinek na expresi PD-L1 (obr. 6g). HSF1 tedy může regulovat IFN-indukovanou expresi MHC-I bez změny globální signalizace IFN. Abychom zjistili, zda HSF1-regulovaný MHC-I byl funkční, kultivovali jsme B16-OVA s buňkami OT-I v přítomnosti KRIBB11 a IFN. KRIBB11 inhiboval IFN-indukovanou expresi MHC-I vázaného na OVA (rozšířená data, obr. 8a). V souladu s tím KRIBB11 také potlačoval OT-I buňkami zprostředkované cytotoxické účinky na B16-OVA (rozšířená data, obr. 8b). Abychom rozšířili naše pozorování na další nádory, umlčeli jsme Hsf1 pomocí shHsf1 v buňkách YUMM1.7 a CT26. Umlčení Hsf1 vedlo ke snížení exprese MHC-I v buňkách YUMM1.7 (obr. 6h, i) a CT26 (rozšířená data obr. 8c) v reakci na stimulaci IFN. V buňkách YUMM1.7 umlčení HSF1 neovlivnilo expresi Gbp2 v reakci na IFN (obr. 6h), což ukazuje, že Gbp2 není cílový gen HSF1. V buňkách shHsfl YUMM1.7 KRIBB11 nedokázal potlačit IFN-stimulovanou expresi MHC-I (rozšířená data obr. 8d). Data naznačují, že HSF1 zvýšil expresi MHC-I v reakci na IFN a Hsf1 je mechanistickým cílem KRIBB11 pro regulaci MHC-I. Vzhledem k tomu, že HSF1 ovlivnil expresi MHC-I, předpokládali jsme, že HSF1 reguluje protinádorovou imunitu in vivo. Abychom otestovali tuto hypotézu, naočkovali jsme kontrolní a nádorové buňky shHsf1 YUMM1.7 do myší NSG a C57BL/6. Pozorovali jsme, že umlčení HSF1 částečně zpomalilo progresi nádoru YUMM1.7 u myší NSG (obr. 6j), což podporuje, že Hsf1 pomohl udržet homeostázu proteinů a progresi nádoru v modelu s imunodeficiencí. Umlčení Hsf1 však dramaticky zrychlilo růst nádoru YUMM1.7 u myší C57BL/6 divokého typu (obr. 6k). Data naznačují, že Hsf1 může překvapivě podporovat silnou protinádorovou imunitu v imunokompetentním modelu. Na podporu tohoto zjištění jsme detekovali snížení procenta tumor-infiltrujících CD3+, Ki67+, IFN+ a TNF+ T buněk (obr. 6l a rozšířená data obr. 8e) v nádory shHsf1 YUMM1.7 ve srovnání s kontrolami shFluc scramble. Kromě toho jsme naočkovali buňky shHsf1 CT26 myším BALB/c divokého typu. Opět, umlčení Hsf1 vedlo ke zvýšenému růstu nádoru CT26 (rozšířená data obr. 8f). To bylo doprovázeno snížením procenta tumor-infiltrujících CD3+, Ki67+, IFN+ a TNF+ T buněk (rozšířená data, obr. 8g, h). Celkově data naznačují, že osa GBP-HSF1 řídí expresi MHC-I a protinádorovou imunitu. Pro mechanické propojení Hsf1 a LIMIT jsme umlčeli LIMIT v článcích A375. Umlčení LIMIT snížilo transkripční aktivitu HSF1 v reakci na IFN, jak bylo stanoveno luciferázovým reportérovým testem (HSE-luc) (obr. 6m). Údaje naznačují, že LIMIT přispívá k aktivaci HSF1 v reakci na IFN. Abychom otestovali potenciální zapojení HSF1 do indukce MHC-I zprostředkované LIMIT, stimulovali jsme LIMIT aktivací CRISPR v buňkách B16 v přítomnosti KRIBB11. Pozorovali jsme, že upregulace MHC-I, indukovaná LIMIT-aktivací, byla zrušena inhibitorem HSF1 (obr. 6n). Data naznačují, že LIMIT zvyšuje expresi MHC-I v závislosti na HSF{184}}. Nakonec jsme analyzovali vazbu mezi LIMIT, GBP a HSF1 v kontextu exprese MHC-I, nádorové imunity a imunoterapie u pacientů s rakovinou. Klinická analýza ukázala, že HSF1-signální geny korelovaly s expresí MHC-I, infiltrací CD8+ T buněk a přežitím pacientů (rozšířená data, obr. 9a-c). Ve studii blokády imunitního kontrolního bodu u pacientů s bazaliomem34 odhalila analýza jednobuněčné RNA sekvenování 2 shluky nádorů; jeden nádorový shluk byl citlivější na léčbu anti-PD{197}}, jak ukazuje značně snížená populace nádorů (rozšířená data, obr. 9d). Je zajímavé, že tento shluk nádorů citlivý na imunitní kontrolní bod exprimoval vyšší hladiny signálních genů HSF{199}}a také genový aparát MHC-I (rozšířená data, obr. 9e). Kromě toho ve studii blokády imunitního kontrolního bodu u pacientů s melanomem35 proteomická analýza prokázala, že proteinová exprese GBP, signálních genů HSF1 a MHC-I byla vyšší u klinických respondérů než u nereagujících (rozšířená data, obr. 9f). Kromě toho jsme pozorovali pozitivní korelaci mezi signálními geny GBP1 a HSF{208}}u lidských rakovin (rozšířená data, obr. 9g). Data podporují, že osa LIMIT-GBP-HSF1 může aktivovat expresi MHC-I a podporovat protinádorovou imunitu (rozšířená data, obr. 10).

Diskuse

Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová

Lidé mají 30,000-60,000 lncRNA. Identita a biologické funkce velké většiny těchto potenciálních lncRNA však zůstávají špatně pochopeny. V oblasti biologie rakoviny byly lncRNA z velké části studovány na imunodeficientním modelu, což zanechalo mezeru ve znalostech lncRNA v kontextu imunitního systému. Uvádí se, že hrstka lncRNA ovlivňuje funkci imunitních buněk36,37, progresi rakoviny a účinnost chemoterapie38,39. Zda se však specifické lncRNA účastní protinádorové imunity a imunoterapeutické odpovědi, zůstává nezodpovězeno. V této studii jsme identifikovali, že LIMIT je dříve necharakterizovaná lncRNA reagující na IFN v lidských i myších buňkách. LIMIT může indukovat expresi MHC-I a MHC-II, podporovat imunitní odpověď nádoru zprostředkovanou T buňkami a zvyšovat účinnost imunoterapie. LIMIT je tedy dříve neznámá nádorová imunogenní lncRNA. Signální dráha IFN hraje klíčovou roli při určování terapeutické odpovědi na imunoterapii rakoviny40 prostřednictvím mnoha mechanismů19,20,41,42. Genetické mutace v IFN signalizačních genech přispívají k rezistenci na blokádu kontrolních bodů u pacientů s rakovinou43-48. IFN signalizace však může indukovat inhibiční expresi PD-L149. Proto je ideální identifikovat a zaměřit se na klíčový IFN-signalizační gen, který selektivně zprostředkovává protinádorovou imunitu, spíše než únik proti nádorové imunitě. V souladu s touto představou prokazujeme, že LIMIT zprostředkovává upregulaci MHC-I a MHC-II, ale neovlivňuje expresi PD-L1 v reakci na IFN. LIMIT tedy může být jedinečně umístěn jako imunogenní cíl pro imunoterapii rakoviny. Bylo navrženo několik strategií pro terapeutické zacílení patogenních lncRNA50. Nicméně, jak zvýšit hladiny prospěšných lncRNA, zůstává náročné. Protože cis působící lncRNA fungují lokálně, nucená exprese těchto lncRNA nemusí být schopna přesné lokalizace51. Zatímco trans-působící lncRNA mohou fungovat prostřednictvím specifických sekundárních struktur, nadměrná exprese těchto lncRNA nemusí být schopna generovat jejich přirozené struktury kvůli chybějícím vhodným chaperonům RNA52. Pomocí RNA-řízené aktivační strategie CRISPR22 jsme přímo aktivovali expresi LIMIT v nádorových buňkách v preklinických modelech. Aktivace CRISPR LIMIT řízená RNA může řídit expresi MHC-I v nádoru a potencovat terapii blokádou kontrolních bodů. Vzhledem k tomu, že v lidských nádorech často dochází ke ztrátě podpisů genů MHC-I a IFN, navrhujeme, že aktivace prospěšných lncRNA CRISPR, jako je LIMIT, může zachránit expresi MHC-I v nádoru a být potenciálním terapeutickým přístupem. Při hledání mechanismu, kterým LIMIT ovlivňuje nádorovou imunitu, jsme objasnili, že LIMIT se zaměřuje na GBP cis způsobem. GBP hrají roli ve vrozené imunitě26,53,54. Myši, kterým chybí celý shluk Gbps, vykazují špatnou odpověď proti Toxoplasma gondii55. Před naší prací však nebyla mechanická souvislost mezi LIMIT a GBP a biologická funkce GBP v nádorové imunitě a imunoterapii stanovena. Zjistili jsme, že GBP jsou vyžadovány pro IFN-indukovanou nádorovou MHC-I expresi, účinnost zabíjení CD8+ T buněk a účinnou terapii kontrolních bodů. Data naznačují, že GBP jsou potenciální cílové geny pro posílení imunogenicity nádoru. Neočekávaně jsme odhalili, že GBP aktivují HSF1 pro stimulaci MHC-I a genové exprese související s MHC-I. Aktivace HSF1 zprostředkovaná inhibitory HSP90 koreluje s kontrolou nádoru v imunokompetentních modelech. Navzdory četným klinickým studiím s inhibitory HSP90 však dosud žádný z hodnocených inhibitorů HSP90 nebyl schválen FDA pro léčbu rakoviny. Tento neuspokojivý fakt zvyšuje možnost, že inhibitory HSP90 mohou být škodlivé pro nádorovou imunitu. Toxicita těchto inhibitorů HSP90 může podporovat destrukci několika klientských proteinů HSP90, jako jsou RAF1 a BCL2, které mohou být kritické pro proliferaci a přežití efektorových T buněk59,60. Vzhledem k tomu, že GBP interagují s HSP90 a uvolňují HSP90-navedený HSF1, ale nemění aktivitu HSP90, naše data naznačují, že cílení na GBP může být dříve nedoceněnou a bezpečnou strategií pro aktivaci HSF1 pro imunoterapii rakoviny. V souhrnu identifikujeme LIMIT jako dříve neznámou rakovinovou imunogenní lncRNA. Naše práce naznačuje, že zacílení na signální osu LIMIT-GBP-HSF1 může zachránit expresi a funkci MHC-I, což představuje slibný imunoterapeutický přístup proti rakovině.

Metody

Pokusy na zvířatech

Šest až osmitýdenní samice NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, skladové č. 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, skladové č. 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stock# 000651) a OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) myši byly získány z Jackson Laboratory. Všechny myši byly udržovány v podmínkách bez patogenů. Místnost pro zvířata má řízenou teplotu (18-23 stupňů), vlhkost (40-60 %) a cyklus 12 světlo/12 tma. Buňky YUMM1.7 (1 x 105), CT26 (1 x 105), MC38 (2,5 x 106) a B16 (1 x 105) byly subkutánně injikovány do pravého boku myší. Pro léčbu anti-PD-L1 v modelu MC38 bylo intraperitoneálně podáno 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) a kontrolní protilátka (InVivoMAb, LTF-2) ve dnech 6, 9, a 12 po inokulaci nádoru. Pro léčbu anti-PD-L1 v modelu B16 bylo intraperitoneálně podáno 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) a kontrolní protilátka (InVivoMAb, LTF-2) v den 0, 3, 6, 9, 12 a 15 po inokulaci nádoru. Průměry nádorů byly měřeny pomocí posuvného měřítka. Objem nádoru byl vypočten jako délka × šířka × šířka/2. Studie na zvířatech byly prováděny se souhlasem Institutional Animal Care and Use Committee na University of Michigan (PRO00008278). Studie je v souladu se všemi příslušnými etickými předpisy týkajícími se výzkumu na zvířatech. V žádném z experimentů nepřesáhla velikost nádoru xenoimplantátu 2 cm v jakýchkoli rozměrech a žádné zvíře nemělo závažnou abdominální distenzi (Větší nebo rovné 10 % původní tělesné hmotnosti). Velikost vzorku byla zvolena na základě předběžných údajů. Po inokulaci nádoru byly myši randomizovány a rozděleny do různých skupin pro léčbu.

Reagencie

KRIBB11 a 17-AAG byly zakoupeny od Cayman Chemical. MG-132, Puromycin a Luperox byly od Sigma-Aldrich. Rekombinantní lidský IFN (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) a myší IFN (485-MI) byly z R&D.

Plazmidy

Pro generování HSE-LUC byly syntetizovány sekvence DNA odpovídající elementům tepelného šoku (HSE), hybridizovány a ligovány do PGL3-základního (Promega) plazmidu. FLAG-HSF1 byl dar od Stuarta Calderwooda (Addgene #32537). Pro nucenou expresi lidského GBP1, GBP2, GBP5 a myšího Gbp2 byly příslušné kódující sekvence amplifikovány PCR z cDNA vytvořené z buněk A375 nebo B16 předem ošetřených IFN a následně vloženy do plazmidu PCI-Flag. Plazmid PCI-Flag byl připraven vložením následující Kozakovy sekvence plus Flag tag plus 5x glycinová sekvence do PCI-neo (Promega) plazmidu mezi Nhel a Xhol. Pro snížení lidského LIMIT a myšího LIMIT byly navrženy shRNA a vloženy do plazmidu PLKO.1 (Addgene #10879). shRNA cílená na luciferázu světlušek (shFluc) sloužila jako negativní kontrola. Pro zacílení promotorové oblasti Limit pro aktivaci CRISPR byly navrženy sgRNA (sgLimit) a vloženy do plazmidu phU6- sgRNA (Addgene #53188). Necílená sgRNA (sgNT) sloužila jako negativní kontrola. Pro odstranění vazebných míst STAT1/IRF1 v promotoru LIMIT byly navrženy spárované sgRNA (psgLIMIT) a vloženy do plazmidu PX459 (Addgene #48139). Pro knock down myší Hsfl a Gbp2 byly navrženy shRNA a vloženy do plazmidu PLKO.1 (Addgene #10879). Pro knockout GBP1-5 byla navržena sgRNA a vložena do plasmidu PX459 (Addgene #48139). Cílové sekvence jsou uvedeny v Doplňkové tabulce 7. Sekvence primerů jsou uvedeny v Doplňkové tabulce 8.

Buněčná kultura

Buněčná linie lidského melanomu A375 (CRL-1619), buněčné linie myšího melanomu, B16-F0 (CRL-6322) a YUMM1.7 (CRL-3362 ), myší buněčná linie rakoviny tlustého střeva CT26 (CRL-2638) a 293T (CRL-3216) byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC). Myší buněčná linie rakoviny tlustého střeva MC38 byla dříve použita v laboratoři Zou23,48. B16- OVA buňky byly založeny, jak bylo dříve popsáno42. V této studii byly vytvořeny buněčné linie s delecí promotoru A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO a A375 LIMIT. Všechny buněčné linie byly rutinně testovány na kontaminaci mykoplazmat a potvrzeny jako negativní na mykoplazma. Buňky byly kultivovány v RMPI médiu (Gibco #11875) doplněném 10% FBS, kromě buněk A375 a 293T, poslední 2 linie byly kultivovány v DMEM (Gibco #11965) doplněném 10% FBS. Všechny buňky byly udržovány při 37 stupních a 5 % CO2. Pro tepelný šok byly buňky umístěny do inkubátoru při 43 stupních a 5% CO2 na 2 hodiny. Pro vytvoření knockdown buněčných linií byly lentivirové částice produkovány transfekcí plazmidu PLKO.1 shRNA pomocí psPAX2 (Addgene #12260) a pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) do 293T buněk a následně transdukovány do nádoru buňky s polybrenem (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) přes noc. 48 hodin po transfekci byly buňky selektovány puromycinem (1-2 ug/ml) po dobu dalších 2 týdnů. Pro vytvoření knock-out buněčných linií byly plazmidy PX459- sgRNA transfekovány do nádorových buněk po dobu 2 dnů a selektovány puromycinem (1-2 ug/ml) po dobu dalších 2 dnů. Buňky pak byly sériově zředěny a nasazeny na 96jamkové destičky. Po 2-3 týdnech byly kolonie jednotlivých buněk disociovány a znovu umístěny na 6jamkové destičky. Po konfluenci buněk byla polovina buněk sklizena a validována na účinnost knock-out (KO) pomocí Western blotu. Pro aplikaci aktivačního systému CRISPR k aktivaci myšího limitu byly phU6-sgRNA transfekovány společně s SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) do buněk B16. Všechny transfekce byly provedeny s lipofektaminem 2000 (Thermofisher) v poměru 1 ug plazmidu: 2 ul transfekčního činidla. Transfekční dávka byla stanovena titrací.

Test luciferázové aktivity

Buňky A375 byly transfekovány HSE-LUC a PRL-SV40P (Addgene #27163) po dobu 24 hodin, společně s PCI-neo (vektor) nebo GBP1, GBP2 po dobu 48 hodin. Buňky A375 shFluc nebo A375 shLIMIT byly transfekovány HSE-LUC a PRL-SV40P (Addgene #27163) po dobu 24 hodin a poté ošetřeny IFN po dobu dalších 48 hodin. Luciferázová aktivita pro luciferázu světlušek (HSE-LUC) a renilla luciferázu (PRL-SV40P) byla měřena pomocí Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Relativní aktivita luciferázy světlušky byla normalizována aktivitou luciferázy renilla.

Povrchové barvení a analýza průtokovou cytometrií (FACS)

Buňky byly trypsinizovány a promyty MACS pufrem (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). Povrchové barvení bylo provedeno přidáním následujících protilátek k buněčné suspenzi v 50 ul MACS pufru: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) a anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Po inkubaci po dobu 30 minut byly buňky promyty pufrem MACS a analyzovány na průtokovém cytometru BD Fortessa.

Kvantitativní PCR (qPCR) analýza

Celková RNA byla izolována z buněk purifikací na koloně (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) s ošetřením DNázou. cDNA byla syntetizována pomocí RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) s náhodnými hexamerními primery. Kvantitativní PCR (qPCR) byla provedena na cDNA s použitím Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) na StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Genová exprese byla kvantifikována pomocí primerů uvedených v Doplňkové tabulce 8. Násobkové změny v expresi mRNA byly vypočteny metodou ACt s použitím ACTB jako endogenní kontroly. Výsledky jsou vyjádřeny jako násobek změny normalizací na kontroly.

Northern blotting

Analýza Northern blot byla provedena s 10 ug celkových RNA připravených z buněk A375 předem ošetřených IFN, IFN a TNF. RNA byly rozděleny denaturační elektroforézou na agarózovém gelu (Ambion) a přeneseny na membrány Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT byl detekován pomocí digoxinem značených DNA sond s DIG Northern Starter Kit (Roche). Sekvence sondy zacílené na LIMIT jsou uvedeny v doplňkové tabulce 7.

Rychlá amplifikace konců cDNA (RACE)

RACE byla provedena k identifikaci cDNA konců lidského LIMIT nebo myšího limitu pomocí SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Primery pro RACE jsou uvedeny v doplňkové tabulce 8.

Klon plné délky LIMIT

Po získání koncových sekvencí cDNA byl LIMIT plné délky amplifikován PCR a vložen do PCI-neo plazmidu mezi Xhol a Notl. Klonové primery pro lidský LIMIT a myší limit jsou uvedeny v doplňkové tabulce 8.

Frakcionace buněk pro RT-PCR

Buňky A375 předem ošetřené IFN byly odebrány z 15 cm destiček seškrabáním a jednou promyty studeným PBS. Buňky byly peletovány centrifugací při 700 g po dobu 5 minut a lyžovány hypotonickým lyzačním pufrem (10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 % (obj./obj.) NP{{ 12}}, 10 % (obj./obj.) glycerolu), aby se shromáždila cytoplazmatická frakce. Cytoplazmatická RNA byla získána precipitací ethanolem přes noc při -20 stupních s následnou reextrakci pomocí činidla TRIZOL. Zbývající jaderná peleta byla třikrát promyta hypotonickým lyzačním pufrem, následovala extrakce činidlem TRIZOL podle pokynů výrobce. RNA izolované z jaderných nebo cytoplazmatických frakcí byly reverzně transkribovány a RT-PCR pro LIMIT s uvedenými primery. Nestřižené nebo zralé ACTB byly použity jako kontroly pro jadernou nebo cytoplazmatickou RNA. Primery pro ACTB jsou uvedeny v doplňkové tabulce 8.

Western blotting

Buňky byly promyty studeným PBS a lyžovány v 1 x RIPA lyzačním pufru (Pierce) s 1 x inhibitorem proteázy (Pierce). Lyzáty byly inkubovány na ledu po dobu 10 minut a vyčištěny centrifugací při 15,000g po dobu 15 minut. Koncentrace proteinu byla kvantifikována pomocí soupravy pro stanovení proteinu BCA (Thermo Fisher). Třicet mikrogramů proteinu bylo smícháno se vzorkovým pufrem (Thermo Fisher) s -ME a denaturováno při 95 stupních po dobu 5 minut. Vzorek byl separován pomocí SDS-PAGE a přenesen na nitrocelulózovou membránu (Bio-Rad). Membrány byly blokovány 5 % w/v odtučněným sušeným mlékem a inkubovány s primárními protilátkami přes noc při 4 stupních a sekundárními protilátkami konjugovanými s HRP (CST) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Signál byl detekován pomocí Clarity a Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) a zachycen pomocí ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Protilátky byly následující: anti-lidské GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1:500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1:1,000), anti-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1: 1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1:1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1:1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1:1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1:1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1:1 ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1:1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1:1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1:1000) a anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1:5000). Pro humánní MHC-I Western blotting byly celkové buněčné lyzáty denaturovány ve vzorkovém pufru bez -ME (neredukující), aby se zachovaly disulfidové můstky a konformace proteinů, které mají být detekovány protilátkou anti-HLA-ABC (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1: 1 000).

Koimunoprecipitace (Co-IP)

Buňky byly shromážděny pomocí IP lyzačního pufru (Pierce, 87787) plus inhibitoru proteázy. Koncentrace proteinu byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení BCA proteinu. Vzorky 200-500 ug proteinu byly přidány k 1-3 ug primárním protilátkám anti-HSP90 (Proteintech, 13171) nebo anti-HSF1 (CST, 12972) a inkubovány za mírného kývání při 4 stupních přes noc. Poté byly vzorky dále inkubovány s 20 ul Protein A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc-2003) po dobu 2 hodin při 4 stupních; a centrifugováno při 7500 xg po dobu 30 sekund při 4 stupních. Buněčné pelety byly 4krát promyty IP lyzačním pufrem, resuspendovány s 40 ul 2x vzorkového pufru s -ME a zahřívány po dobu 5 minut na 95 stupňů. Vzorky denaturovaného proteinu byly analyzovány Western blotem. Pro Flag IP byly buněčné lyzáty inkubovány s 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 afinitního gelu (Sigma Aldrich) a promyty, denaturovány a analyzovány, jak je popsáno výše.

Imunofluorescenční barvení

Buňky A375 upevněné na krycích sklíčkách byly ošetřeny IFN po dobu 24 hodin. Po 2x promytí PBS byly buňky fixovány 4% PFA po dobu 15 minut a promyty 2x PBS po dobu 5 minut. Poté byly buňky permeabilizovány 0,5% tritonem x-100 v PBS po dobu 10 minut a promyty 2krát PBS po dobu 5 minut, každý. Antigeny byly blokovány 10% normálním kozím sérem v PBS po dobu 30 minut. Poté byly přidány primární protilátky v ředění 1:50 myší anti-lidské GBP1-5 protilátky (Santa Cruz, 166960) nebo králičí anti-lidské HSP90 protilátky (CST, 4877) a inkubovány při 4 stupních přes noc. Poté byly buňky promyty a inkubovány s ředěním 1:500 Qdot 605 značené sekundární kozí anti-myší protilátky (Thermo Fisher, Q11002) nebo AF488-značené sekundární kozí anti-králičí protilátky (Thermo Fisher, A11034), a poté upevněny na podložní sklíčka s činidlem ProLong Gold obsahujícím DAPI. Konfokální fluorescenční snímky byly shromážděny pomocí 63X objektivu s olejovou imerzí (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Chromatinová imunoprecipitace (ChIP)

ChIP byly provedeny se zesítěným chromatinem z buněk A375 ošetřených IFN a buď protilátkou HSF1 (CST, 12972) nebo normálním králičím IgG (CST, 2729), za použití sady Simple ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) (CST, 9005). Obohacená DNA byla kvantifikována pomocí PCR v reálném čase s použitím primerů uvedených v doplňkové tabulce 8. Množství imunoprecipitované DNA v každém vzorku bylo reprezentováno jako signál vzhledem k celkovému množství vstupního chromatinu, které je ekvivalentní 1.

Izolace OT-I buněk a společná kultivace s OVA+ nádorovými buňkami

Myši C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (JAX sklad #003831) byly zakoupeny od The Jackson Laboratory. Slezina byla homogenizována a jednotlivé buňky byly suspendovány ve 2 ml lyzačního pufru červených krvinek (Sigma-Aldrich) po dobu 1 minuty. Splenocyty byly peletovány, promyty a resuspendovány na 2 x 106 buněk na ml v kultivačním médiu RPMI obsahujícím 1 ug/ml OVA257-264 peptidu, 5 ug/ml myšího rekombinantního IL-2 a 40 μM { {15}} merkaptoethanol. Buňky byly inkubovány při 37 stupních po dobu 5 dnů. Pro nastavení společné kultivace nádorových buněk OT-I a OVA+ byly splenocyty odebrány po 5-denní aktivaci. OT-I buňky byly purifikovány pomocí EasySep mouse CD8+ T Cell Isolation Kit (Stemcell). B16-OVA buňky byly nasazeny přes noc. Buňky OT-I byly poté přidány do kultury v různých poměrech. Všechny buňky byly shromážděny trypsinizací a analyzovány průtokovou cytometrií (FACS).

Dendritické buňky derivované z kostní dřeně (BMDC) a makrofágy (BMDM)

Kostní dřeň byla izolována z myších femurů C57BL/6 a kultivována v kompletním médiu RPMI1640 s 20 ng/ml GM-CSF (R&D). Buňky byly inkubovány při 37 stupních a 5% CO2. V den 3 bylo přidáno dalších 10 ml média s 20 ng/ml GM-CSF. V den 7 byly neadherentní a volně adherentní buňky v supernatantu kultury sklizeny jemným promytím PBS a považovány za BMDC. Adherentní buňky byly považovány za BMDM.

Profilování intratumorálních imunitních buněk

Pro kvantifikaci intratumorálních T buněk a exprese efektorových cytokinů T buněk byly připraveny jednobuněčné suspenze z čerstvých nádorových tkání fyzickým průchodem přes 10}0 μm buněčná síta. Imunitní buňky byly obohaceny centrifugací v hustotním gradientu. Pro barvení cytokinů byly intratumorální imunitní buňky inkubovány v kultivačním médiu RPMI obsahujícím PMA (5 ng/ml), ionomycin (500 ng/ml), brefeldin A (1:1,000) a Monessen (1:1 ,000) při 37 stupních po dobu 4 hodin. 2-3 ul anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), protilátky anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) a anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) byly přidány na 20 minut pro povrchové barvení. Buňky byly poté promyty a resuspendovány v 1 ml čerstvě připraveného roztoku Fix/Perm (BD Biosciences) při 4 stupních přes noc. Po promytí pufrem Perm/Wash (BD Biosciences) byly buňky obarveny 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), a anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) po dobu 30 minut, promyty a fixovány ve 4% formaldehydu (Sigma Aldrich). Všechny vzorky byly odečteny na cytometru LSR Fortessa a analyzovány pomocí softwaru FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Výpočet skóre podpisu

Použili jsme normalizovanou expresi genů k definování následujících signatur: infiltrace CD8+ T lymfocytů (CD8A, CD8B, PRF1 a GZMB), exprese MHC-I (HLA-A, HLA-B a HLA-C) a HSF1 signalizace (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 a HSP90B1).

Statistická analýza

Pro experimenty založené na buňkách byly obecně provedeny biologické triplikáty v každém jednotlivém experimentu, pokud není uvedeno jinak. Pro studie na zvířatech bylo použito ne méně než 5 opakování na skupinu. Po inokulaci nádorových buněk byla zvířata náhodně rozdělena do různých skupin. Vyšetřovatelé nebyli zaslepeni k alokaci během experimentů a hodnocení výsledků. Data jsou uvedena jako průměrné hodnoty se standardní derivací. Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). K porovnání léčebných skupin s kontrolními skupinami byl použit dvoustranný 2-stranný t-test; Funkce přežití byla odhadnuta Kaplan-Meierovými metodami a k ​​výpočtu statistických rozdílů byl použit log-rank test.

Dostupnost dat

Data RNA-seq (GSE99299) a zpracovaná data jedné buňky (GSE123814) byla získána z Gene Expression Omnibus (GEO). MS proteomická data (PXD006003) byla získána z úložiště PRIDE. Soubory dat o rakovině TCGA byly získány z UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). Data RNA-seq a klinické informace pro klinické studie ICB byly poskytnuty příslušnými odpovídajícími autory. Všechna nezpracovaná data podporující zjištění této studie jsou na vyžádání k dispozici od odpovídajícího autora. Zdrojová data jsou uvedena v tomto dokumentu.

Dostupnost kódu

Všechny analýzy použité v této studii byly provedeny podle příruček Prism Graphpad verze 8.0 a online webových stránek na adrese http://xena.ucsc.edu/. Během této studie nebyly vyvinuty žádné nové kódy ani algoritmy.

Rozšířená data

Rozšířená data Obr. 1:

LIMIT koreluje s efektorovými imunitními geny napříč různými typy rakoviny.

Rozšířená data Obr. 2:

Genetické lokusy a sekvence lidského LIMIT a myšího Limitu.

Rozšířená data Obr. 3: LIMIT rozšiřuje výraz MHC-1

Rozšířená data Obr. 5:

LIMIT zvyšuje antigenem nabitou MHC-1 expresi in vivo.

Rozšířená data Obr. 6:

LIMIT cis-aktivuje GBP pro posílení MHC-1 a nádorové imunity.

Rozšířená data Obr. 7:

GBP aktivují HSF1, aby stimulovaly expresi MHC-I.

Rozšířená data Obr. 8:

HSF1 řídí expresi MHC-I a nádorovou imunitu.

Rozšířená data Obr. 9:

Signální geny HSF1 korelovaly s MHC-I a nádorovou imunitou.

Rozšířená data Obr. 10: Schéma ukazující, jak osa LIMIT-GBP-HSF1 ovlivňuje MHC-I a nádorovou imunitu

Doplňkový materiál

Doplňkový materiál naleznete ve webové verzi na PubMed Central.

Poděkování

Děkujeme členům laboratoře Zou za jejich intelektuální přínos. Tato práce byla částečně podpořena výzkumnými granty z grantů US NIH/NCI R01 (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) a (CA216919, CA213566 a 8MC, CA12HNI46 a 8 z Michigan Rogel Cancer Center Grant (CA46592).

Reference

1. Blokáda dráhy Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) a PD-1 pro léčbu rakoviny: Mechanismy, biomarkery odezvy a kombinace. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigeny v imunoterapii rakoviny. Science 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Antigeny MHC třídy I Garcia-Lora A, Algarra I & Garrido F, imunitní dohled a imunitní únik nádoru. J Cell Physiol 195, 346-355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC antigeny a malignita. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T Naléhavá potřeba obnovit MHC třídy I u rakoviny pro účinnou imunoterapii. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC a kol. Atlas lidských dlouhých nekódujících RNA s přesnými 5' konci. Nature 543, 199–204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Dlouhé nekódující RNA: vhled do funkcí. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Evoluce a funkce dlouhých nekódujících RNA. Cell 136, 629–641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Dlouhé nekódující RNA: funkční překvapení ze světa RNA. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT Dlouhé nekódující RNA: minulost, přítomnost a budoucnost. Genetics 193, 651–669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Dlouhé nekódující RNA v programování a přeprogramování buněčného osudu. Cell Stem Cell 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Vznikající role lncRNA u rakoviny. Nat Med 21, 1253-1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A a kol. Referenční anotace GENCODE pro lidský a myší genom. Nucleic Acids Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N a kol. Vývoj nádoru a mikroprostředí během imunoterapie nivolumabem. Cell 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W a kol. Genomické a transkriptomické rysy odpovědi na anti-PD-1 terapii u metastatického melanomu. Cell 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM a kol. Genomické koreláty odpovědi na blokádu CTLA-4 u metastatického melanomu. Science 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T a kol. Somatické mutace a neoepitopová homologie u melanomů léčených blokádou CTLA-4. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Systematické analýzy nového podpisu spojeného s lncRNA jako prognostického biomarkeru pro hepatocelulární karcinom. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH a kol. Demonstrace systému sledování nádorů závislého na interferonu gama u imunokompetentních myší. Proč Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Fruh K & Yang Y Prezentace antigenu MHC I. třídy a jeho regulace interferonem-gama. Curr Opin Immunol 11, 76-81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H a kol. B7-H1 související s nádorem podporuje apoptózu T-buněk: potenciální mechanismus imunitního úniku. Nat Med 8, 793-800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. Aktivace genu řízená RNA pomocí transkripčních faktorů založených na CRISPR-Cas9-. Nat Methods 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H a kol. Hostitelská exprese PD-L1 určuje účinnost regrese nádoru zprostředkované blokádou PD-L1 dráhy. J Clin Invest 128, 1708, doi: 10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q & Prasanth KV Nukleární dlouhé nekódující RNA: Klíčové regulátory genové exprese. Trends Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Interferonová indukce fibroblastových proteinů s vazebnou aktivitou guanylátu. J Biol Chem 258, 7746-7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH a kol. Interferonem indukované proteiny vázající guanylát v aktivaci zánětu a obraně hostitele. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X a kol. PROMO: detekce známých transkripčních regulačních prvků pomocí druhově přizpůsobeného vyhledávání. Bioinformatics 18, 333–334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Konsorcium, EP Integrovaná encyklopedie prvků DNA v lidském genomu. Nature 489, 57–74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Strážce proteostázy u rakoviny. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Malomolekulární aktivátory reakce tepelného šoku: chemické vlastnosti, molekulární cíle a terapeutický příslib. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Represe aktivace transkripčního faktoru tepelného šoku HSF1 pomocí HSP90 (komplex HSP90), který tvoří komplex citlivý na stres s HSF1. Cell 94, 471-480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Regulace faktoru tepelného šoku u savců 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 a hlídání rakoviny. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE a kol. Klonální náhrada nádorově specifických T buněk po blokádě PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M a kol. Proteomika melanomové odpovědi na imunoterapii odhaluje mitochondriální závislost. Cell 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA Dlouhé nekódující RNA v regulaci imunitní odpovědi. Trends Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA dlouhé nekódující RNA v regulaci imunitní odpovědi a trénované imunitě. Přední Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY Dlouhé nekódující RNA v rakovinových drahách. Cancer Cell 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT a kol. LncRNA GClnc1 podporuje karcinogenezi žaludku a může fungovat jako modulární lešení komplexů WDR5 a KAT2A pro specifikaci vzoru modifikace histonů. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Primární, adaptivní a získaná rezistence na imunoterapii rakoviny. Cell 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D a kol. Epigenetické umlčení chemokinů typu TH1- formuje nádorovou imunitu a imunoterapii. Nature 527, 249–253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W a kol. CD8(+) T buňky regulují nádorovou feroptózu během imunoterapie rakoviny. Nature 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J a kol. Ztráta genů dráhy IFN-gama v nádorových buňkách jako mechanismus rezistence na anti-CTLA-4 terapii. Cell 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. Mutace spojené se získanou rezistencí vůči PD-1 blokádě u melanomu. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT a kol. In vivo screening CRISPR identifikuje Ptpn2 jako cíl imunoterapie rakoviny. Nature 547, 413–418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS et al. Primární rezistence vůči blokádě PD-1 zprostředkovaná mutacemi JAK1/2. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A a kol. Získaná rezistence na IFNgama zhoršuje protinádorovou imunitu a vede ke vzniku melanomových lézí rezistentních na T lymfocyty. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J a kol. Epigenetické řidičské mutace v ARID1A formují imunitní fenotyp rakoviny a imunoterapii. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL a kol. Signalizace nádorového interferonu reguluje program multigenní rezistence k blokádě kontrolního bodu imunity. Cell 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​Terapeutické cílení dlouhých nekódujících RNA u rakoviny. Trends Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Regulace genové exprese cis-působícími dlouhými nekódujícími RNA. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Výzvy a perspektivy pro strukturální biologii lncRNA – příklad Xist lncRNA A – opakování. J Mol Cell Biol 11, 845-859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR a kol. GBP5 podporuje sestavení zánětu NLRP3 a imunitu u savců. Science 336, 481–485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Proteiny vázající guanylát indukované interferonem: Strážci obrany hostitele ve zdraví a nemoci. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M a kol. Shluk interferonem-gama-indukovatelných p65 GTPáz hraje kritickou roli v obraně hostitele proti Toxoplasma gondii. Imunita 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM a kol. Inhibice HSP90 zvyšuje imunoterapii rakoviny zvýšením regulace genů odezvy na interferon. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF Targeting Heat-Shock Protein 90 (HSP90) jako doplňková strategie k blokádě kontrolních bodů imunity pro léčbu rakoviny. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A a kol. Klinické hodnocení a profilování biomarkerů inhibitorů Hsp90. Methods Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J a kol. Nadměrná exprese Bcl-2 zvyšuje přežití T-buněk specifických pro nádor. Cancer Res 65, 2001–2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H a kol. Raf-1 je vyžadován pro produkci IL2 T-buněk. EMBO J 12, 4367-4373 (1993). [PubMed: 8223446]